本申请是申请日为2014年4月3日，发明名称为“通过生长测量的质谱法抗药性测定”的中国专利申请no.2014800399560的分案申请。
本发明涉及一种使用质谱法测定微生物对抗生素的抗药性的方法。
定义
本文使用单位“道尔顿”(da)，而非规定的“统一的原子质量单位”(u)，da单位添加于“国际计量局”的“国际单位制(si)”文件的上一版(第八版，2006年)中，与统一的原子质量单位处于同等地位；如已注意到的，这主要是为了能够使用单位千道尔顿、毫道尔顿和类似单位。
虽然在优选为3,000至15,000道尔顿的质量范围内，一般将蛋白质称为“多肽”更为确切，但为了简单起见，本文只使用“蛋白质”一词。从较轻的多肽到较重的蛋白质的转变并不固定，没有明确的定义。
术语“微生物(microbes)”在本文中通常用作“微生物(microorganisms)”的简称。一般而言，单数形式的微生物(microbe)还表示微生物物种以及单个微生物细胞。复数形式的微生物(microbes)表示待分析的多个微生物细胞。
背景技术：
目前，可通过质谱法在误差率较低的情况下快速鉴定多种微生物，特别是细菌和单细胞真菌(例如酵母)。鉴定方法一般是计算破碎(裂解)微生物(特别是其可溶性蛋白)的质谱与已知微生物的相似类型的参考质谱之间的相似度值。如果相似度值超过特定极限值，则可鉴定科、属、种甚至株系。在许多大规模研究中以及在微生物实验室的日常工作中，这种速度很快、成本低廉的微生物鉴定方法经证明非常成功。根据仪器，同时可以鉴定48至384个微生物样本；从菌落培养结束到鉴定只需几分钟即可完成。该方法的错误率非常低，远低于传统微生物鉴定方法的错误率，甚至低于dna分析的错误率。市面上有的质谱仪、相关评估程序和参考谱库已被认证为可用于医疗诊断的ivd产品，符合德国医疗设备法(mpg)及其他国家或国际法规和准则。
通常按照一般说法，术语“抗生素”是指用于治疗微生物感染性疾病的药理学活性物质，也指消毒物质。青霉素的成功导致寻找和发现了许多其他抗生素。广谱抗生素对许多微生物科均起效，而窄谱抗生素特异性地对单一微生物种起效。
自从首次使用青霉素作为药理学活性物质以来，微生物株系对各种抗生素逐渐产生各种抗药性，或从其他微生物获得抗药性，即获得使得它们能够削弱抗生素物质的效果、或使其彻底失效的特性。而遗憾的是，抗药性非常普遍，现在医院中的微生物大多具有抗药性。某些情况下，可以预测在医院内传播的微生物对医院常用抗生素的抗药性，但这并不适用于在医院外发生的感染。
成功治疗微生物感染(如脓毒血症等急性情况、或已有原发疾病(或原发感染)期间的二次感染通常威胁生命)一般取决于抗生素首次用药是有效的。针对性用药不仅要求尽可能快速、正确地鉴定病原体，而且要求尽快确定其对不同抗生素的抗药性。测定抗药性的常规方法包括在有抗生素的条件下进行培养，但遗憾的是，这需要很长时间：24至48小时。
除了在有抗生素的条件下培养之外，还可采用遗传学方法测定抗药性。在此方法中，通过检测待测病原体的基因组中的已知抗药性基因来检测抗药性。遗传学方法的优点在于，可通过例如聚合酶链式反应(pcr)等技术扩增抗药性基因，因此分析所需时间不再由细菌生长速率来决定。缺点是此方法比常规方法更加昂贵，而且不是功能测试。抗药性基因可能存在，但不表达，这意味着待研究的细菌株系没有抗药性，但遗传学方法将其检测为有抗药性。
专利de102006021493b4(v.m.govorun和j.franzen，2006年，对应于gb2438066b和us8,293,496b2；下称“govorun”)公布了用质谱法测定微生物抗药性的方法。
在一个实施方案中，例如，在添加和不加抗生素的基体中培养后，使用质谱测量微生物的蛋白质分布曲线并进行比较。例如，在具有和没有抗生素的离心管中培养微生物。培养后，将微生物离心滤出并冲洗，然后在离心管中用酸和乙腈破碎，从而释放其可溶性蛋白。在样本支持物上制备少量(约一微升)这种含有破碎微生物细胞的液体，干燥，然后用少量基质溶液(也是约一微升)包被。将溶解的蛋白质包埋入干燥过程中产生的基质晶体。在质谱仪中使用激光脉冲轰击含有基质结晶和包埋蛋白质的样本，使蛋白质分子的离子在蒸发离子体中形成。在飞行时间质谱仪中测量它们的飞行时间，生成基本上由蛋白质峰构成的微生物质谱。
通过两种质谱之间的相似度，只能得出微生物抗药性的有限结论。如果敏微生物只是被抑制生长或杀死，但未被破坏(例如属于肠杆菌科的克雷伯氏菌)，那么所得质谱与无抗生素基体中微生物的质谱几乎完全相同。这是因为，使用基质辅助激光解吸电离(maldi)法获得的质谱只略微依赖于样本中的微生物数量。用一万个微生物制备的样本和用一千万个微生物制备的样本几乎产生完全相同的质谱，这对于微生物鉴定是理想的，但不适合抗药性鉴定。如果只是微生物生长停止，那么也会产生相同的质谱，因为只是微生物数量的不同并不会在质谱中显示出来。
如govorun专利进一步说明的，向待研究的微生物添加第二种微生物也可鉴定抗药性；该第二种微生物会产生非常不同的质谱、有抗药性、且在有抗生素的条件下肯定会继续生长。具有两种微生物哦叠加蛋白质的质谱会显示生长差异。遗憾的是，出于各种原因，已经证明这种方法在日常工作中并不可行；它假设对所用微生物进行至少粗略的定量测定、在所用培养基中生长速率基本相等，并且假设参考微生物对许多抗生素都有抗药性。
要测定抗药性的微生物优选以充分纯化的形式足量存在。例如，它们可在琼脂上形成菌落，或者也可以作为血液培养基中的微生物存在。对于琼脂培养基，通常使用不只一个菌落中的微生物进行测试，而是使用至少五个菌落中的微生物一起测试，以确定同种非抗药性微生物中是否存在抗药性微生物。训练有素、经验丰富的实验室技术人员通常能够识别同种微生物的菌落并收集它们。之后它们必须经过混合和分离以进行培养。血液培养基天然含有在感染中传播的不同微生物的混合物。
一般来说，在抗药性测定(包括按照govorun的方法)之前通常对在琼脂培养基上或血液培养基中生长的微生物进行鉴定。在此，特别是对govorun的方法而言，知道微生物物种及其生长速率是有帮助的。同时知道这种微生物可对何种抗生素产生抗药性通常也是有帮助的。此外，通常还知道敏感微生物的最低抑制浓度(mic)。这意味着可以制备含有浓度合适的这些抗生素的培养基；对于govorun方法，最短培养时间由已知的生长速率给出。
鉴于上述内容，有必要提供一种可以测定微生物对一种或多种抗生素的抗药性的质谱法，并且此方法具有可信性、成本低、高度自动化、最重要的是高速等优点，特别是对生长迅速因而在约一小时内就会变得非常危险的病原体而言。优选的是，所述方法可以使用也用于微生物的质谱鉴定的相同常规质谱仪来实施。
技术实现要素：
本发明提供一种用于质谱测定微生物抗药性的方法，其中在含有抗生素的基体中培养微生物，在培养所述微生物之后采集所述微生物的质谱mscum。根据本发明的方法的特征在于，通过添加参考物质来测定在培养期间出现的任何微生物生长，所述参考物质按剂量添加并且也在质谱mscum中测量(共测)，其中微生物生长则表示对抗生素有抗药性。可以通过在培养后使用质谱测定微生物的数量，然后将此数量与在培养前对应测定的微生物数量和/或在无抗生素培养后对应测定的微生物数量进行比较，来确定微生物生长。
第一优选实施方案包括在培养后通过质谱mscum测定所述微生物的数量，如果所述微生物的数量超过指定的极限值，则将所述微生物视为具有抗药性。在此，有利的是在开始培养时将微生物的数量标准化。
第二优选实施方案包括在不含抗生素的基体内另外培养所述微生物，并且在无抗生素培养它们后采集所述微生物的质谱mssine。按剂量添加的所述参考物质也在该质谱中测量，如果从质谱mscum和mssine得出的微生物数量的相对差异或绝对差异小于指定的极限值，则将所述微生物视为具有抗药性。
第三优选实施方案包括在培养前另外采集质谱ms0。按剂量添加的参考物质也在质谱中测量，如果通过质谱mscum测定的微生物数量显著超过通过质谱ms0确定的微生物数量，则将所述微生物视为具有抗药性。在此实施方案中，可将所述微生物加入基体，然后将该基体分成两份(优选等分)培养基，其分别用于含有抗生素的培养和质谱ms0的采集。另一方面，在添加抗生素之后或同时，也可以去除一部分基体，将其用于采集质谱ms0。
如果适用，三个优选实施方案中使用的判断标准还可通过逻辑运算符合并，例如“和”运算，或非排他的“或”运算。
术语“质谱”包括质谱原始数据，直至经过处理的只包含质量信号的位置和强度的峰值列表。在此，质谱可以包括在连续的质量范围内的大量强度值，还包括多个分离的质量范围内的强度值。在测定微生物数量之前，可对质谱进行信号处理。例如，这种处理可以包括基线校正(扣除)、质量信号滤除、噪声信号消除和/或选取指定噪声值以上的质量信号。
可以由质谱以不同的方式测定微生物的数量或其度量，例如通过以下测定：微生物信号强度与参考信号强度或多个参考信号的总和强度的商；多个微生物信号的总和强度与参考信号强度或多个参考信号的总和强度的商；或者质谱的一个区域中或全部质谱中的所有信号的总和强度与参考信号强度或多个参考信号的总和强度的商。在进行总和之前，可从峰值列表或连续质谱中选择微生物信号，例如在重复测量中频繁出现的那些或具有高信号强度的那些。除峰值列表外，还可使用质谱原始数据(如果参考物质的位置已知，即使没有经过校准的质量轴也可使用)测定微生物数量，例如在所选的原始数据范围内求出所有强度值的和，然后除以参考信号所处范围内的强度值的和(如有必要，提前校正基线)。
可在添加单一抗生素或多种不同抗生素的混合物的基体内培养微生物。为了测定或至少估算出抗药性的强度，可以同时在多种(两种或更多)培养基内培养微生物，每种培养基的抗生素浓度不同，对每种培养基采集微生物和按剂量添加的参考物质的质谱mscum,i。为测试对多种抗生素的抗药性，可以同时(平行)制备多种(两种或更多)含有多种抗生素的培养基，如有必要，每种培养基甚至具有不同浓度水平的抗生素。同样，对每种培养基采集微生物和按剂量添加的参考物质的质谱mscum,i。
在培养之前、期间或之后，在质谱样本制备期间或质谱采集期间，均可向基体中按剂量添加参考物质。可在微生物细胞裂解后按剂量添加参考物质。如果向基体添加参考物质，其必须不能被微生物吸收或分解；如果在细胞裂解后添加，此条件基本不适用。如果使用基质辅助激光解吸电离(maldi)法采集质谱，优选只在maldi样本在样本支持物上制备时添加参考物质，特别是与基质溶液同时添加时。
也可按剂量添加参考物质的混合物。在此有利的是，混合物中的参考物质覆盖较大的浓度范围；例如可按100:10:1或25:5:1的比例使用三种参考物质。参考物质应当能够被有效电离，并且如果可能，应当能够在相应质谱中提供多个可识别的参考信号。参考物质的质子亲和力优选大于大多数微生物蛋白质的质子亲和力。优选的参考物质是核糖核酸酶或溶菌酶。参考物质的质量优选介于10和20千道尔顿，特别是介于14和15千道尔顿。
待分析的微生物优选以充分纯化的形式存在。例如，它们可在琼脂上形成菌落，或者可从血液培养基中获得。通过使用根据本发明的方法，还可在在液体培养基内预增殖期间直接或之后检查待研究的微生物样本，例如鼻粘膜拭子。为了实施根据本发明的方法，培养前后微生物数量原则上不必肉眼可见，即在培养前，可能小于105个微生物细胞(具体来说小于104个微生物细胞)是足够的，培养基的体积优选介于1μl和1ml之间，特别是100μl。如果在开始时待研究的微生物细胞样本的数量少且培养时间短，则可能需要在质谱样本制备之前或期间浓缩微生物蛋白质。浓缩可以通过例如以下方法实现，在裂解微生物细胞之后使蛋白质沉淀，然后例如通过离心或借助具有蛋白结合功能的表面(可以存在于例如(磁)珠子上、maldi样本支持物上或移液管尖端的包装材料表面上)分离蛋白质。如有必要，分离的并且载有蛋白质的珠子可以直接应用于maldi样本支持物上。
根据本发明的方法既可用于测定细菌抗药性，也可用于测定单细胞真菌(例如酵母)对抗真菌剂或抗真菌剂的混合物的抗药性。根据本发明的方法的另一实施方案包括在测定所述微生物的抗药性之前，对其进行分类学鉴定，并且根据系统分类来选择所述参考物质、用于测定抗药性的极限值、所述基体和/或培养条件，特别是培养期。
本发明的一个实施方案与根据govorun的方法类似，但其旨在能够测量微生物生长，特别是通过蛋白质增加进行测量。为了借助质谱定量测定含有抗生素的基体内的微生物生长，向培养基或裂解细胞添加一种或多种合适的、剂量精确的参考物质。借助参考物质测定含有抗生素的基体内的生物量增加，进而测定特别是蛋白质的增加。在此，可与不含抗生素的基体内的微生物生长进行比较，以及与不进一步培养的微生物的数量进行比较。生物量增加达到预期程度则说明研究的微生物对所用浓度的抗生素具有抗药性；如果抗生素浓度高于最低抑制浓度(mic)，则敏感微生物不显示出可测量的生长。
本方法已经被证明非常快速。由于只需两代倍增便可使生物量生长为四倍，所以危险感染(通常归因于具有20分钟倍增时间的快速生长微生物)的抗药性在40分钟培养期过后即可检测；生长较慢的微生物需要更长时间。当微生物物种已知并且因此其倍增时间已知时，可以指定所需的培养期。
本发明还提供了一种用于基质辅助激光解吸电离(maldi)法的样本支持物，其具很多采样区域，在每个所述采样区域之上为maldi基质材料的薄层。所述样本支持物的特征在于，薄层包含按剂量添加的参考物质，该参考物质的质量介于10和20千道尔顿之间，特别是介于14和15千道尔顿之间。薄层还可含有至少两种不同的参考物质，其浓度差异介于5倍和100倍之间，如有必要也可相差1000倍。此外，本发明提供了用于基质辅助激光解吸电离(maldi)的耗材。所述耗材为maldi基质材料与至少一种参考物质的冻干混合物。所述一种或多种参考物质的质量优选介于10和20千道尔顿之间，特别是介于14和15千道尔顿之间。参考物质优选以不同浓度存在，例如比例为5:1、10:1、100:1或1000:1。
附图说明
图1示出根据本发明鉴定微生物并测定其抗药性的优选方法的流程图的例子。
图2示出克雷伯氏菌属一种细菌的两种株系的四个质谱。上方两个质谱出自敏感株系1，所以在添加抗生素(“ab”)的培养基内未出现生长。在从上方数第二个质谱(“株系1 ab”)中，几乎只有参考物质(核糖核酸酶a)的质量峰可见，在远端右侧带单电荷，在中心略微偏左带双电荷。下方两个质谱得自具有抗药性的株系5，所以即使在抗生素(“株系5 ab”)加入后，生长仍不受抑制(谱图最底端)。所有质谱都在仅一小时的培养期之后采集。
图3示出分别在有和没有抗生素的条件下，对五种克雷伯氏菌株系的质谱的评价。株系1和2敏感，因此在有抗生素的条件下不生长。株系3和5有抗药性，有无抗生素生长相同。对于株系4，可以假定存在中间抗药性，或者只有一部分所收集的菌落有抗药性，所以抗药性微生物的最初的数量较少。方框表示重复测量的平均方差。
本发明的优选实施方式
虽然已参照一些实施方案展示和描述了本发明，但本领域技术人员将认识到，在不偏离所附权利要求书所定义的本发明的精神和范围的情况下，可对形式和细节的进行各种修改。
本发明提出一种优选的用于质谱测定微生物抗药性的方法，该方法在在多个相同类型的基体内，在添加和不加抗生素的条件下培养微生物之后，比较它们的质谱，其中借助至少一种所添加的参考物质来测定培养期间微生物的生长，在含有抗生素的基体内微生物生长则表示对给定浓度下的这种抗生素具有抗药性。特别地，也可同时在含有不同种类的抗生素的多种(两种或更多)基体内培养微生物。
参考物质可早先按剂量添加到培养基，该参考物质之后必须始终被微生物等量吸收且不分解，从而在冲洗和细胞裂解后的制备过程中保持可见。由于此条件难以实现，所以参考物质优选在培养后添加；例如将其添加至已裂解的细胞，或者，在基质辅助激光解吸电离的情况中，将其添加至样本支持物上的样本制备物。
为了测定抗药性的强度，或确定所收集的全部菌落的微生物是否都同样具有抗药性，可在含有多种浓度水平的抗生素的基体内培养微生物。如果采集的菌落只有一部分具有抗药性(对此本文使用术语“混合抗药性”)，则与无抗生素培养相比，所有浓度水平呈现出相同比例的生长下降，这是因为以较少数量的抗药性微生物开始生长。然而这种情况较少。另一方面，在中间抗药性的情况中，如果抗生素的浓度高，则不再有任何生长，但如果浓度低则全部生长。当然也可以不混合多个菌落的微生物，而是对每个菌落的微生物单独进行这些测试
现行做法是在琼脂上或血液培养基中培养微生物以供鉴定，通常过夜培养。对于琼脂培养基，通常有多个菌落，收集其中一个进行鉴定。为了测定抗药性，通常还对来自至少五个菌落的微生物一起进行该测试，从而还检测相同物种的非抗药性微生物菌落中是否存在抗药性微生物菌落(混合抗药性)。训练有素、经验丰富的实验室技术人员通常能够识别相同微生物的菌落并收集它们。之后可以优选将这些菌落的微生物混合并分成不同的培养物。但在特定情况下，也可对其单独进行抗药性测定，例如在无法确定这些菌落是否属于相同微生物物种的情况下。来自血液培养基的微生物天然包含在感染中传播的不同微生物的混合物。如本领域技术人员所知，血液培养物的最终形式通常是离心小团，其含有足够的微生物用于鉴定和抗药性测定。
在一个实施方案中，本发明与govorun方法类似，对来自添加和不加抗生素的培养基的微生物的质谱进行对比，但本发明旨在测量微生物生长，而这一点govorun并未提及。为了借助其质谱来定量测定含有抗生素的基体内的微生物生长，添加一种或多种合适的、剂量精确的参考物质，优选在细胞裂解之后添加。利用参考物质定量测定含有抗生素的基体内的生物量增加，并由此特别地定量测定与此相关的蛋白质增加。特别地，这可与不含抗生素的基体内微生物生长进行比较，并可与所用的不进一步培养的微生物的数量进行比较。如果生物量增加达到预期程度，则说明所研究的微生物对所用浓度的抗生素具有抗药性；如果抗生素浓度超过最低抑制浓度(mic)，则敏感微生物显示出没有生长。
主要使用采用基质辅助激光解吸电离(maldi)的飞行时间质谱仪来进行鉴定。数十年来，普遍认为maldi不适用于定量分析。但长期显示这不正确，这归因于过去对样本支持物上的样本所使用的非常粗糙的制备方法。可以证明，物质的量可用maldi测定，例如，对于非常好且均匀的薄层制备，并且如果按合适精确的剂量添加参考物质，精度可达百分之二。本文并不要求该精度；需要投入的工作也会不必要地增加常规方法的复杂性。在常规实验室中，无需投入大量工作即可达到约为20％的定量精度。由于在每个倍增时间内微生物生长两倍，即两个倍增时间生长四倍，所以maldi可容易地完成此微生物生长测量任务，即使在有抗生素的条件下生长较慢，或者并非所有所收集的微生物菌落都有抗药性时也是如此。
因此本发明提出，在测量微生物的质谱前，添加一种或多种适合作为定量参考的物质(量(或浓度)合适、精确，在此使用术语“剂量”)。参考物质可以先加入培养基，但之后要求该参考物质优选始终被微生物等量吸收，并且不被消化降解。因此，有利的是只在杀死微生物后，才将参考物质按剂量添加到离心管内的破碎微生物液体中的蛋白质，或对maldi样本支持物上的干燥蛋白质施加的基质溶液中。这些参考物质使得可以定量估计添加和不加抗生素时的微生物的相对生长，以及由此测定抗药性或敏感性。所用数量和浓度的精度优选为约10％，以使本方法的整体精度保持在约20％。参考物质由于高质子亲和力使得它们的电离不会受微生物蛋白质的抑制，因此应当易于电离。如果可以，它们应在质谱中提供多个易于识别的峰。有利的是参考物质覆盖较大的数量范围，例如可按100:10:1或25:5:1的比例使用三种参考物质。经证明有利的是，浓度最高的参考物质在质谱中产生的参考信号的高度(强度)与微生物在充分且不受抑制的生长后的最高微生物信号(通常是蛋白质信号)的高度(强度)大约相同。
在此以核糖核酸酶a作为可以成功使用的参考物质的例子。它的分子量是13,638道尔顿；其高的质子亲和力使核糖核酸酶a的带一个、两个甚至三个电荷的离子显示在maldi谱中。带单电荷的rnase-a离子显示在质谱中的区域易于识别，通常不受其他峰干扰。
在此可以给出例如其他核糖核酸酶作为合适的物质。但也可使用质子亲和力高的其他物质，例如溶菌酶。溶菌酶c的分子量是14.3千道尔顿，所以在质谱的稀疏的范围内也有峰值。
本方法经证明是令人惊奇的快速的；危险感染通常由倍增时间只有约20分钟的生长快速的微生物导致。由于只需两代倍增便可使生物量增长四倍，所以这些快速生长的微生物的抗药性在仅约40分钟的培养期之后就可以确定；倍增时间为30分钟的生长较慢的微生物则需要一个小时。如果再加20分钟用来处理微生物、准备maldi电离和采集质谱，则在鉴定它们之后的介于1和1.5小时之间的时间内可以知道抗药性。在此有利的是，在测定其抗药性之前进行微生物鉴定。在微生物物种及其倍增时间已知的情况下，所需最佳培养期便可确定。
本方法还可检查在收集微生物或制备样本时出现的错误。培养微生物后采集的微生物质谱可以再进行一次微生物鉴定流程以确认指配正确。由于这种鉴定方法是耗时的，因此可以通过简单地确定培养后采集的质谱与用于鉴定的质谱之间的相似度来加速。相似度值提供了是否具有正确的质谱以用于测定抗药性的信息。
在微生物完全抗药与完全敏感之间存在一个中间阶段：生长受到影响，但不完全抑制。为了测定或至少估计出微生物抗药性的强度，可以测量抗生素的实际抑制浓度。抗生素的mic值(对于完全敏感的微生物来说是最低抑制浓度)在很大程度上为已知的；但实际抑制浓度随抗药性强度的增加而增加。为了测量实际抑制浓度，可使用添加了各种浓度水平的抗生素的培养基，其中浓度水平可以对应于例如已知mic值的1*mic浓度、10*mic浓度和100*mic浓度。根据我们的经验，如果微生物完全敏感，上述方法只可检测1*mic浓度下的微生物生长抑制。如果抗药性弱，仅仅在10*mic浓度下微生物即可受到抑制，而对于非常强的抗药性，即使在100*mic的浓度下仍可检测到生长。可从微生物生长值看出这种效果。因此对于中间抗药性，在不同的抗生素浓度下存在不同的生长。
然而还可以存在这样的情况，所收集的菌落中只有一部分(例如一半)有抗药性，其余则是敏感的。我们称之为“混合抗药性”。即使有强的抗药性似乎也会检测到较弱的生长，但这只是因为在一开始在培养基中存在较少数量的抗药性微生物。如果以不同浓度的抗生素进行此测试，则与无抗生素培养相比，所有浓度均呈现出相同百分比的蛋白质生长下降。
如果不以多种浓度水平实施本方法，已经证明10*mic的浓度特别合适。
为测试对多种抗生素的抗药性，可以制备含有多种抗生素的多种培养基，如有必要，甚至每种培养基都具有不同浓度水平的抗生素。与培养所需的时间相比，制备来自多种(两种或更多)培养基的微生物所需的额外时间是微不足道的。
对于快速检测多重抗药性微生物(例如：mrsa，抗甲氧西林金黄色葡萄球菌)，可将多种抗生素的混合物添加到基体。如果微生物在此混合物中生长，则说明其具有多重抗药性。在此快速检测中，待研究的样本(例如鼻粘膜拭子)也可包含微生物的混合物，并且无需预先鉴定样本中的微生物。所采集的质谱可用于鉴定在含有抗生素的基体内生长的微生物，进而测定为具有抗药性。
在优选实施方案中，向含有抗生素的培养基中额外添加反应物，从而更精确地辨别抗药性微生物和敏感微生物。反应物可通过反应改变已经受到抗生素削弱的微生物，由此帮助增强抗生素的效果。例如，可以添加能够攻击并破坏生长已受影响的微生物的酶，而未受影响的微生物则不会受酶攻击。
在优选的方法中，对质谱的所选部分(如4,000至10,000道尔顿)中的所有质量峰的强度求和，然后除以带单电荷的参考离子的峰强度：这给出了商q。可按以下方式改进用于抗药性测定的常规方法：商q的值小于200表示没有生长的敏感峰(这些峰值很多都是噪声)；商q的值大于200则表示抗药性。对于含抗生素基体内的微生物(qcum)和无抗生素基体内的微生物(qsine)，更优选的是求商q的等式，商q＝qcum/qsine。如果此商接近于1(0.8<q<1.3)，则表示微生物有抗药性；如果培养期约为两个倍增时间，则q约为0.25(0.1<q<0.4)表示敏感微生物。
在另一个优选方法中，将采集自在含抗生素的基体中培养后的微生物的质谱mscum标准化至最大信号值(如有必要，在扣除基线之后)。在0和1之间选择多个阈值，优选选择大于10个，更优选约100个等距的阈值。对于每个阈值，确定强度大于该阈值的峰，将所确定的峰的数目指配给对应的阈值，由此得出曲线(大于阈值的峰数vs.阈值)。确定大于阈值的峰数目的步骤优选对得自经标准化且扣除基线的质谱mscum的峰列表进行。可将标准化曲线下方的面积(auc)或原点与曲线之间的最小距离定为微生物生长的优选度量。auc大于指定值可以表示微生物对抗生素有抗药性。更优选的是，还对mssine测定auc，即将相同的信号处理应用于在相同条件下(但不存在任何抗生素)培养的微生物的质谱mssine。auc(mscum)/auc(mssine)之比大于指定值(优选4/10)表示对所研究的抗生素具有抗药性。
对于具有大量的微生物样本必须鉴定且必须检测其抗药性的常规实验室，能够自动化进行一部分程序步骤是有价值的。整套方法完全自动化目前尚不可能；但有大量可以自动化或半自动化处理至少一些程序步骤的仪器已经上市或正在开发即将上市。有一种仪器可通过目测控制或通过图像分析从琼脂板收集微生物菌落，并可将微生物施加于样本支持板以供鉴定。可以容易地对此仪器进一步开发，以收集微生物以测定其抗药性。还可想到用于在样本支持板上裂解微生物和用基质溶液进行制备的仪器。移液操作机器人已可得，其可在合适的微量滴定板或一系列离心管中进行离心小团的裂解。可在离心管(例如eppendorf管)或过滤板(例如acropep96孔过滤板)中进行培养。用于操作能够承载48、96或384个样本的样本支持物的maldi质谱仪的ivd认证方法是商业可得的。
基质辅助激光解吸电离(maldi)要求在样本支持物上基质材料预先被制备为薄层，或制备基质溶液。市售的基质材料通常都有不超声难以溶解的缺点。因此，含有精确剂量的纯化冻干基质材料的小瓶可供使用，其中基质材料在添加溶剂后立即溶解；溶液可以合适的浓度立即使用。根据本发明，至少一种用于量化蛋白质增加的参考物质可以按合适的剂量添加到这些产品的基质材料中。在用于制备maldi样本的设备中，基质溶液可以合适的剂量施加至微生物的干燥细胞成分，特别是蛋白质，而不需要与它们接触。已经市售的具有薄基质层的样本支持板还可包含按剂量添加的参考物质。每个薄层各自置于小的样本区域，它们很好地彼此分离，并且每个的直径约为两毫米。
作为示例，用于测定抗药性的优选方法的顺序如图1所示。在此处所示方法中，微生物在琼脂(101)上培养。一个菌落的微生物经过收集(102)、破碎(裂解)，被处理成maldi样本(103)。通过质谱采集(104)鉴定微生物，方法是比较其质谱与参考谱(105)。对于常规实验室，从收集菌落到鉴定只需10至30分钟，这取决于待同时鉴定的微生物样本数目。可以同时收集相同微生物的多个其他菌落(106)以测定抗药性。将这些菌落混合，然后分成不同种类的培养(107)。此图所示的例子中准备三种培养：一种在不含抗生素的基体中培养(108)，两种培养具有抗生素ab1(109)和ab2(110)。当然还可制备含有其他抗生素的其他培养基，如果还要测定抗药性的强度，也可制备含有不同浓度抗生素的培养基。所有培养都在最佳温度下预先准备，以使微生物不会休克，从而加热不会导致时间推迟。培养期取决于微生物的倍增时间(传代时间)，这可由微生物的鉴定得知。培养只需持续2至3个倍增时间。对于生长快速的微生物来说，约40分钟便足够。通过参考物质后，将来自不同培养基的微生物处理成maldi样本，然后采集质谱(111)。由不添加抗生素进行培养的微生物的质谱求出商qsine，方法是对例如4,000至10,000道尔顿质量范围内的所有峰的强度求和，然后除以参考峰的强度。由添加相应抗生素n进行培养的微生物的质谱求出对应的商qcum,n(112)。如上所述，商qn＝qcum,n/qsine示出各情况中的抗药性。
目前为止，所述方法在maldi飞行时间质谱仪中通过maldi电离进行。maldi的显著优点是其几乎只形成带单电荷的分子离子。因此，即使在3,000至15,000道尔顿的优选质量范围内出现50至100个峰值，质谱也不过载，并且可较容易地识别相似度。但这并不意味着不能使用其他形式的电离。诸如esi(电喷雾电离)或desi(通过电喷雾对固体样本进行直接表面电离，即解吸电喷雾电离)等基于喷雾的方法形成带多电荷的离子，其能够容易地使质谱过载，但其可与诸如液相色谱(hplc)或毛细管电泳(ce)等分离方法联合使用，以便可以通过分离物质来再次获得较简单的成分的质谱。
然而，还有其他的也几乎只产生带单电荷的离子的电离方法，例如化学电离(ci)。化学电离可与中性喷雾法(neutralspraymethod)以及固体样本激光消融法结合使用，并且可与otof-ms(正交离子注入飞行时间质谱)结合使用。由此获得的质谱提供了极高的质量分辨率和高的灵敏度(例如可以参见j.franzen和k.michelmann的de102005044307b4，)。
当然，如果其他类型的质谱仪提供了3,000至15,000道尔顿的优选质量范围以测量质谱，也可以使用。
本发明的不同方面均已如上阐明。但是，应当认识到，在不偏离本发明范围的前提下，本发明的各方面或细节可以修改，或者如果可行，随本发明的不同实施方案公布的不同方面也可任意组合。此外，以上描述仅出于说明目的，并非出于限制本发明的目的，本发明的范围仅由所附权利要求书定义。
1.一种用质谱测定微生物对抗生素的抗药性的方法，其中在含有所述抗生素的培养基中培养所述微生物，所述方法包括：
将至少一种参考物质按剂量添加到含有所述抗生素的培养基中，其中所述至少一种参考物质不被所述微生物吸收或分解；
在包含抗生素的培养基中培养所述微生物后，采集所述微生物的质谱mscum，其中在所述质谱mscum中也测量所述至少一种参考物质(共测)；
通过首先从质谱mscum中测定在包含抗生素的培养基中培养后的微生物的数量，然后将此数量与在培养前对应测定的微生物或标准化的微生物数量和/或在无抗生素培养基中培养后对应测定的微生物数量进行比较，从而测定微生物的生长，其中使用所述至少一种参考物质的一种或多种参考信号的强度，根据质谱mscum的一种或多种微生物信号的强度测定微生物的数量；以及
在包含所述抗生素的培养基中的微生物生长表明对所述抗生素有抗药性。
2.根据权利要求1所述的方法，其中将所述至少一种参考物质在培养之前、期间或之后添加至所述培养基中。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述微生物的细胞的数量在培养之前小于104个。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述微生物的培养体积介于1μl和1ml之间。
5.根据权利要求1所述的方法，其中在包含不同抗生素的混合物的培养基中培养所述微生物。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种参考物质由于高的质子亲和力从而易于电离，使得其电离不会受微生物蛋白质的抑制。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种参考物质的质量介于10千道尔顿和20千道尔顿。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种参考物质能够有效电离，并且提供多个可识别的参考信号。
9.根据权利要求1所述的方法，其中将覆盖一定浓度范围的参考物质的混合物加入包含所述抗生素的培养基中。
10.根据权利要求9所述的方法，其中浓度最高的参考物质在质谱mscum中产生的参考信号的高度(强度)与微生物在充分且不受抑制的生长后的最高微生物信号的高度(强度)大约相同。
11.根据权利要求1所述的方法，其中在各自含有不同浓度的抗生素的多种培养基内同时培养所述微生物。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述抗生素的浓度范围介于1mic(最低抑制浓度)至100mic之间。
13.根据权利要求1至12中任意一项所述的方法，其中通过下列方法采集所述质谱：基质辅助激光解吸电离法(maldi)、电喷雾电离(esi)、解吸电喷雾电离(desi)、或化学电离与中性喷雾法以及固体样本的激光消融法的结合使用。
技术总结