本发明属于病原菌致病性鉴定技术领域，具体涉及核盘菌致病性强弱的大批量筛选的方法以及植物抗病性早期大批量筛选的方法。
背景技术：
菌核病是由核盘菌(sclerotiniasclerotiorum(lib.)debary)侵染引起的真菌性病害，该病原菌寄主范围十分广泛，可寄生75个科278个属400多种植物，包括豆类(大豆、豌豆和菜豆)和油料(油菜、向日葵和花生)等重要的双子叶作物，每年在世界范围内造成巨大的经济损失。菌核病是我国油菜主产区最主要的病害，核盘菌对油菜叶片、茎秆、花、角果都能侵染，但危害最大的部位为成株期茎秆，造成茎秆腐烂，因此也称油菜茎腐病。该病害每年导致油菜产量损失10%～20%，发病严重的大田产量损失可达80%。目前全国年产约1400万吨油菜籽，如果按产量损失10%来计算，每年仅菌核病引起的直接经济损失达70亿元左右。该病害还导致油菜种子含油量降低、脂肪酸组分发生变化，严重影响菜籽油的品质。生产上控制油菜菌核病危害的措施包括栽培管理、化学及生物防治和种植抗病品种等。由于该病原菌寄主众多，其菌核在环境中生命力顽强，栽培管理防治效果有限。采用化学及生物防治方法一方面增加了生产成本，容易造成环境污染;另一方面由于对菌核病发病时期把握不准和使用方法不当而影响使用效果。实践证明，培育抗(耐)病油菜品种是防治油菜菌核病最为经济有效的途径。然而，现有的油菜品种及其近缘种中缺乏有效抗源，导致油菜抗菌核病育种进展缓慢。因此，亟需对油菜与核盘菌互作的分子机理进行深入研究，继而创制抗菌核病的油菜新种质。
由于核盘菌的严重危害性，早在20世纪60年代，核盘菌的致病性研究就引起了人们的关注。1965年，就报道了草酸和多聚半乳糖醛酸酶在核盘菌致病过程中的作用（batemandfandbeersv.simultaneousproductionandsynergisticactionofoxalicacidandpolygalacturonaseduringpathogenesisbysclerotiniarolfsii[j].phytopathology,1965,55:204-211.）。其后，科学家们先后研究了核盘菌细胞壁降解酶类的作用机理。另有专家学者对核盘菌的致病性分化、种群分布等进行研究（juniorcgl,gomesev,juniorml.geneticdiversityandmycelialcompatibilitygroupsoftheplant-pathogenicfungussclerotiniasclerotioruminbrazil[j].geneticsandmolecularresearch,2011,10(2):868-877.）。随着研究的不断深入，人们对核盘菌的致病机理有了更深刻的了解。最近相关研究报道对核盘菌致病对草酸的依赖性提出质疑（liangxf,libertid，lim，etal．oxaloacetateacetylhydrolasegenemutantsofsclerotiniasclerotiorumdonotaccumulateoxalicacid，butdoproducelimitedlesionsonhostplants［j］．molplantpathol，2015，16(6):559－571．）因此，xu等提出草酸本身并非核盘菌必需的致病因子，而是其提供的酸性ph，该理论被称为ph依赖理论(xuls，liugq，jiangdh，etal.sclerotiniasclerotiorum:anevaluationofvirulencetheories［j］．annurevphytopathol，2018，56:15．1－15.28.)越来越多的研究发现核盘菌的致病并非那么简单，它还拥有其他很多重要的致病因子。zhu等发现分泌蛋白ssitl能抑制寄主的抗病反应，推测ssitl可能是核盘菌的效应子，发现分泌蛋白ss－caf1是核盘菌重要的致病因子，其与侵染时附着胞及菌核的形成有关，还能与寄主的某些未知蛋白互作，诱导寄主细胞死亡。(derbyshirem，denton－gilesm，hegedusd，etal．thecompletegenomesequenceofthephytopathogenicfungussclerotiniasclerotiorumrevealsinsightsintothegenomearchitectureofbroadhostrangepathogens［j］．genomebiolevol，2017，9(3):593－618；yuy，xiaojf，zhuwj，etal．ss－rhs1，asecretoryrhsrepeat－containingprotein，isrequiredforthevirulenceofsclerotiniasclerotiorum［j］．molplantpathol，2017，18(8):1052－1061．yu等（yuy，xiaojf，zhuwj，etal．ss－rhs1，asecretoryrhsrepeat－containingprotein，isrequiredforthevirulenceofsclerotiniasclerotiorum［j］．molplantpathol，2017，18(8):1052－1061.）发现分泌蛋白ss－rhs1对核盘菌的致病力、附着胞的形成以及菌核的形成都有着重要作用。yang等（yanggg，tanglg，gongyd，etal.acerato-plataninproteinsscp1targetsplantpｒ1andcontributestovirulenceofsclerotiniasclerotiorum［j］．newphytol，2018，217(2):739－755．）发现分泌蛋白sscp1可在寄主植物的质外体与抗病蛋白pr1互作，降低pr1对核盘菌菌丝的抑制作用，从而利于核盘菌侵染；同时，高浓度的sscp1可引起寄主细胞坏死，利于获取营养物质。核盘菌的致病过程异常复杂和精细，并非由单一的致病因子介导，目前尚未找到关键的致病因子。人们对核盘菌致病原因已经有了一定的认识和了解，但是对于核盘菌整个致病信号途径以及与植物互作机理研究尚不清楚。通常，在植物上我们都是通过正向遗传学的方法来筛选鉴定基因，对于核盘菌来说我们也可以借用此办法。因此，建立一个快速鉴定核盘菌致病性的体系对后续研究来说很有必要。目前大部分用来研究病原菌致病性的方法都比较繁琐，并且操作较为复杂，耗时较长，还需要进行大量的数据统计，所以就病原菌致病性层面开发出一种可以快速对核盘菌致病性强弱进行鉴定的技术是亟待解决的。
病害是危害农业生产的重要因素之一,植物病害的发生往往会造成大范围的粮食减产。因此,防止作物病害的大规模发生对于保障粮食安全具有重要意义。培育抗病品种是抵御作物病害的最为经济、环保的手段之一。寄主植物抵抗病原物侵染和为害的遗传性状。抗病性的表现，是在一定的环境条件影响下寄主植物的抗病性基因和病原物的致病基因相互作用的结果，是由长期的进化过程所形成；植物的抗病性是相对的。在寄主和病原物相互作用中抗病性表现的程度有阶梯性差异，可以表现为轻度抗病、中度抗病、高度抗病或完全免疫。因此，评价植物的抗病性，筛选出抗病性强的植物品种已经成为目前科研和生产中亟待解决的问题，而找到一种行之有效、能准确快速的鉴定植物抗病性的方法是解决这个问题的技术关键。
众所周知，植物抗病性属于植物抗逆性（朱雯雯.植物抗逆性的研究进展[j].种子科技,2017,35(07):133-135.）的一种。由于病原菌种类的不同，植物抗病又分为抗真菌（王成,陈勇辉,刘田田,叶若松.真菌激活蛋白对农作物影响的研究进展[j].湖南农业科学,2018(08):128-130.），抗细菌（赵开军,李岩强,王春连,高英.植物天然免疫性研究进展及其对作物抗病育种的可能影响[j].作物学报,2011,37(06):935-942.），抗卵菌（张美祥.卵菌胞内效应子研究进展[j].南京农业大学学报,2018,41(01):18-25.）等。植物对病原物的抗性是一个很复杂的生命现象。目前人们认识到植物的抗病过程有很多基因和一些相互关联的信号传导途径参与（杨红玉,李湘,杨家曙.拟南芥在植物抗病性分子机制研究中的作用[j].中国农学通报,2006(05):358-364.）。对于植物抗病基因（刘云飞,万红建,李志邈,叶青静,王荣青,阮美颖,姚祝平,周国治,韦艳萍,杨悦俭.植物nbs-lrr抗病基因的结构、功能、进化起源及其应用[j].分子植物育种,2014,12(02):377-389.禹阳,贾赵东,马佩勇,郭小丁,谢一芝,边小峰.wrky转录因子在植物抗病反应中的功能研究进展[j].分子植物育种,2018,16(21):7009-7020.张晓娟.油菜抗病基因同源序列克隆与分析[j/ol].分子植物育种:1-8.田远飞,薛永来,付为国,戴志聪,杜道林.植物抗病基因结构和功能研究进展[j].广东农业科学,2012,39(22):155-159.尹玲,方辉,黄羽,卢江,曲俊杰.植物tir-nb-lrr类型抗病基因各结构域的研究进展[j].广西植物,2017,37(02):186-190.），抗性蛋白（liangkong,xufangqiu,jiangangkang,yangwang,hanchen,jiehuang,minqiu,yaozhao,guanghuikong,zhenchuanma,yanwang,wenwuye,董莎萌,wenboma,王源超.植物疫病菌调节寄主组蛋白乙酰化并重塑寄主抗病基因表达的致病机制[j].科学新闻,2018(04):110.闫佳,刘雅琼,侯岁稳.植物抗病蛋白研究进展[j].植物学报,2018,53(02):250-263.），抗病相关激素（旷永洁,柳浪,严芳,任斌,闫大琦,张大伟,林宏辉,周焕斌.水稻与病原物互作中植物激素功能的研究进展[j].生物技术通报,2018,34(02):74-86.李冬月,原文霞,郑超,王栩鸣,周洁,严成其,陈剑平.bzip转录因子在植物激素介导的抗病抗逆途径中的作用[j].浙江农业学报,2017,29(01):168-175.）以及它们之间互相形成的相关信号传导途径，人们已经有了一定的认识和了解，但是对于植物响应病原菌的信号分子以及植物整个抗病途径并没有探究完全，还有很长的路要走。通常，我们都是通过正向遗传学的方法来筛选鉴定基因，因此，建立一个快速筛选植物抗病性的体系对后续研究来说很有必要。目前大部分用来研究植物抗病的方法都比较繁琐，并且操作较为复杂，耗时较长，还需要进行大量的数据统计，所以就植物抗病性层面开发出一种可以快速对植物抗病性强弱进行鉴定的技术是亟待解决的。
技术实现要素：
本发明提供了一种快速、大批量筛选不致病核盘菌突变体，鉴定或者辅助鉴定病原菌致病性强弱的方法及其在核盘菌与植物互作研究中的应用，本发明具有简单易行、准确性高、检测效率高、成本低廉、安全可靠、结果简单明了等优点。
核盘菌经典的侵染循环路径主要是菌核在土壤、染病茎杆或种子中越冬、越夏，当外界环境适宜时，菌核可萌发产生菌丝或子囊孢子。子囊孢子成熟后从子囊中弹出，借气流传播，飘落到植株的叶片或花瓣上，在营养和环境条件适宜时萌发形成菌丝，侵入植物体，使植物受侵部位的细胞、组织坏死，形成水渍状病斑并腐烂，再漫延到其他健康植株，最后在患病部位尤其是茎杆中形成菌核。对油菜而言，其菌核病的发病符合这个过程（图1）。核盘菌在油菜花期来临前萌发，通过产生子囊孢子附着在油菜花瓣，继而以花瓣为营养基质生长萌发产生菌丝，菌丝再随着花瓣的凋零飘落到油菜的叶片或茎杆上，开始实现对油菜的侵染。
植物有两大先天免疫系统:pti(病原分子相关模式引发的免疫反应)和效应蛋白引发的免疫反应(effector－triggeredimmunity，eti)。其中r基因介导的eti往往能赋予作物对一些活体或者半活体营养型菌极强的抗病性，从而在作物抗病育种中得到广泛且有效的利用，然而对死体营养型病原菌往往是无效的。植物对寄主广泛的死体营养型菌(broadhost-rangenecrotrophs)的抗性更为复杂。一般来说，数量抗性是植物对这类死体营养型菌抗性利用的主要形式。多数研究认为pti是产生这一数量抗性的主要根源。虽然对核盘菌是属于死体营养型菌还是半活体营养型菌仍然存在争议，但可以肯定的是，死体营养是核盘菌的主要生活方式。一般认为eti产生的过敏性细胞死亡在一定程度上更有利于核盘菌这类病原菌的生长。因此我们认为，pti赋予寄主对核盘菌的抗病性。植物通过pti途径抑制了核盘菌的进一步增殖，侵染所造成的病斑大小可以直接反应病原菌致病性的强弱。本发明就是以此为依据，提供了一种快速且可大批量筛选非致病核盘菌突变体的方法，此方法同时可以用于核盘菌致病能力强弱的鉴定。同时，本发明还提供一种利用核盘菌对植物叶片进行侵染，根据侵染面积来判断的早期快速鉴定植物抗病性的检测方法。该方法同时可以用于植物抗病能力强弱的鉴定或植物抗性基因的辅助筛选，为后续的基因筛选提供可靠的依据，结果客观、准确性高，抗病性评判依据直观、简洁明了，在植物幼苗时期便可快速鉴定，可做到快速简洁，方便排除大量非抗性植物，省时省力；方法易于操作，可重复性好，适用于大批量的筛选，可用于指导植物（如油菜）抗病性的育种和油料安全生产。不仅节约生产成本而且大大提高选择效率，进而加快植物育种进程。
本发明提供的技术方案是：一种快速鉴定核盘菌突变体致病性强弱的方法，分别以待鉴定核盘菌突变体和野生型对油麦菜叶片进行侵染，将待鉴定核盘菌造成的植物的侵染面积与野生型核盘菌造成的侵染面积进行比较，来判断所待鉴定核盘菌突变体致病性强弱。
所述的方法，用于侵染的叶片为油麦菜幼嫩叶片。
所述的方法，用于侵染时的所述菌种是在pda培养基上，24℃条件下培养两天，挑取菌生长边缘3㎜处菌丝进行接种。
所述的方法，用打孔器打取菌丝；接种时，叶片为离体培养，且将所述菌种接至叶片背面；接种后，将叶片置于光照培养室中，24℃下16小时光照8小时黑暗处理培养，24℃恒温培养48小时。
所述的方法，肉眼观测侵染面积判断，或者拍照后用imagej软件测量具体面积比较来判断。
同时，本发明还提供一种早期快速鉴定植物抗病性的检测方法，该方法以待鉴定的植物为模板，利用核盘菌对其叶片进行侵染，根据侵染面积来判断。
所述的检测方法，所述植物是单子叶植物或双子叶植物；用于侵染的叶片为3-4叶期的叶片。
所述的检测方法，用于侵染时的所述菌种是在pda培养基上，24℃条件下培养两天，挑取菌生长边缘3㎜处菌丝进行接种；用打孔器打取菌丝，以确保获取相同的菌丝面积；接菌时，叶片为离体培养，且将所述菌种接至叶片背面；接种后，将叶片置于光照培养室中，16小时长日照，24℃恒温培养48小时。
所述的检测方法，采用感病的野生型作为阳性对照；已确定的抗病品种作为阴性对照。
所述的检测方法，对油菜而言，阴性对照是油菜用湘油15，对拟南芥而言，阴性对照是哥伦比亚型。
所述的检测方法，肉眼观测侵染面积判断，或者拍照后用imagej软件测量具体面积比较来判断。
本发明具有以下优点:
本发明所用鉴定植物为油麦菜，相较于其他植物来说，更易获得、侵染效果明显，结果易于观察。本发明所用鉴定菌种为核盘菌，是一种对植物具有广谱致病性的真菌。相较于其他真菌、细菌来说，更易获得、致病性更强且致病性更加广泛。本发明与其他病原菌致病性检测方法和其他植物抗病性检测方法相比，本发明具有简单易行、准确性高、检测效率高、成本低廉、安全可靠、结果简单明了等优点。
1.准确性高：与以往的抗病性筛选方法相比，该检测方法克服实验结果不稳定、重复性差等问题。
2.检测效率高：本发明用于检测的整体耗时更短，操作过程简单易学，同时可以用于大批量的筛选。
3.成本低廉：本研究所用所有试剂价格都比较低，没有任何昂贵的实验试剂。
4.安全可靠：本研究所用侵染方法为离体密封培养，相较于其他活体接种方法污染性更小。
5.结果易于观测：其他检测抗病性的结果检测需要大量的计数统计，本发明的结果相对而言更易观测和测量。
附图说明
图1核盘菌的侵染过程图；
图2侵染前；
图3侵染48h后；
图4抗病植株筛选结果，阴性对照：已确定的抗病品种；阳性对照：湘油15；其余为待鉴定品种。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1
核盘菌的侵染过程如图1所示。利用本发明方法，对未确定是否具有致病能力以及致病能力强弱的核盘菌突变体进行鉴定。以野生型核盘菌为阳性对照，最终通过对比侵染面积的大小，来确定未知突变体是否致病，为后续致病基因、致病蛋白的鉴定以及后续核盘菌与植物互作途径的研究提供可靠依据。具体方法步骤如下：
1.菌种的活化：将核盘菌（sclerotiniasclerotiorum）（可购买市售核盘菌，例如bncc172448核盘菌）菌核（野生型核盘菌从试验田中获得）从4℃冰箱取出，挑取菌核于2ml离心管中，加入消毒液进行清洗，将次离心管放到漩涡震荡仪上震荡3分钟后，弃掉消毒液，加入无菌水，震荡重悬，重复上述步骤3次后吸掉上清，将菌核挑出接至pda培养基中央，24℃静置培养3天。
2.菌种的培养：待菌丝长至培养基中央时，沿菌落外缘用灭菌的打孔器切取1块直径为5mm的菌丝块,移至新pda培养基平板中央,在24℃培养箱内培养2d,然后同样再次转接到新的pda平板。
3.叶片的侵染与培养：剪取油麦菜幼嫩叶片，无菌水冲洗擦干后，转至托盘中，前期将托盘中铺上3层吸水专用滤纸，倒入400ml蒸馏水，赶出气泡使纸面平整。将叶片平铺于托盘中湿润的滤纸上，叶片背面朝上，用灭菌后的打孔器挑取培养两天后离菌丝边缘3mm处菌种，接至植物叶片中央，叶脉两侧对应位置接种两个不同的突变体，叶脉同侧上下两个为统一突变体的重复。接种后盖上透明托盘盖，用不透气胶带将其密封，24℃下16小时光照8小时黑暗处理培养48小时。核盘菌侵染前请参见图2，侵染48h后请参见图3。
4.侵染面积的测量：通常情况下，肉眼观测侵染面积即可，也可拍照后用imagej软件测量具体面积。我们按照侵染面积将致病性分为四个等级（ⅰ＜1cm2；1cm2≤ⅱ＜2cm2；2cm2≤ⅲ＜3cm2；4cm2≤ⅳ），其中第四级为最高级，致病性最强。得出具体数值后可根据具体需要来进行下一步的差异性分析。
实验结果如图所示，根据待鉴定突变体和阳性对照造成的侵染面积，可以明显看出待鉴定的突变体之间差异显著，图3中根据致病等级已举例标出（面积分别为0.3626cm2，1.7823cm2，2.2712cm2，4.6598cm2），可以进行下一步的研究。
实施例2
利用本发明方法，对未确定是否具有抗病能力的油菜品种进行鉴定。以湘油15为阳性对照，已知的抗病品种中油821为阴性对照，最终通过对比侵染面积的大小，来确定未知品种是否抗病，为后续抗病基因、抗病蛋白的鉴定提供可靠依据。具体方法步骤如下：
1.菌种的活化：将核盘菌（sclerotiniasclerotiorum）（可购买市售核盘菌，例如bncc172448核盘菌）平板从4℃冰箱取出，挑取菌核于2ml离心管中，加入消毒液进行清洗，将次离心管放到漩涡震荡仪上震荡3分钟后，弃掉消毒液，加入无菌水，震荡重悬，重复上述步骤3次后吸掉上清，将菌核挑出接至pda培养基中央，24℃静置培养4天。
2.菌种的培养：待菌丝长至培养基中央时，沿菌落外缘用灭菌的打孔器切取1块直径为5mm的菌丝块,移至新pda培养基平板中央,在24℃培养箱内培养2d,然后同样再次转接到新的pda平板。
3.叶片的侵染与培养：剪取油菜幼嫩叶片，无菌水冲洗擦干后，转至托盘中，前期将托盘中铺上3层吸水专用滤纸，倒入400ml蒸馏水，赶出气泡使纸面平整。将叶片平铺于托盘中湿润的滤纸上，叶片背面朝上，用灭菌后的打孔器挑取培养两天后离菌丝边缘3mm处菌种，接至植物叶片中央，叶脉两侧对应位置接种两个以做对照。接种后盖上透明托盘盖，用不透气胶带将其密封，24℃下16小时光照8小时黑暗处理培养48小时。
4.侵染面积的测量：通常情况下，肉眼观测侵染面积即可，也可拍照后用imagej软件测量具体面积。得出具体数值后可根据具体需要来进行下一步的差异性分析。
实验结果如图4所示，根据阴性和阳性对照的侵染面积，可以明显看出待鉴定的油菜品种之间差异显著，箭头标出的为具有抗性的油菜品种，可以进行下一步的研究。我们按照病斑面积将植物抗病性分为四个等级（ⅰ＜1cm2；1cm2≤ⅱ＜2cm2；2cm2≤ⅲ＜3cm2；3cm2≤ⅳ），其中第一级为最高级，抗病性最强。得出具体数值后可根据具体需要来进行下一步的差异性分析。
1.一种快速鉴定核盘菌突变体致病性强弱的方法，分别以待鉴定核盘菌突变体和野生型对油麦菜叶片进行侵染，将待鉴定核盘菌造成的植物的侵染面积与野生型核盘菌造成的侵染面积进行比较，来判断所待鉴定核盘菌突变体致病性强弱。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：用于侵染的叶片为油麦菜幼嫩叶片；用于侵染时的所述菌种是在pda培养基上，24℃条件下培养两天，挑取菌生长边缘3㎜处菌丝进行接种。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：用打孔器打取菌丝；接菌时，叶片为离体培养，且将所述菌种接至叶片背面；接种后，将叶片置于光照培养室中，24℃下16小时光照8小时黑暗处理培养，24℃恒温培养48小时。
4.如权利要求1至3任一项所述的方法，其特征在于，肉眼观测侵染面积判断，或者拍照后用imagej软件测量具体面积比较来判断。
5.一种早期快速鉴定植物抗病性的检测方法，其特征在于：以待鉴定的植物为模板，利用核盘菌对其叶片进行侵染，根据侵染面积来判断。
6.如权利要求5所述的检测方法，其特征在于：所述植物是单子叶植物或双子叶植物；用于侵染的叶片为3-4叶期的叶片。
7.如权利要求6所述方法，其特征在于：用于侵染时的所述菌种是在pda培养基上，24℃条件下培养两天，挑取菌生长边缘3㎜处菌丝进行接种；用打孔器打取菌丝，以确保获取相同的菌丝面积；接菌时，叶片为离体培养，且将所述菌种接至叶片背面；接种后，将叶片置于光照培养室中，16小时长日照，24℃恒温培养48小时。
8.如权利要求5至7任一项所述的方法，其特征在于，采用感病的野生型作为阳性对照；已确定的抗病品种作为阴性对照。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，对油菜而言，阴性对照是油菜用湘油15，对拟南芥而言，阴性对照是哥伦比亚型。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，肉眼观测侵染面积判断，或者拍照后用imagej软件测量具体面积比较来判断。
技术总结