本发明涉及扩增产物鉴定，具体涉及一种pcr扩增产物的检测方法。
背景技术：
pcr(聚合酶链式反应)是一种用于扩增放大特定dna片段的分子生物学技术，在生命科学相关领域有十分广泛的应用，而对其产物的分析检测及判定方法则直接影响pcr检测的效率。目前，pcr技术在生产中最普遍的应用是通过判定其特定产物片段的有无以识别特定基因、基因型或基因组，如病原微生物的鉴定、特定动物源成份的识别、性别鉴定、转基因成份鉴定等。pcr扩增后对产物识别分析鉴定主要有以下几种方法：
1、凝胶电泳，又可分为琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳两种。琼脂糖凝胶电泳是实验室最常用的方法，简便易行，其原理是不同大小的pcr扩增产物通过琼脂糖凝胶时，由于电泳速度不同而被分离，经溴化乙锭(eb)或其他荧光染料染色，在紫外光照射下dna分子发出荧光而判定其分子的大小。聚丙烯酰胺凝胶电泳原理类似，但制胶过程及显色比琼脂糖凝胶电泳繁琐，检测水平也更精密，在引物纯化、pcr扩增指纹图、多重pcr扩增、pcr扩增产物的酶切限制性长度多态性分析时常用到。
但利用凝胶电泳检测pcr产物最大的问题在于，胶面大，制胶及电泳时间长，且由于需要取出pcr产物进行点样电泳，容易造成pcr产物污染，而且一旦污染较难去除。
2、根据荧光曲线判定，即直接在pcr反应体系中加入荧光染料(如sybrgreen)，荧光染料可以结合到双链dna上面，当体系中的模板被扩增时，荧光染料可以有效结合到新合成的双链上面，随着pcr的进行，结合的荧光染料越来越多，被仪器检测到的荧光信号越来越强，根据pcr扩增荧光曲线的趋势即可判定有无目的产物出现。这种判定方法需要有荧光定量pcr仪并且需要特定荧光染料，成本较高，使用这种方法仅用于判定产物的有无显然投入回报率太低，因此较少使用。
近年出现的一种新的基因扩增方法，环介导等温扩增(lamp)，其扩增产物鉴定则十分简便，可通过肉眼观察反应体系浊度、颜色或荧光变化来直接判断反应产物的有无。在lamp技术显然无法完全替代pcr检测的前提下，一个普遍被关心的问题是，既然都是基因扩增方法，lamp扩增产物鉴定方法能否应用于pcr反应中以轻松鉴别pcr结果？答案是否定的。这是因为lamp在反应过程中，由于其反应效率高，扩增产物量大约是pcr的10-100倍，因此反应中dntp会大量解离出焦磷酸根离子，与溶液中的镁离子相结合生成焦磷酸镁白色沉淀，产生浊度的变化，而焦磷酸镁的生成量和dna的扩增量呈正相关。虽然普通的pcr也会产生焦磷酸盐，但由于其生成量很少，不能用于结果观察。利用这一特性lamp还可以通过在反应产物中添加金属离子络合剂或金属离子指示剂，通过其结合不同金属离子而呈现不同颜色的这一特性来判断反应是否进行，如钙黄绿素(calcein)、羟基萘酚蓝(hnb)这两种试剂都可以通过反应体系颜色的变化来判断反应是否进行，实现对反应的可视化观察，大大提高了反应的检测效率。
同样，由于lamp扩增产物生成量大，可直接在反应体系中加入荧光染料如sybrgreen，反应完成后不经电泳，扩增产物在反应管内直接经紫外光照射，根据其荧光强度的变化肉眼即可鉴别反应是否发生。而对pcr反应，由于扩增产物浓度较lamp低一到两个数量级，产物dna即使结合荧光染料，其荧光强度变化也不足以与阴性对照(反应本底)相区别，难以通过肉眼或荧光成像对反应结果进行判定。
技术实现要素：
发明目的：为了解决无法快速鉴定pcr反应产物有无的问题，本发明提供了一种pcr扩增产物的检测方法。
技术方案：本发明所述一种pcr扩增产物的检测方法，包括以下步骤：
(1)在pcr反应体系中添加荧光染料和非离子去污剂，然后进行pcr扩增；
其中，所述荧光染料在pcr反应体系中的浓度为0.1×-1×，所述非离子去污剂在pcr反应体系中的体积浓度为0.1-0.5％；
(2)将步骤(1)得到的体系在紫外灯照射下于暗场肉眼观察或经荧光成像系统照相后观察，通过体系颜色判断pcr扩增产物的有无。
步骤(1)中，所述荧光染料为sybrgreeni(invitrogen)、溴化乙锭(eb)、goldview(赛百盛)、gelred(biotium)、4sredplus(上海生工)、4sgreenplus(上海生工)和genegreen(天根)中的任意一种或几种的组合，所述荧光染料原液的浓度为10000×(市售或自己配制)；所述非离子去污剂为trionx-100、tween-20、嵌段式聚醚f-127、聚环氧乙烯月桂酰醚和np-40(nonidetp-40)中的任意一种或几种的组合。所述pcr反应体系包括taqdna聚合酶、引物、dntp、dna模板和含mg2 的反应缓冲液。
优选地，所述dna模板为公鸽或母鸽的dna。
优选地，所述荧光染料为溴化乙锭(eb)或4sredplus(上海生工)
优选地，所述非离子去污剂为np-40。
优选地，所述荧光染料在反应体系中的浓度为0.2×-0.6×，所述非离子去污剂在反应体系中的体积浓度为0.1％-0.3％。
更优选地，所述荧光染料在反应体系中的浓度为0.5×，所述非离子去污剂在反应体系中的浓度为0.3％。
步骤(2)中，当于暗场肉眼观察时，与体系中不含pcr扩增产物(阴性对照)的颜色相比，体系中含有pcr扩增产物显示的颜色为荧光的颜色，如eb为桔红色，4sgreenplus为绿色，可以通过荧光强度的差别进行区分pcr扩增产物的有无。当经荧光成像系统照相后观察时，与体系中不含pcr扩增产物(阴性对照)成像的颜色发暗相比，体系中含有pcr扩增产物成像的颜色更亮显示发白。
有益效果：(1)本发明适用于病原微生物的鉴定、特定动物源成份的识别、性别鉴定、转基因成份鉴定；通过有或无反应进行判断的pcr鉴定，可不经凝胶电泳，在pcr管内利用荧光成像系统或肉眼观察直接判定，简化了实验程序，减少了实验操作，节省时间提高效率；(2)对pcr结果进行分析判断可以不必打开pcr管盖，减少了实验污染；(3)只需在常规pcr反应体系中加入少量试剂，不影响pcr反应过程，操作简单成本低。
附图说明
图1为添加不同浓度trionx-100对pcr结果鉴定的影响；
图2为添加trionx-100直接鉴别pcr反应的有无；
图3为添加np-40直接鉴别pcr反应的有无；
图4为添加tween-20直接鉴别pcr反应的有无。
具体实施方式
实施例1添加不同浓度trionx-100对pcr结果鉴定的影响
取公鸽抗凝血，用dzup(血液)基因组dna快速提取试剂盒(上海生工)按说明书提取dna。以鸽dna为模板，以鸽chd基因引物f(5′-agaacgtggcaacagagtac-3′，核苷酸序列如seqidno:1所示)和r(5′-tgaaatgatccagtgcttgt-3′，核苷酸序列如seqidno:2所示)进行pcr扩增。pcr反应体系(50μl)组成：2×mastermix25μl、10μmchd引物f和r各1μl、荧光染色剂4sredplus10000×原液稀释800倍后取2μl，为比较加与不加trionx-100对pcr结果鉴定的影响，1，3，5号样分别加鸽血dna模板1μl、2，4，6号不加做对照，体积浓度为5％trionx-1001，2号样加0μl，3，4号样各加2μl，5，6号样各加4μl；并用灭菌去离子水补齐至50μl。pcr反应条件：①94℃3min；②94℃30s；55℃30s，72℃30s，32个循环；③72℃5min。pcr产物在pcr管内直接用凝胶成像系统照相，为验证结果，拍照后取pcr产物点样后经1％琼脂糖电泳，eb染色，凝胶成像系统观察带型，见图1，上图为pcr管直接荧光成像系统照相，下图为相应的凝胶电泳图，其中m，markerdl2000；1-6分别代表不同的试验。结果表明，当pcr反应体系中不加trionx-100时，经紫外光照射，pcr发生与否用肉眼或荧光成像无法区别，如图1中1、2号样。而pcr反应体系中添加0.2-0.4％trionx-100后，经紫外光照射，pcr发生与否可直接通过肉眼或荧光成像进行区别，经与凝胶电泳图结果比较可知，图1中3-6号样，其中偏白的pcr管(3，5号)代表发生了pcr反应，发暗pcr管(4，6号)没有发生pcr反应。结果表明当pcr反应体系中加入一定浓度trionx-100时，其反应与否可直接通过肉眼鉴别。
实施例2添加trionx-100直接鉴别pcr反应的有无
分别取公、母鸽的抗凝血，用dzup(血液)基因组dna快速提取试剂盒(上海生工)按说明书提取dna。以鸽dna为模板，以雌鸽w染色体特异引物ee0.6p260f(5′-tcctatgcctaccaccttcc-3′，核苷酸序列如seqidno:3所示)和r(5′-atgattctaaaacatttgttgtttg-3′，核苷酸序列如seqidno:4所示)进行pcr扩增，由于雄鸽没有w染色体，因此仅雌鸽可扩增一条260bp的条带。pcr反应体系(50μl)组成：2×mastermix25μl、鸽血dna模板1μl、10μm引物ee0.6p260f和r各1μl、荧光染色剂sybrgreeni10000×原液稀释800倍后取2μl，体积浓度为5％trionx-100分别加2、3、4、5μl，最后用灭菌双蒸水补齐50μl。pcr反应条件：①94℃3min；②94℃30s；53℃30s，72℃30s，36个循环；③72℃5min。pcr产物在pcr管内直接用凝胶成像系统照相，为验证结果，拍照后取pcr产物点样后经1％琼脂糖电泳，eb染色，凝胶成像系统观察带型，见图2，其中图2上为pcr管直接荧光成像系统照相，图2下为相应的凝胶电泳图，其中m:dl2000marker；管号单数为母鸽，双数为雄鸽，1-2添加0.2％trionx-100；3-4添加0.3％trionx-100；5-6添加0.4％trionx-100；7-8添加0.5％trionx-100。结果表明，pcr反应体系中添加0.2-0.4％trionx-100，经紫外光照射，pcr发生与否可直接通过肉眼或荧光成像进行区别，如图2上，其中偏白的pcr管(1，3，5，7号)代表发生了pcr反应可鉴定为雌性，发暗pcr管(2，4，6，8号)没有发生pcr反应，为雄性，这与图2下中的凝胶图结果一致。结果表明当trionx-100为0.3％时，区别度最佳。
实施例3添加np-40直接鉴别pcr反应的有无
分别取公、母鸽抗凝血，用dzup(血液)基因组dna快速提取试剂盒(上海生工)按说明书提取dna。以鸽dna为模板，以雌鸽w染色体特异引物ee0.6p260f(5′-tcctatgcctaccaccttcc-3′，核苷酸序列如seqidno:3所示)和r(5′-atgattctaaaacatttgttgtttg-3′，核苷酸序列如seqidno:4所示)进行pcr扩增，由于雄鸽没有w染色体，因此仅雌鸽可扩增一条260bp的条带。pcr反应体系(50μl)组成：2×mastermix25μl、鸽血dna模板1μl、10μm引物ee0.6p260f和r各1μl、4sredplus10000×原液稀释800倍后取2μl，5％np-403μl，灭菌去离子水17μl。pcr反应条件：①94℃3min；②94℃30s；53℃30s，72℃30s，36个循环；③72℃5min。pcr产物在pcr管内直接用凝胶成像系统照相，为验证结果，拍照后取pcr产物点样后经1％琼脂糖电泳，eb染色，凝胶成像系统观察带型，见图3，左图为pcr管直接荧光成像系统照相，右为相应的凝胶电泳图，其中m，markerdl2000；♀，雌鸽；♂，雄鸽；-，阴性对照。结果表明，pcr反应体系中添加0.3％np-40，经紫外光照射，pcr发生与否可直接通过肉眼或荧光成像进行区别，如图3左，雌性鸽样本发生pcr反应，荧光信号强，拍照后颜色偏白，而雄性及阴性对照颜色偏暗，区别明显，且与凝胶电泳结果一致。
实施例4添加tween-20直接鉴别pcr反应的有无
分别取公、母鸽抗凝血，用dzup(血液)基因组dna快速提取试剂盒(上海生工)按说明书提取dna。以鸽dna为模板，以雌鸽w染色体特异引物ee0.6p260f(5′-tcctatgcctaccaccttcc-3′，核苷酸序列如seqidno:3所示)和r(5′-atgattctaaaacatttgttgtttg-3′，核苷酸序列如seqidno:4所示)进行pcr扩增，由于雄鸽没有w染色体，因此仅雌鸽可扩增一条260bp的条带。pcr反应体系(50μl)组成：2×mastermix25μl、鸽血dna模板1μl、10μm引物ee0.6p260f和r各1μl、荧光染色剂溴化乙锭(eb)10000×原液稀释800倍后取2μl，5％tween-203μl，灭菌去离子水17μl。pcr反应条件：①94℃3min；②94℃30s；53℃30s，72℃30s，36个循环；③72℃5min。pcr产物在pcr管内直接用凝胶成像系统照相，为验证结果，拍照后取pcr产物点样后经1％琼脂糖电泳，eb染色，凝胶成像系统观察带型，见图4，左图为pcr管直接荧光成像系统照相，右图为相应的凝胶电泳图，其中m，markerdl2000；♀，雌鸽；♂，雄鸽；-，阴性对照。结果表明，pcr反应体系中添加0.3％tween-20，经紫外光照射，pcr发生与否可直接通过肉眼或荧光成像进行区别，如图3左，雌性鸽样本发生pcr反应，荧光信号强，拍照后颜色偏白，而雄性及阴性对照颜色偏暗，区别明显，且与凝胶电泳结果一致。
序列表
<110>金陵科技学院
<120>一种pcr扩增产物的检测方法
<160>4
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
agaacgtggcaacagagtac20
<210>2
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
tgaaatgatccagtgcttgt20
<210>3
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
tcctatgcctaccaccttcc20
<210>4
<211>25
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>4
atgattctaaaacatttgttgtttg25
1.一种pcr扩增产物的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)在pcr反应体系中添加荧光染料和非离子去污剂，然后进行pcr扩增；
其中，所述荧光染料在pcr反应体系中的浓度为0.1×-1×，所述非离子去污剂在pcr反应体系中的体积浓度为0.1％-0.5％；
(2)将步骤(1)得到的体系在紫外灯照射下于暗场肉眼观察或经荧光成像系统照相后观察，通过体系颜色判断pcr扩增产物的有无。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中所述荧光染料为sybrgreeni、溴化乙锭、goldview、gelred、4sredplus、4sgreenplus和genegreen中的任意一种或几种的组合。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中所述非离子去污剂为trionx-100、tween-20、嵌段式聚醚f-127、聚环氧乙烯月桂酰醚和np-40中的任意一种或几种的组合。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述非离子去污剂为np-40。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中所述荧光染料在反应体系中的浓度为0.2×-0.6×，所述非离子去污剂在反应体系中的体积浓度为0.1％-0.3％。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中所述pcr反应体系包括taqdna聚合酶、dna模板、引物、dntp和含mg2 的反应缓冲液。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述dna模板为公鸽或母鸽的dna。
技术总结