本发明涉及一种酶法拆分制备(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸的新方法。
背景技术：
(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸(1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline-3-carboxylicacid)是一种重要的药物中间体，被广泛应用于多种有机小分子药物以及肽基药物的合成。例如，(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸是降压药喹那普利的重要组成部分(diversity-orientedsynthesisofmedicinallyimportant1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline-3-carboxylicacid(tic)derivativesandhigheranalogs[j].orgbiomolchem,2014,12(45):9054-91.)。此外，(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸可用于合成含有四氢异喹啉母核的小分子拮抗剂，作用于趋化因子受体cxcr4，从而有望用于治疗hiv等疾病(discoveryoftetrahydroisoquinoline-basedcxcr4antagonists[j].acsmedchemlett,2013,4(11):1025-30.)。
现有技术中，制备光学纯(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸的方法有化学手性合成和生物催化动力学拆分两种。研究人员最初利用pictet-spengler反应制备光学纯(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸，以l-苯丙氨酸为原料，在浓酸与高温条件下，与甲醛缩合生成目标产物，该法工艺相对简单，但生成的产物会发生部分消旋化。随后，bischler-nepieralski反应，[2 2 2]环加成方法等也被用于制备(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸及其衍生物，该类方法路线较复杂，成本高(diversity-orientedsynthesisofmedicinallyimportant1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline-3-carboxylicacid(tic)derivativesandhigheranalogs[j].orgbiomolchem,2014,12(45):9054-91.)。近年来，kurata等通过臭氧分解、氧化及去保护作用三步不对成合成(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸(synthesisofopticallypure(r)-and(s)-tetrahydroisoquinoline-1-and-3-carboxylicacids[j].synthesis,2015,47(09):1238-44.)。该法产率低，步骤较多，不易于工业化应用。龚等利用化学酶法制备(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸即以外消旋苯丙氨酸为原料,经pictet-spengler反应合成外消旋1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸，然后经酯化作用、脂肪酶动力学拆分制备(s)-构型产物。23.8g外消旋酯盐酸盐(0.1mol)，脂肪酶和底物质量比为0.2，反应48h，产物ee>99％，收率为49.1％。该法所得产物立体选择性高，工艺相对简单(化学酶法合成光学纯(s)-1,2,3,4-四氢喹啉-3-羧酸的研究[j].现代化工,2003,23(12):23-5.)。
目前存在的工艺中，尚没有直接利用酶法动力学拆分外消旋1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸制备(s)-构型产物的方法。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种新的制备(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸的方法。该方法具有反应条件温和、立体选择性强、反应效率高、工艺相对简单等特点，具有工业化应用前景。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
一种酶法拆分制备(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸(i)的方法，
所述方法包括：
(1)以1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸的外消旋体或1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸盐的外消旋体为底物，利用离体的d-氨基酸氧化酶或胞内表达d-氨基酸氧化酶的细胞作为催化剂，选择性催化(r)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸进行氧化脱氢反应，而(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸未反应，保留在反应体系中；
(2)将所述(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸与反应体系分离。
进一步地，所述1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸盐可以为1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸的碱金属盐或铵盐等，具体例如1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸钠、1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸钾、1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸铵。
根据本发明，所述d-氨基酸氧化酶优选为选自如下d-氨基酸氧化酶中的一种或多种的组合：来源于三角酵母(trigonopsisvariabilis)cbs4095的d-氨基酸氧化酶或其突变体或与其氨基酸序列同源性大于80％的其它d-氨基酸氧化酶、来自禾谷镰刀菌(fusariumgraminearum)cs3005的d-氨基酸氧化酶或其突变体或与其氨基酸序列同源性大于80％(优选大于85％，更优选大于90％，进一步优选大于95％)的其它d-氨基酸氧化酶、来自梨孢镰刀菌(fusariumpoae)2516的d-氨基酸氧化酶或其突变体或与其氨基酸序列同源性大于80％(优选大于85％，更优选大于90％，进一步优选大于95％)的其它d-氨基酸氧化酶，来自茄病镰刀菌(fusariumsolani)m-0718的d-氨基酸氧化酶或其突变体或与其氨基酸序列同源性大于80％(优选大于85％，更优选大于90％，进一步优选大于95％)的其它d-氨基酸氧化酶。
进一步优选地，所述d-氨基酸氧化酶具有如seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3或seqidno.4所示的氨基酸序列。
作为本发明的一种优选实施方案：所述细胞为表达d-氨基酸氧化酶的工程菌。所述工程菌例如是宿主细胞为e.colibl21(de3)的工程菌。
具体地，所述工程菌含有表达载体pet-28a( )，所述d-氨基酸氧化酶基因连接在表达载体pet-28a( )上。
进一步地，步骤(1)中，首先构建反应体系，然后控制反应体系处于设定温度和有氧环境中进行所述氧化脱氢反应，其中所述反应体系包含所述底物、ph缓冲溶液和/或ph调节剂以及所述催化剂。
优选地，步骤(1)中，所述反应体系中，起始底物的浓度为1～20g/l，反应体系的ph值为6～9；所述的催化剂为含有所述离体的d-氨基酸氧化酶的粗酶液或者纯酶或者固定化酶或胞内表达d-氨基酸氧化酶的细胞；所述设定温度为20～70℃。
优选地，所述催化剂采用含有离体的d-氨基酸氧化酶和黄素腺嘌呤二核苷酸的粗酶液。
根据本发明的一个方面，所述催化剂的添加量以8000rpm离心10min后的湿细胞重计，所述细胞的添加量一般为反应体系重量的1～5％。
优选地，步骤(1)中，所述设定温度为30～50℃，所述反应体系的ph值为7～8。
优选地，步骤(1)中，所述反应体系中含有辅酶黄素腺嘌呤二核苷酸(fad)。使氧化脱氢反应在fad存在下进行，有助于进一步提高反应收率。进一步地，fad与所述的底物等当量或者是过量的。一般情况下，所制备的d-氨基酸氧化酶的粗酶液中已经含有足够量的fad，在直接采用粗酶液的情况下，无需再另外添加fad。在使用d-氨基酸氧化酶纯酶的情况下，可以根据需要再外加适量的fad。
根据本发明的一个具体且优选方面，所述ph缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液。
根据本发明的又一个具体且优选方面，所述的ph调节剂为20wt％～35wt％氨水。
进一步地，步骤(2)中，将反应体系的ph值调至5.0-6.0，加热使蛋白变性析出，抽滤，滤液浓缩后，冷却析晶，干燥，即得(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸。
由于以上技术方案的实施，本发明与现有技术相比具有如下有益效果：
本发明意外发现d-氨基酸氧化酶可高效选择性催化(r)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸进行氧化脱氢反应，而对于(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸基本无催化作用。采用本发明方法来制备(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸，反应条件温和，反应效率及收率高，立体选择性强(ee值>99％)，工艺简单。
附图说明
图1为实施例3中反应体系中0小时取样的高效液相检测图谱，其中，保留时间8.673min为(r)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸；保留时间10.969min为(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸；
图2为实施例3中反应体系中反应24小时取样的高效液相检测图谱。
具体实施方式
本发明提供一种制备(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸的新方法，以外消旋1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸(或氨盐)为底物，利用离体的d-氨基酸氧化酶或胞内表达d-氨基酸氧化酶的细胞作为催化剂，进行氧化脱氢反应，获得(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸。
具体原理为：以外消旋1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸(如式ii所示)为底物，利用d-氨基酸氧化酶立体选择性催化(r)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸发生氧化脱氢反应生成相应的亚胺酸(如式iii所示)，(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸(如式i所示)未被催化而保留在反应体系中。反应过程示意如下：
进一步地，优选使反应在辅酶黄素腺嘌呤二核苷酸(fad)存在下进行，在催化过程中，辅酶黄素腺嘌呤二核苷酸(fad)被还原为fadh2，随后，一分子氧被还原为过氧化氢(h2o2)，而fadh2则被氧化为fad，反应过程示意如下：
根据本发明，d-氨基酸氧化酶的引入可以通过加入离体的酶或胞内表达d-氨基酸氧化酶的细胞来实现。离体的酶可以是粗酶液形式、纯酶，或者固定化酶，没有限制。胞内表达d-氨基酸氧化酶的细胞，具体可以是表达重组酶的工程菌静息细胞。
根据本发明的一个优选方面，所述d-氨基酸氧化酶来源于三角酵母、禾谷镰刀菌、梨孢镰刀菌、茄病镰刀菌等，具体地，d-氨基酸氧化酶可以是来源于三角酵母(trigonopsisvariabilis)cbs4095、禾谷镰刀菌(fusariumgraminearum)cs3005、梨孢镰刀菌(fusariumpoae)2516或茄病镰刀菌(fusariumsolani)m-0718的d-氨基酸氧化酶。
根据本发明的又一优选方面，胞内表达d-氨基酸氧化酶的细胞为表达d-氨基酸氧化酶的工程菌。在一个优选实施方式中，该工程菌的宿主细胞为e.colibl21(de3)。具体地，所述工程菌含有表达载体pet-28a( )，所述d-氨基酸氧化酶基因连接在表达载体pet-28a( )上。
根据本发明的一个具体方面，利用表达d-氨基酸氧化酶的工程菌获得重组d-氨基酸氧化酶，用作催化剂。
根据本发明的一个优选方面，催化体系中底物外消旋1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸的浓度为1～20g/l。
根据本发明的一个优选方面，催化体系中，催化剂的添加量以8000rpm离心10min后的细胞湿重计，所述细胞的添加量为反应液重量的1～5％。
根据本发明的一个优选方面，催化体系中，反应的温度为20～70℃，时间为6～72小时，反应液的ph值为6～9；更优选地，反应的温度为30～50℃，时间为12～48小时。
优选地，采用磷酸缓冲溶液控制反应的ph值为7～8。
以下结合具体实施例对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。
本发明实施例中的实验方法如无特别说明均为常规方法。
本发明实施例中所用基因由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。e.colibl21(de3)菌种购自novagen公司。基因克隆及表达具体操作可参见j.萨姆布鲁克等编的《分子克隆实验指南》。
本发明通过高效液相色谱(hplc)分析催化反应的各个产物和底物。外消旋1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸的hplc分析方法为：
实施例1d-氨基酸氧化酶的筛选及表达d-氨基酸氧化酶的基因工程菌的构建
根据底物特异性的不同，微生物来源的d-氨基酸氧化酶可分为两大类:1)偏好侧链基团较小的氨基酸(如d-丙氨酸)，如尖孢镰刀菌(fusariumoxysporum)来源的daao；2)偏好侧链基团较大的氨基酸(如d-苯丙氨酸)，如三角酵母(trigonopsisvariabilis)来源的daao(pollegionil,mollag,sacchis,etal.propertiesandapplicationsofmicrobiald-aminoacidoxidases:currentstateandperspectives[j].applmicrobiolbiotechnol,2008,78(1):1-16.)。分别将这两种d-氨基酸氧化酶的氨基酸序列在美国国立生物技术信息中心(ncbi)数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中进行blastp分析，选取序列一致性不同的4种d-氨基酸氧化酶作进一步研究(如表1所示)。
表1四种不同来源的d-氨基酸氧化酶
将上述d-氨基酸氧化酶基因序列经密码子优化后送生工生物工程(上海)股份有限公司进行全基因合成，并克隆到重组表达质粒pet-28a( )上。重组质粒转入表达宿主e.colibl21(de3)中，经测序验证无误后，向所得工程菌菌液中加入终浓度为25％的甘油并置于-80℃保藏备用。
实施例2
2.1微生物的培养
液体lb培养基组成：蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，nacl10g/l，用去离子水溶解后定容，121℃灭菌20min，待用。若为固体lb培养基，则另加15g/l琼脂。
将按照实施例1方法构建的含有d-氨基酸氧化酶基因的工程菌接种于5ml液体lb(含50μg/ml卡那霉素)培养基中，37℃，200rpm振荡培养8h左右。按1％(v/v)的接种量接种于50ml液体lb(含50μg/ml卡那霉素)培养基中培养，od600达到0.6-0.8后，加入诱导剂iptg(终浓度为0.1mm)，18℃诱导15h。培养结束后，将培养液倒入100ml离心管中4000rpm离心10min，弃上清，收集菌体细胞，用50mm磷酸缓冲液(ph8.0)洗涤细胞两次，之后，放于-80℃超低温冰箱中保存，待用。
2.2粗酶液的制备
将菌体重悬于50mm磷酸缓冲液(ph8.0)中，超声破碎菌悬液，离心后得到的上清为含d-氨基酸氧化酶的粗酶液。
2.3hplc法检测反应体系中各对映体含量
反应体系(1ml)：10g/le1、e2、e3、e4湿菌体(超声波破碎)，2g/l底物外消旋1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸，反应介质为ph8.0磷酸盐缓冲液。将配好的反应体系置于30℃金属浴振荡反应器内反应120min。磷酸盐缓冲液(ph8.0)代替粗酶液的反应体系作为对照。样品经流动相稀释10倍后用hplc进行定性分析。
结果表明：与对照相比，编号为e1、e2、e3以及e4的d-氨基酸氧化酶能够立体选择性催化(r)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸反应，而(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸含量基本保持不变。
实施例3fsdaao拆分制备(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸
底物溶液的配制：用50mm的磷酸盐缓冲溶液(ph＝8.0)配置5g/l的外消旋1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸溶液并用30％氨水调节溶液ph值至8.0。
在5ml反应管中加入1.6ml底物溶液，0.4mlfsdaao粗酶液(粗酶液中已含有足量辅酶fad，因此，粗酶液反应体系中不需额外添加fad)。混匀后，取出50μl，作为“0小时”并进行hplc分析。将反应管置于30℃恒温水浴中，磁力搅拌，反应24小时。反应结束后用hplc法检测反应体系中1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸两种构型的含量。
检测结果如图2所示，fsdaao表现出严格的r-构型立体选择性，转化率为49.9％(转化率＝[(初始外消旋底物的浓度(g/l)-残余的底物浓度(g/l))/初始外消旋底物的浓度(g/l)]×100％)，(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸的ee值达99％以上。
实施例4fgdaao拆分制备(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸
按实施例3的方法配制底物溶液。
在5ml反应管中加入0.8ml底物溶液，1.2mlfgdaao粗酶液(粗酶液中已含有足量辅酶fad，因此，粗酶液反应体系中不需额外添加fad)。混匀后，取出50μl，作为“0小时”并进行hplc分析。将反应管置于30℃恒温水浴中，磁力搅拌，反应30小时。反应结束后用hplc法检测反应体系中1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸两种构型的含量。检测结果为：转化率49.8％(计算公式如实施例3所示)，(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸的ee值达99％以上。
实施例5fpdaao拆分制备(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸
按实施例3的方法配制底物溶液。
在5ml反应管中加入0.4ml底物溶液，1.6mlfpdaao粗酶液(粗酶液中已含有足量辅酶fad，因此，粗酶液反应体系中不需额外添加fad)。混匀后，取出50μl，作为“0小时”并进行hplc分析。将反应管置于30℃恒温水浴中，磁力搅拌，反应24小时。反应结束后用hplc法检测反应体系中1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸两种构型的含量。检测结果为：转化率为49.9％(计算公式如实施例3所示)，(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸的ee值达99％以上。
实施例6tvdaao拆分制备(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸
按实施例3的方法配制底物溶液。
在5ml反应管中加入0.8ml底物溶液，1.2mltvdaao粗酶液(粗酶液中已含有足量辅酶fad，因此，粗酶液反应体系中不需额外添加fad)。混匀后，取出50μl，作为“0小时”并进行hplc分析。将反应管置于30℃恒温水浴中，磁力搅拌，反应25小时。反应结束后用hplc法检测反应体系中1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸两种构型的含量。检测结果为：转化率为49.9％(计算公式如实施例3所示)，(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸的ee值达99％以上。
实施例7纯酶fsdaao拆分制备(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸
按实施例3的方法配制底物溶液。
取1.6ml底物溶液加入到5ml反应管中，再加入fsdaao纯酶液(经镍柱亲和层析纯化获得)以及黄素腺嘌呤二核苷酸钠盐(fad)，并用磷酸盐缓冲溶液(50mm,ph＝8.0)将反应总体积补到2ml，(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸的终浓度为4g/l，fsdaao纯酶的终浓度为0.1mg/ml，fad终浓度为100μm。混匀后，取出50μl，作为“0小时”并进行hplc分析。将反应管置于30℃恒温水浴中，磁力搅拌，反应24小时。反应结束后用hplc法检测反应体系中1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸两种构型的含量，转化率为50％(计算公式如实施例3所示)，(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸的ee值达99％以上。
实施例8fsdaao制备(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸
底物溶液的配制：用50mm的磷酸盐缓冲溶液(ph＝8.0)配置5g/l的外消旋1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸溶液并用5m氢氧化钠溶液调节底物溶液ph值至8.0。
在5ml反应管中加入1.6ml底物溶液，0.4mlfsdaao粗酶液(粗酶液中已含有足量辅酶fad，因此，粗酶液反应体系中不需额外添加fad)。混匀后，取出50μl，作为“0小时”并进行hplc分析。将反应管置于30℃恒温水浴中，磁力搅拌，反应24小时。反应结束后用hplc法检测反应体系中1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸两种构型的含量。检测结果为：转化率为49.9％(计算公式如实施例3所示)，(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸的ee值达99％以上。
实施例9fsdaao大反应体系制备(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸
底物溶液的配制：用去离子水配置4g/l的外消旋1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸溶液并用30％氨水调节溶液ph值至8.0。
向反应器中加入200ml底物溶液，20mlfsdaao粗酶液。混匀后，置于30℃恒温水浴中，磁力搅拌，反应30小时。反应结束后，将反应体系的ph值调至5.0-6.0。99℃水浴，待蛋白变性析出后，抽滤。取滤液于65℃条件下旋蒸，将反应体积浓缩10倍。置于冰上，冷却后，抽滤。将析出的白色晶体，小心刮下，置于烘箱中，烘干并称重。称取0.01g白色烘干晶体，用去离子水定容至10ml。高效液相色谱检测所取样品中1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸两种构型的含量。转化率为49.9％(计算公式如实施例3所示)，(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸的ee值达99％以上，分离产率为85％(分离产率＝实际分离得到的产物的量(mg)/理论的产物的量(mg)×100％)。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>苏州同力生物医药有限公司
<120>一种酶法拆分制备(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸的方法
<160>4
<170>siposequencelisting1.0
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355
1.一种酶法拆分制备(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸(i)的方法，
所述方法包括：
(1)以1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸的外消旋体或1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸盐的外消旋体为底物，利用离体的d-氨基酸氧化酶或胞内表达d-氨基酸氧化酶的细胞作为催化剂，选择性催化(r)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸进行氧化脱氢反应，而(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸未反应，保留在反应体系中；
(2)将所述(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸与反应体系分离。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸盐为1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸的碱金属盐或铵盐。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述d-氨基酸氧化酶为选自如下d-氨基酸氧化酶中的一种或多种的组合：来源于三角酵母(trigonopsisvariabilis)cbs4095的d-氨基酸氧化酶或其突变体或与其氨基酸序列同源性大于80％的其它d-氨基酸氧化酶、来自禾谷镰刀菌(fusariumgraminearum)cs3005的d-氨基酸氧化酶或其突变体或与其氨基酸序列同源性大于80％的其它d-氨基酸氧化酶、来自梨孢镰刀菌(fusariumpoae)2516的d-氨基酸氧化酶或其突变体或与其氨基酸序列同源性大于80％的其它d-氨基酸氧化酶，来自茄病镰刀菌(fusariumsolani)m-0718的d-氨基酸氧化酶或其突变体或与其氨基酸序列同源性大于80％的其它d-氨基酸氧化酶。
4.如权利要求1或3所述的方法，其特征在于，所述细胞为表达d-氨基酸氧化酶的工程菌，所述工程菌的宿主细胞为e.colibl21(de3)。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述工程菌含有表达载体pet-28a( )，所述d-氨基酸氧化酶基因连接在表达载体pet-28a( )上。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，首先构建反应体系，然后控制反应体系处于设定温度和有氧环境中进行所述氧化脱氢反应，其中所述反应体系包含所述底物、ph缓冲溶液和/或ph调节剂以及所述催化剂。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述反应体系中，起始底物的浓度为1～20g/l，反应体系的ph值为6～9；所述的催化剂为含有所述离体的d-氨基酸氧化酶的粗酶液或者纯酶或者固定化酶或胞内表达d-氨基酸氧化酶的细胞；所述设定温度为20～70℃。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述设定温度为30～50℃，所述反应体系的ph值为7～8。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述催化剂采用含有离体的d-氨基酸氧化酶和黄素腺嘌呤二核苷酸的粗酶液。
10.如权利要求1或6所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，使所述氧化脱氢反应在辅酶黄素腺嘌呤二核苷酸存在下进行。
技术总结