本发明涉及分子生物学领域技术领域，具体涉及一种兔肺炎克雷伯氏菌、沙门氏菌、波氏杆菌多重pcr检测方法。
背景技术：
兔肺炎克雷伯氏菌、沙门氏菌、波氏杆菌均为革兰氏阴性菌，血清型多且宿主范围广，给养殖业带来严重的危害和巨大损失，同时也危及公共卫生安全。兔肺炎克雷伯氏菌、沙门氏菌、波氏杆菌的常用检测方法有传统分离鉴定、免疫学方法、分子生物学方法等。传统分离鉴定、免疫学方法检测过程费时费力，且灵敏度较低。pcr应用已较为广泛，随着多种细菌性疾病混合感染情况的日益加重，多重pcr检测方法得到快速发展和应用，该技术检测成本低、效率高，可真正实现快速核酸检测。
技术实现要素：
针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种兔肺炎克雷伯氏菌、沙门氏菌、波氏杆菌多重pcr检测方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种用于检测兔肺炎克雷伯氏菌、沙门氏菌、波氏杆菌的遗传标记物，其具有seqidno.7-no.9所示的序列。
本发明的第二方面，提供用于特异性扩增上述遗传标记物的pcr引物对，其核苷酸序列分别如seqidno.1-no.6所示。具体如下：
肺炎克雷伯氏菌上游引物f：5’-ttcaacagcgacgcaggcagc-3’；(seqidno.1)
肺炎克雷伯氏菌下游引物r：5’-gccgtagttcttcagcttc-3’。(seqidno.2)
沙门氏菌上游引物f：5’-actggcgttatccctttctctggtg-3’；(seqidno.3)
沙门氏菌下游引物r：5’-atgttgtcctgcccctggtaagaga-3’。(seqidno.4)
波氏杆菌上游引物f：5’-tgatcaccggcaacatcgt-3’；(seqidno.5)
波氏杆菌下游引物r：5’-gatacggatctgcactcct-3’。(seqidno.6)
本发明的第三方面，提供上述pcr引物对在制备检测兔肺炎克雷伯氏菌、沙门氏菌、波氏杆菌的试剂盒中的应用。
本发明的第四方面，提供一种检测兔肺炎克雷伯氏菌、沙门氏菌、波氏杆菌的试剂盒，所述试剂盒中含有上述的pcr引物对。
进一步的，所述试剂盒中还含有：2×taqpcrmastermix、模板、ddh2o。
进一步的，所述试剂盒的工作程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s；55℃退火30s；72℃延伸40s，30个循环；72℃延伸10min。
本发明的第五方面，提供一种检测兔肺炎克雷伯氏菌、沙门氏菌、波氏杆菌的方法，包括以下步骤：
(1)以待测样品的菌液为模板，利用seqidno.1-no.6所示的pcr引物对进行pcr扩增；
(2)将pcr扩增的产物进行电泳，观察是否出现277bp、326bp、495bp条带；若出现277bp条带，则判断为兔肺炎克雷伯氏菌、沙门氏菌、波氏杆菌阳性；若出现326bp条带，则判断为波氏杆菌阳性，若出现495bp条带，则判断为沙门氏菌阳性；若未出现对应大小条带，则判断为对应病原阴性。
优选的，步骤(1)中，多重pcr的反应体系包括：seqidno.1-no.6所示的pcr引物各0.5μl，2×taqpcrmastermix25μl，等量混合模板3μl，ddh2o补足至50μl。
优选的，步骤(1)中，多重pcr的条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s；55℃退火30s；72℃延伸40s，30个循环；72℃延伸10min。
优选的，步骤(2)中，取5μlpcr产物加入2％琼脂糖凝胶中进行电泳。
上述检测兔肺炎克雷伯氏菌、沙门氏菌、波氏杆菌的方法不仅可以用于兔肺炎克雷伯氏菌、沙门氏菌、波氏杆菌的检测，还可以用于流行病学的调查、兔肺炎克雷伯氏菌、沙门氏菌、波氏杆菌治疗药物的筛选等。
本发明的有益效果：
本发明提供了用于检测兔肺炎克雷伯氏菌、沙门氏菌、波氏杆菌的遗传标记物，并根据该遗传标记物设计了pcr引物对，具有非常好的特异性。利用本发明的pcr引物对，本发明进一步优化建立了适宜于快速准确进行兔肺炎克雷伯氏菌、沙门氏菌、波氏杆菌检测的多重pcr方法，最低检出细菌量为104cfu/ml。该方法操作简单、快速，适用于临床生产和实验室的快速诊断。
附图说明
图1：单重pcr扩增结果；其中，m-标准dna分子量2000；1-沙门氏菌；2-波氏杆菌；3-肺炎克雷伯氏菌。
图2：多重pcr引物浓度优化结果；其中，m-标准dna分子量2000；1～4-兔肺炎克雷伯氏菌、波氏杆菌、沙门氏菌对应的引物对的浓度(μmol/l)分别是0.2、0.2、0.2；0.4、0.4、0.4；0.6、0.6、0.6；0.8、0.8、0.8。
图3：多重pcr退火温度优化结果；其中，m-标准dna分子量2000；1～7-退火温度分别是51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃。
图4：多重pcr特异性试验结果；其中，m-标准dna分子量2000；1-3种菌混合阳性对照；2-沙门氏菌；3-波氏杆菌；4-肺炎克雷伯氏菌；5-巴氏杆菌；6-大肠杆菌；7-生理盐水对照。
图5：多重pcr灵敏性试验结果；其中，m-标准dna分子量2000；1～7-依次为100～106倍比稀菌液的pcr扩增结果。
图6：人工模拟试验多重pcr检测结果；其中，m-标准dna分子量2000；1-3种菌混合阳性对照；2-波氏杆菌 肺炎克雷伯氏菌；3-肺炎克雷伯氏菌 沙门氏菌；4-沙门氏菌 波氏杆菌；5-波氏杆菌；6-肺炎克雷伯氏菌；7-沙门氏菌。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
正如背景技术部分所介绍的，对于肺炎克雷伯氏菌的检测，采用传统分离鉴定、免疫学方法检测过程费时费力，且灵敏度较低。采用常规pcr，一次只能检测一种病原菌，不能尽快对临床中混合感染情况明确病原。基于此，本发明的目的是提供一种兔肺炎克雷伯氏菌、沙门氏菌、波氏杆菌多重pcr检测方法，以实现对兔肺炎克雷伯氏菌、沙门氏菌、波氏杆菌3种病原菌的同时检测，有较高的特异性、敏感性及重复性，且降低了成本。
多重pcr的关键在于引物的设计，但多重pcr不同于常规的pcr反应，要确保3种引物间没有二聚体形成，且最佳反应条件相近。因此，多重pcr引物设计存在较大难度。
另外，在进行多重pcr引物设计时，靶标区域的选择也非常关键，没有合适的靶标区域，无法实现对兔肺炎克雷伯氏菌、沙门氏菌、波氏杆菌的特异性检测。本发明通过对ncbi中已报道的兔肺炎克雷伯氏菌phoe基因、沙门氏菌hut基因、波氏杆菌fimn基因序列进行比对，最终找到了兔肺炎克雷伯氏菌、沙门氏菌、波氏杆菌对应的特异性保守靶序列，其核苷酸序列分别如seqidno.7、seqidno.8、seqidno.9所示，该靶序列是检测兔肺炎克雷伯氏菌、沙门氏菌、波氏杆菌的遗传性标记物，具体如下：
5’-ttcaacagcgacgcaggcagcggaagtttataataagaacgcgaacaagctggatgtgtacggcaagatcaaagccatgcactatttcagcgactatgacagcaaggatggcgatcagacctacgtgcgtttcggtattaaaggcgaaacgcagattaacgacgacctgaccggctatggccgttgggaatctgaattctccggtaacaaaaccgagagcgactccagccagaaaacccgtctggcgttcgccggcgtgaagctgaagaactacggc-3’(seqidno.7)
5’-actggcgttatccctttctctggtgctggcattttccagcgctaccgcagcatttgccgctattccacaaaagattcgcatcggtaccgatcctacatacgcaccgtttgaatccaaaaatgcacaaggtgaattggtcggctttgatatcgatctggccaaagagctgtgcaaacgtatcaacacacagtgtacgttcgtggaaaacccgctggatgcgctgattccgtctttaaaagcgaagaaaattgatgccatcatgtcctcgctgtccatcactgaaaagcgccagcaggaaatcgcgtttaccgacaagctttacgccgctgattcccgtctggtggtggcgaagaactctgatattcagccgaccgtcgcgtcgctgaaaggcaagcgcgtcggcgtgctacaggggacgacgcaggagaccttcggcaatgagcactgggcgccgaaagggattgagatcgtctcttaccaggggcaggacaacat-3’(seqidno.8)
5’-tgatcaccggcaacatcgtcgacaacacctgcgaggtcgtggatccgccgcagcccaatcacatcaaggtggtgcatctgcccaagatctcgacaagcgcgctcaagaagaccggcgataccgccggcgcgacgccgttttccatcaagctgcagaactgccccgaatcgctgggcaatggcgtgaagctgtacttcgagcccggtccgaccaccgactacagcaccagggacctgaccgcctacaagctggcctacaccgccaacagcacgaccaacagcaacattgttgccggccaggtcgcggaaggagtgcagatccgtatc-3’(seqidno.9)。
靶标区域的长度直接影响兔肺炎克雷伯氏菌、沙门氏菌、波氏杆菌检测的特异性，若靶标区域过短，则会导致特异性不足，无法将兔肺炎克雷伯氏菌、沙门氏菌、波氏杆菌与其他种类的菌区分开；若靶标区域过长，虽然特异性好，但设计能够扩增长片段的引物的难度较大，而且，长片段的扩增过程中容易出现差错。经综合考虑和多次试验发现，以seqidno.7-no.9所示的序列作为靶标区域，其特异性好，片段长度适中，方便进行引物设计。
根据本发明优选的靶标区域，本发明进行了pcr引物设计，在本发明的一个优选的实施方案中，所设计的pcr引物对如下：
肺炎克雷伯氏菌上游引物f：5’-ttcaacagcgacgcaggcagc-3’；(seqidno.1)
肺炎克雷伯氏菌下游引物r：5’-gccgtagttcttcagcttc-3’。(seqidno.2)
沙门氏菌上游引物f：5’-actggcgttatccctttctctggtg-3’；(seqidno.3)
沙门氏菌下游引物r：5’-atgttgtcctgcccctggtaagaga-3’。(seqidno.4)
波氏杆菌上游引物f：5’-tgatcaccggcaacatcgt-3’；(seqidno.5)
波氏杆菌下游引物r：5’-gatacggatctgcactcct-3’。(seqidno.6)
上述pcr引物对的特异性好，所特异性扩增的片段分别位于兔肺炎克雷伯氏菌phoe基因的第45-321位点之间，大小为277bp；沙门氏菌hut基因的第246-740位点之间，大小为495bp、波氏杆菌fimn基因的第191-516位点之间，大小为326bp。
基于上述pcr引物对构建的pcr体系可以实现同时对兔肺炎克雷伯氏菌、沙门氏菌、波氏杆菌的快速、灵敏检测。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，其中，dnamarkerdl-2000、depc、2×taqpcrmastermix、ddh2o均购自takara公司(大连)。其他未进行具体说明的均可通过商业渠道购买得到。
本发明实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规的条件，或按照仪器或试剂制造厂商所建议的条件进行操作。
实施例1：引物的设计与优化
1.引物的设计：
本实施例针对兔肺炎克雷伯氏菌、沙门氏菌、波氏杆菌的保守区分别设计了一系列的pcr引物，具体见表1。
表1：针对兔肺炎克雷伯氏菌、沙门氏菌、波氏杆菌的保守区设计的pcr引物
利用pcr扩增反应对表1中的引物进行筛选，选择标准兔肺炎克雷伯氏菌、沙门氏菌、波氏杆菌接种于4mllb培养基中，37℃培养16h，对其计数后用pbs对纯菌液稀释至105cfu/ml，将其作为模板，进行pcr检测，具体步骤如下：
配制多重pcr反应体系：pcr引物各0.5μl，2×taqpcrmastermix25μl，等量混合模板3μl，ddh2o补足至50μl。95℃预变性5min；95℃变性30s；55℃退火30s；72℃延伸40s，30个循环；72℃延伸10min。反应结束后于2％琼脂糖凝胶电泳,90v，30min，观察结果。
2.引物的优选结果：
采用表1中所设计的pcr引物对分别进行pcr扩增后，通过琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果发现，引物对1(f1/r1)、引物对7(f7/r7)、引物对8(f8/r8)的扩增效果最好，条带特异性好，没有非特异性扩增，且对应扩增片段更适宜多重pcr，试验结果如图1所示。因此，选择引物对1(f1/r1)、引物对7(f7/r7)、引物对8(f8/r8)进行后续的pcr反应条件优化、特异性和敏感性试验。
实施例2：多重pcr反应条件的优化
对各引物浓度进行优化，按照0.2μmol/l浓度梯度设定个引物对浓度(μmol/l)组合(0.2、0.2、0.2；0.4、0.4、0.4；0.6、0.6、0.6；0.8、0.8、0.8)，进行优化试验，试验结果如图2所示。优化结果表明，3种引物对浓度均为0.4μmol/l时多重pcr扩增效果最佳。
经优化后的pcr反应体系为：上、下游引物(0.4μmol/l)各0.5μl，rehydrationbuffer29.5μl，template3μl，ddh2o12.6μl，280mmmgac2.5μl。
另外，还对多重pcr退火温度进行优化，试验结果如图3所示。结果发现，退火温度为55℃，多重pcr扩增效率最高。
经优化后的pcr反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s；55℃退火30s；72℃延伸40s，30个循环；72℃延伸10min。
本发明优化后的多重pcr反应条件，可以同时完成对兔肺炎克雷伯氏菌、沙门氏菌、波氏杆菌的快速检测，大大降低了成本，适用于生产中快速确诊混合感染病例。
实施例3：多重pcr反应特异性验证
分别用兔肺炎克雷伯氏菌、沙门氏菌、波氏杆菌混合物作为模板，以兔巴氏杆菌、大肠杆菌、生理盐水作为阴性对照，使用3对引物的混合物，按实施例2优化后的多重pcr反应条件进行扩增，通过凝胶电泳检测。试验结果如图4所示，只有兔肺炎克雷伯氏菌、沙门氏菌、波氏杆菌及混合物可扩增出特异的目的片段，其他的均为阴性，结果与预期相符，说明本发明的多重pcr检测体系特异性良好。
实施例4：多重pcr反应灵敏度验证
选择标准兔肺炎克雷伯氏菌、沙门氏菌、波氏杆菌样品分别接种于4mllb培养基中，37℃培养16h，对其计数后统一调整至108，用pbs对纯菌液进行10倍梯度稀释至106，按实施例2优化后的反应条件进行多重pcr检测。兔肺炎克雷伯氏菌、沙门氏菌、波氏杆菌的培养菌液分别从1.01×108cfu/ml、4.4×108cfu/ml、1.4×108cfu/ml，稀释至1.01×102cfu/ml、4.4×102cfu/ml、1.4×102cfu/mlcfu/ml；按实施例2优化后的多重pcr反应条件进行扩增。结果为：本发明多重pcr方法的菌液灵敏度为104cfu/ml(图5)。
实施例5：人工模拟试验
1.样本处理：
将3种菌随机排列组合作为模板，利用已建立好的方法进行多重pcr检测。
2.多重pcr扩增：
按实施例2优化后的多重pcr反应条件进行扩增，反应结束后于2％琼脂糖凝胶电泳，90v，30min，观察结果。
3.结果判断：
实验结果如图6所示，每份样本均扩增出了对应细菌相应的目的条带，阴性对照无条带，说明本发明的多重pcr检测体系特异性良好，可以用于临床样本检测。
采用本发明的pcr方法检测兔肺炎克雷伯氏菌、沙门氏菌、波氏杆菌，能够大大提高兔肺炎克雷伯氏菌、沙门氏菌、波氏杆菌检测的灵敏度、特异性；并且较传统的细菌分离方法及单重pcr方法相比缩短了检测周期，提高了检测的灵敏度。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
1.一种用于检测兔肺炎克雷伯氏菌、沙门氏菌、波氏杆菌的遗传标记物，其特征在于，其具有seqidno.7-no.9所示的序列。
2.用于特异性扩增权利要求1所述的遗传标记物的pcr引物对，其特征在于，所述pcr引物对的核苷酸序列分别如seqidno.1-no.6所示。
3.权利要求2所述的pcr引物对在制备检测兔肺炎克雷伯氏菌、沙门氏菌、波氏杆菌的试剂盒中的应用。
4.一种检测兔肺炎克雷伯氏菌、沙门氏菌、波氏杆菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有权利要求2所述的pcr引物对。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还含有：2×taqpcrmastermix、模板、ddh2o。
6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的工作程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s；55℃退火30s；72℃延伸40s，30个循环；72℃延伸10min。
7.一种检测兔肺炎克雷伯氏菌、沙门氏菌、波氏杆菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以待测样品的菌液为模板，利用seqidno.1-no.6所示的pcr引物对进行pcr扩增；
(2)将pcr扩增的产物进行电泳，观察是否出现277bp、326bp、495bp条带；若出现277bp条带，则判断为兔肺炎克雷伯氏菌阳性；若出现326bp条带，则判断为波氏杆菌阳性；若出现495bp条带，则判断为沙门氏菌阳性；若未出现对应大小条带，则判断为对应病原阴性。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，多重pcr的反应体系包括：seqidno.1-no.6所示的pcr引物各0.5μl，2×taqpcrmastermix25μl，等量混合模板3μl，ddh2o补足至50μl。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，pcr的条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s；55℃退火30s；72℃延伸40s，30个循环；72℃延伸10min。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，取5μlpcr产物加入2％琼脂糖凝胶中进行电泳。
技术总结