技术领域：
本发明涉及生物技术领域，涉及一种血液病毒的检测方法。
背景技术：
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血液生物安全是重大民生和公共安全问题，血液资源的供应安全保障是国家医疗卫生服务体系正常运行的根本保证。我国存在血液供需矛盾和输血传播疾病风险等日益突出的问题，而常规血液病原体四项筛查hbv、hcv、hiv及tp已不能满足临床用血的安全，目前关于血液病毒谱的研究，血液病毒分布情况国内外研究文献相对较少，因此研究高精度血液病原体特别是血液病毒的检测方法，是目前我国亟待解决的问题，也是世界前沿的发展方向。
常规血液病原体四项筛查hbv、hcv、hiv及tp是通过血液酶免的方法或pcr或rt-pcr定量或定性分析病毒核酸确证血液病毒感染的种类，但需要序列特异性抗体或特异性引物才能对病毒抗原或核酸进行检测，由于病毒的变异或低copy样本产生病毒漏检，并且其它可能致病的血液病毒没在常规检测项目内，所以血液病毒宏基因组检测，提取的病毒核酸经过非模板依赖性pcr扩增不仅可以检测已知病毒，而且可以检测未知病毒，大大提高检测灵敏度和特异性。而宏基因组检测的方法主要依赖高通量测序技术的二代和三代测序仪器广泛应用，目前纳米孔测序平台是oxfordnanoporetechnologies(ont)公司的minion纳米孔测序仪，被称为具有发展潜力的第三代测序技术，当下nanopore纳米微孔技术主要用于培养的细菌、病毒或生物基因组的检测，具有单分子测序，核酸长度可超过150kb，测序速度快，测序数据实时监控，机器方便携带等特点。本发明用nanopore三代纳米测序技术应用于血液病毒谱的检测，是个全新的技术领域，存在的核心技术问题是人类宿主核酸的污染和检测需要的目标核酸量大。因此，本发明要解决的核心问题就是，用超速离心和鸡尾酒酶解的方法富集血液样品病毒并去除宿主核酸，然后提取病毒核酸加入已知核酸内参并应用相关的试剂构建测序文库，同时建立本地化的病毒数据库和程序化的生物信息学分析程序，达到实时检测和分析，同时把标准核酸内参作为实验整个流程的质控和灵敏度指标，为高通量血液病毒检测的确证提供了可能性。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种血液病毒的检测方法，该方法用于非诊断目的。
本发明所要解决的关键问题就是用超速离心结合核酸酶解的方法富集血液样品病毒并去除宿主核酸，然后提取病毒核酸并应用相关的试剂建立测序文库，同时建立标准核酸内参作为实验和分析整个流程的质控和灵敏度指标，并建立本地化的病毒数据库和程序化的生物信息学分析程序，达到实时检测和分析血液病毒的目的，为纳米孔血液病毒检测的应用提供了可能性。
本发明所述的检测方法，包括以下步骤：(1)血液样本病毒富集和建库核酸制备和标准核酸内参加入，(2)纳米孔测序文库构建和验证，(3)文库上机及纳米孔实时测序，(4)生物信息学分析等四个步骤。
其中，(1)血液样本病毒富集和建库核酸制备及标准核酸内参加入：基于血液待检测样本病毒富集、病毒核酸提取及建库核酸制备及标准核酸内参加入；
其中，(2)纳米孔测序文库构建和验证：用pcr条码试剂盒(pcrbarcodingkit)构建可用于纳米孔测序的核酸库，并验证；
其中，(3)文库上机及纳米孔实时测序：用nanopore测序试剂盒(如exp-flp002)加入含有混合内参的混合样本库、上机实时检测；
其中，(4)生物信息学分析：首先建立本地的含有300多条reseq标准病毒数据库，从纳米孔测序数据中用guppy软件去barcoder分组，用blastn(参数为e-5到e-10)与本地数据库比，将结果导入megan软件，准确分析血液样本中的病毒组成，标准核酸内参作为评价结果的质控和灵敏度指标。
其中，(1)血液样本病毒富集和建库核酸制备及标准核酸内参加入：针对血液样本待检测样本病毒可能含量低和血液粘度高等特点，本发明采用了一套血液样本病毒富集方法，利用超速离心的方法先富集样品病毒，再用复合的核酸酶消化的方法去除宿主游离的核酸，再提取病毒核酸，接着合成病毒核酸dsdna的方法，最后加入标准核酸内参。
具体地，步骤(1)所述血液样本病毒富集和建库核酸制备，包括以下三个步骤：1)、血浆样本病毒富集和宿主游离核酸去除，2)、提取病毒核酸dna或rna并合成双链dna(dsdna)，3)、病毒核酸纯化和标准内参核酸。
1)、血浆样本病毒富集和宿主游离核酸去除：取健康无临床主要症状成人的含有edta抗凝剂的全血6-8ml，3000g离心15min，取上清即为血浆，血浆再10000g离心10min，去除细胞碎片后，取上述血浆样本0.5-6ml*用hank’s液加到体积为12ml，小心混匀，用sw41转头28800g，4℃离心3h，吸弃上清，加入一定体积的hank’s液，转移到1.5ml离心管中，用核酸酶消化去除宿主细胞核酸。
*代表做不同样本的混合，也可以是单个样本，若每个样本为0.5-6ml，则可以混合1-12个样本，以此类推，因为血液病毒丰度低，混合样本可以节约成本，并可提高病毒的丰度。
2)、提取病毒核酸dna或rna并合成双链dna(dsdna):主要提取dna或rna病毒的核酸包括dna或rna，并将病毒rna转化成更稳定更易保存的cdna，进一步合成双链dna(dsdna)。
3)、病毒核酸纯化和标准内参核酸：纯化第二步获得的病毒核酸，每个核酸样本加入100个copy的标准内参核酸(标准内参核酸本实验室制备，片段大小为3560，含有495bp的插入片段，可以进行pcr确认和定量)，作为整个检测和生物信息分析的质控和灵敏度指标。制备成含标准内参的核酸样本(s-dsdna)用于后续的建库和测序及生物信息分析。
(2)纳米孔测序文库构建和验证
将上述制备的s-dsdna质检定量后，以pcr条码试剂盒(pcrbarcodingkit)构建可用于纳米孔测序的核酸库并用angilent2100核酸电泳验证。
具体地，包括以下步骤：1)、对步骤(1)纯化的病毒核酸准确定量和稀释，2)、dna修复及末端准备，3)、添加条码、放大并验证，4)、混合样品和dna文库。
1)、纯化的病毒核酸准确定量和稀释：用nanodrop对步骤(1)纯化的病毒核酸检测，满足od260/280为1.8-1.9及od260/230为2.2-2.5为符合要求的核酸，用qubit方法对步骤(1)纯化的病毒核酸进行定量，并稀释到100ng/50ul的核酸浓度。
2)、dna修复及末端准备：通过nebnext末端修复/da尾添加模块(nebnextendrepair/da-tailingmodule)进行修复和da尾添加，并用磁珠(agencourtampurexpbeads，beckman)纯化s-dsdna-a.
3)、添加条码、放大并验证：将上述纯化的s-dsdna-a,用pcr条码试剂盒的12对引物来扩增每个样本，每个样本核酸加barcode接头,即为条码后的s-dsdna-a-bc，再用磁珠纯化后,条码后的s-dsdna-a-bc再pcr放大，再用磁珠(agencourtampurexpbeads，beckman)做分选纯化第三步的s-dsdna-a-bc，然后用qubit定量，并用agilent2100跑胶，文库在1k-10k之间，上机测序前稀释成200pg/ul纯化样品。
4)、混合样品和dna文库：计算混合所需样品量，确保混合后样品摩尔数相等且总量介于10-50fmol之间，根据样品计算结果，混合样品至新的1.5ml离心管中，若混池后的体积大于11μl，使用2x的磁珠(agencourtampurexpbeads，beckman)进行纯化浓缩，洗脱至11μl。取1μl定量，取混池的dna样品10μl，加上1μlrap混匀在室温下5min，冰上放置以备上机测序用s-dsdna-a-bc-r-bank。
(3)文库上机及纳米孔实时测序
将步聚(2)连接有测序结头和混合内参的混合样本库,用nanopore测序试剂盒(如exp-flp002)加入进行上机实时检测；
具体地，用步聚(2)连接有测序结头和内参的核酸混库s-dsdna-a-bc-r-bank约30-50fmol，进一步完善上机样品。包括以下步骤：上机文库的准备，nanopore芯片的准备，上机和时实测序。
1)、上机文库的准备：用测序试剂套装，在测序buffer中加上样beads和带有测序结头核酸混库在一个管子里面一步完成上机文库的全部工作。
2)、nanopore芯片的准备：先连接测序仪和电脑，打开测序软件，测序芯片是否合格，若合格，进行芯片的清洗试剂的配制和芯片的清洗，以备下面上机用。
3)、上机和时实测序：主要包括第一步的上机文库75μl，完全加到第二步备好的芯片样品孔中，把芯片连接到测序仪上，设置好文件名和测序程序，选择将电测序信号fast5文件时实转换为核酸序列信息fastq文件，实现时实测序，并随时观察样品测序信息和测序孔的使用情况。
(4)生物信息学分析
首先建立本地的含有300多条reseq标准病毒数据库，从纳米孔测序数据中用guppy软件去barcoder分组，用blastn(参数为e-5到e-10)与本地数据库比，取比对前5的结果导入megan软件，准确分析血液样本中的病毒组成，标准核酸内参作为评价结果的灵敏度指标。
优选的，本发明所述的检测方法，包括以下步骤：
(1)血液样本病毒富集、核酸提取和建库核酸制备
1)血浆样本病毒富集：取健康无临床主要症状成人的含有edta抗凝剂的全血6-8ml，3000g离心15min，取上清即为血浆，血浆再10000g离心10min，去除细胞碎片后，上清0.5-6ml加到超离管中，用hank’s液加到体积为12ml，小心混匀，用天平配平后，选择w41转头，离心速度为28800g，4℃离心2h，小心移去上清，用hank’s液加到管底，然后转移到1.5ml离心管中，用核酸酶消化的方法去除宿主细胞核酸。其中核酸酶包括turbodnase脱氧核糖核酸酶，rnaseone是核糖核酸酶，和nuclease核酸酶，在37℃消化30min。
2)提取病毒核酸dna或rna:用qiagen公司的qiampviralrnaminikit提取dna或rna病毒的核酸,30μlave洗脱，操作按照说明书。用superscripttmivfirst-strandsynthesissystem合成cdna，并用klenow完成上述cdna第二链的合成dsdna，方法按操作说明书。
3)病毒核酸纯化和标准内参核酸：用磁珠(agencourtampurexpbeads，beckman)纯化第2)步获得的病毒核酸，用25μl无核酸酶水回收，每个核酸样本加入100个copy的标准内参核酸(标准内参核酸本实验室制备，片段大小为3560，含有495bp的插入片段，可以进行pcr确认和定量)，作为整个检测和生物信息分析的质控和灵敏度指标。制备成含核酸标准内参的核酸样本(s-dsdna)用于后续的建库和测序及生物信息分析。
(2)纳米孔测序文库构建和验证，大概过程如下：
1)纯化的病毒核酸准确定量和稀释：用nanodrop对步骤(1)纯化的病毒核酸检测，满足od260/280为1.8-1.9及od260/230为附合要求的核酸，用qubit方法对步骤(1)纯化的病毒核酸进行定量，并稀释到100ng/50ul的核酸浓度。
2)dna修复及末端准备：通过nebnext末端修复/da尾添加模块(nebnextendrepair/da-tailingmodule)进行修复和da尾添加，操作按说明书进行，接着用1*磁珠(agencourtampurexpbeads，beckman)纯化，方法参考说明书,并用16μl无rna酶的水回收获得s-dsdna-a。
3)添加条码(adaper)并放大：以pcrbarcodingkit(sqk-pbk004)为例，将上述纯化的s-dsdna-a,用pcr条码试剂盒的12x引物对来扩增每个样本，使每个样本核酸加barcode接头,即为条码后的s-dsdna-a-bc，再用磁珠纯化后,条码后的s-dsdna-a-bc再pcr放大，加adapters后的pcr反应如下：
*依据核酸的片段长度的大小，决定延伸时间，通常酶活性50sec/kb。
pcr产物最后再用0.6比例的磁珠，分选及纯化pcr后带barcode的s-dsdna-a-bc，最后用10μl50mmnacl 10mmtris.hclph8.0洗脱，1μl用qubit定量，用于下面混合样品计算。
4)混池和dna文库：计算混合所需样品量，确保混合后样品摩尔数相等且总量介于10-50fmol之间，根据样品计算结果，混合样品至新的1.5ml离心管中，若混池后的体积大于11μl，使用2x的磁珠(agencourtampurexpbeads，beckman)进行纯化浓缩，洗脱至11μl。取1μl定量，取混池的dna样品10μl，加上1μlrap混匀在室温下5min，冰上放置以备上机测序用s-dsdna-a-bc-r-bank。
(3)文库上机及纳米孔时实测序
1)上机文库的准备：
上机之前制备,并混匀,保证无气泡。
2)nanopore芯片的准备：先连接测序仪和电脑，打开测序软件，测序芯片是否合格，若合格，进行芯片清洗试剂的配制和芯片的清洗，以备下面上机用。
3)上机和时实测序：主要包括第一步的上机文库75μl，完全加到第二步备好的芯片样品孔中(spotonsampleport)，把芯片连接到测序仪上，设置好文件名和测序程序，选择将电测序信号fast5文件时实转换为核酸序列信息fastq文件，实现实时测序，并随时观察样品测序信息和测序孔的使用情况。
(4)生物信息学分析
首先建立本地的含有300多条reseq标准病毒数据库，从纳米孔测序数据中用guppy软件去barcoder分组，用blastn(参数为e-5到e-10)与本地数据库比，取比对前5的结果导入megan软件，准确分析血液样本中的病毒组成，标准核酸内参作为评价结果的灵敏度和质量控制指标。
本发明与现有检测方法相比较，其优点在于：
1)它适用于但不限于人和动物血液病毒的检测与鉴定；
2)本方法的优点是可以实时检测实时分析，达到快速检测的目的，1分钟内的数据分析即可发现血液病毒谱的构成，30分钟内大部分病毒全基因组的分布达到90％以上；
3)血液病毒的富集为血液病毒检测的灵敏度提供了可能性，而核酸标准内参的参入可作为样本检测灵敏度和质控指标；
4)本地数据库的建立和生物信息方法的建立，为快速检测提供软件支持；鉴于本发明的这些优点，它可被用于但不限于献血人群和临床血液样本的精准医学分析、并对新发突发传染病的血液病原学的快速鉴定具有重要意义。
根据实施例1的结果是，图1检测了血液的病毒谱，有参比序列、乙肝病毒和各类细小病毒类，参比可做为检测灵敏度和质控指标，图2代表不同时间内alpha细小病毒和乙肝病毒随时间发现的病毒的检测的序列数量，序列长度在1k到3k之间，以乙肝病毒为例，结果表明1分钟内即可检测血液乙肝病毒20条hbv核酸序列，证明血液感染hbv，10分钟可以检测到172条核酸序列，能够拼接出hbv全核酸序列。相比于二代测序时间至少20个小时以上，只有停机以后才能分析，时间至少24小时，所以本研究说明30分钟内大部分病毒全基因组的分布达到90％以上；可以实时检测分析。
附图说明
图1为一例血液病毒谱的分类图和参比序列图(去除人源基因组后)
图2为血液乙肝病毒和细小病毒的随时间检测的核酸序列数量图。
具体实施方式：
下面通过具体的例子说明本发明的实施方式。本领域技术人员可由本说明书所披露的内容在没有背离本发明的精神下根据具体实例的不同进行分析路径的选择与调整和具体参数的调试都属于本发明的保护范围。
实施例1、检测方法
我们以2015年4月在北京市红十字血液中心采集的24例均为无症状的常规四项检测阴性的成人血液为例按顺序来说明本发明的具体实施方式。
一、血液样本病毒富集、核酸提取和建库核酸制备
1)血浆样本病毒富集：取健康无临床主要症状成人的含有edta抗凝剂的全血6-8ml，3000g离心15min，取上清即为血浆，血浆再10000g离心10min，去除细胞碎片后，上清即为血浆样本0.5-6ml加到超离管中，用hank’s液加到体积为12ml，小心混匀，用天平配平后，选择w41转头，离心速度为28800g，4℃离心2h，小心移去上清，用hank’s液加到管底溶解，并转移到1.5ml离心管中，同时加入turbodnase脱氧核糖核酸酶、nuclease核酸酶及rnaseone核糖核酸酶，然后在37℃，消化30min，以去除宿主细胞核酸。
2)提取病毒核酸dna或rna并合成双链dna:用qiagen公司的qiampviralrnaminikit提取dna或rna病毒的核酸包括的dna或rna,用30μlave洗脱样品中的病毒rna，操作按说明书进行,并将病毒rna用superscripttmivfirst-strandsynthesissystem合成cdna，用klenow合将cdna合成双链dna即dsdna,操作按说明书进行。
3)用磁珠(agencourtampurexpbeads，beckman)纯化第2)步获得的病毒dsdna，用25μl无核酸酶水回收，每个核酸样本加入100个copy的标准内参核酸(标准内参核酸本实验室制备，片段大小为3560，含有495bp的插入片段，可以进行pcr确认和定量)，作为整个检测和生物信息分析的质控和灵敏度指标。制备成含核酸标准内参的核酸样本(s-dsdna)用于后续的建库和测序及生物信息分析。
二、纳米孔测序文库构建和验证：将含核酸标准内参的核酸样本(s-dsdna)用nanopore建库试剂盒进行建库，具体如下：
1)纯化的病毒核酸准确定量和稀释：用nanodrop对步骤(1)纯化的病毒核酸检测，满足od260/280为1.8-1.9及od260/230为附合要求的核酸，用qubit方法对步骤一纯化的病毒核酸s-dsdna进行定量，并稀释到100ng/50ul的核酸浓度。
2)dna修复及末端准备：通过nebnext末端修复/da尾添加模块(nebnextendrepair/da-tailingmodule)进行修复和da尾添加。
执行下列程序：20℃,5min；65℃,5min。
3)纯化：用磁珠(agencourtampurexpbeads，beckman)纯化上步的dna.方法同(1)中的步骤6)病毒核酸纯化,最后用16μl无rna酶的水回收得s-dsdna-a。
4)添加条码(adaper)并放大：以pcrbarcodingkit(sqk-pbk004)按操作说明书进行，获得带barcode的dna，并用用0.6比例的磁珠做分选，最后用10μl50mmnacl 10mmtris.hclph8.0洗脱，1μl用qubit定量,使用agilent2100跑胶，初步判定目标片段的大小，主要用于混合样本后浓度的计算，并稀释成200pg/ul纯化样品s-dsdna-a-bc。
5)混池和dna文库：计算混合所需样品量，确保混合后样品摩尔数相等且总量介于10-50fmol之间，根据样品计算结果，混合样品至新的1.5ml离心管中，若混池后的体积大于11μl，使用2x的纯化磁珠(agencourtampurexpbeads，beckman)进行纯化浓缩，洗脱至11μl。取1μl定量，10μls-dsdna-a-bc加上1μlrap混匀在室温下5min做快速测序结头(adapter)连接，冰上放置以备上机测序用，最终dna文库构建完成11μls-dsdna-a-bc-r。
三、文库上机及纳米孔时实测序
1)上机文库的准备：
上机之前制备,混匀,保证无气泡。
2)nanopore芯片的准备：先连接测序仪和电脑，打开测序软件，测序芯片是否合格，若合格，进行芯片清洗试剂的配制和芯片的清洗，以备下面上机用。芯片的清洗按说明书进行，整个操作避免引入气泡进入芯片
3)上机和实时测序：主要包括第一步的上机文库75μl，完全加到第二步备好的芯片样品孔中(spotonsampleport)，把芯片连接到测序仪上，设置好文件名和测序程序，选择将电测序信号fast5文件时实转换为核酸序列信息fastq文件，实现时实测序，并随时观察样品测序信息和测序孔的使用情况。
四、生物信息学分析
建立本地的含有300多条reseq标准病毒数据库，从纳米孔测序数据中用guppy软件去barcoder分组，用blastn(参数为e-5到e-10)与本地数据库比，取比对前5的结果导入megan软件，准确分析血液样本中的病毒组成，标准核酸内参作为评价结果的灵敏度和质量控制指标。结果见图1，血液中不同时间点的病毒谱，其中发现有乙肝病毒hbv。
1.一种血液病毒的检测方法，该方法用于非诊断目的，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)血液样本病毒富集和建库核酸制备和标准核酸内参加入，(2)纳米孔测序文库构建和验证，(3)文库上机及纳米孔实时测序，(4)生物信息学分析。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，
其中，(1)血液样本病毒富集和建库核酸制备及标准核酸内参加入：基于血液待检测样本病毒富集、病毒核酸提取及建库核酸制备及标准核酸内参加入；
其中，(2)纳米孔测序文库构建和验证：用pcr条码试剂盒构建可用于纳米孔测序的核酸库，并验证；
其中，(3)文库上机及纳米孔实时测序：用nanopore测序试剂盒加入含有混合内参的混合样本库、上机实时检测；
其中，(4)生物信息学分析：首先建立本地的含有300多条reseq标准病毒数据库，从纳米孔测序数据中用guppy软件去barcoder分组，用blastn与本地数据库比，将结果导入megan软件，准确分析血液样本中的病毒组成，标准核酸内参作为评价结果的质控和灵敏度指标。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)所述血液样本病毒富集和建库核酸制备，包括以下三个步骤：1)、血浆样本病毒富集和宿主游离核酸去除，2)、提取病毒核酸dna或rna并合成双链dna(dsdna)，3)、病毒核酸纯化和标准内参核酸。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)所述血液样本病毒富集和建库核酸制备，包括以下三个步骤：1)、血浆样本病毒富集和宿主游离核酸去除：取健康无临床主要症状成人的含有edta抗凝剂的全血6-8ml，3000g离心15min，取上清即为血浆，血浆再10000g离心10min，去除细胞碎片后，取上述血浆样本0.5-6ml*，用hank’s液加到体积为12ml，小心混匀，用sw41转头28800g，4℃离心3h，吸弃上清，加入一定体积的hank’s液，转移到1.5ml离心管中，用核酸酶消化去除宿主细胞核酸，
2)、提取病毒核酸dna或rna并合成双链dna：主要提取dna或rna病毒的核酸包括dna或rna，并将病毒rna转化成更稳定更易保存的cdna，进一步合成双链dna，
3)、病毒核酸纯化和标准内参核酸：纯化第二步获得的病毒核酸，每个核酸样本加入100个copy的标准内参核酸，作为整个检测和生物信息分析的质控和灵敏度指标，制备成含标准内参的核酸样本用于后续的建库和测序及生物信息分析。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，(2)纳米孔测序文库构建和验证，包括以下步骤：1)、对步骤(1)纯化的病毒核酸准确定量和稀释，2)、dna修复及末端准备，3)、添加条码、放大并验证，4)、混合样品和dna文库。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，(2)纳米孔测序文库构建和验证，包括以下步骤：
1)、纯化的病毒核酸准确定量和稀释：用nanodrop对步骤(1)纯化的病毒核酸检测，满足od260/280为1.8-1.9及od260/230为2.2-2.5为符合要求的核酸，用qubit方法对步骤(1)纯化的病毒核酸进行定量，并稀释到100ng/50ul的核酸浓度，
2)、dna修复及末端准备：通过nebnext末端修复/da尾添加模块进行修复和da尾添加，并用磁珠纯化s-dsdna-a.
3)、添加条码、放大并验证：将上述纯化的s-dsdna-a,用pcr条码试剂盒的12对引物来扩增每个样本，每个样本核酸加barcode接头,即为条码后的s-dsdna-a-bc，再用磁珠纯化后,条码后的s-dsdna-a-bc再pcr放大，再用磁珠做分选纯化第三步的s-dsdna-a-bc，然后用qubit定量，并用agilent2100跑胶，文库在1k-10k之间，上机测序前稀释成200pg/ul纯化样品，
4)、混合样品和dna文库：计算混合所需样品量，确保混合后样品摩尔数相等且总量介于10-50fmol之间，根据样品计算结果，混合样品至新的1.5ml离心管中，若混池后的体积大于11μl，使用2x的磁珠进行纯化浓缩，洗脱至11μl，取1μl定量，取混池的dna样品10μl，加上1μlrap混匀在室温下5min，冰上放置以备上机测序用s-dsdna-a-bc-r-bank。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，(3)文库上机及纳米孔实时测序，包括以下步骤：
1)、上机文库的准备：用测序试剂套装，在测序buffer中加上样beads和带有测序结头核酸混库在一个管子里面一步完成上机文库的全部工作，
2)、nanopore芯片的准备：先连接测序仪和电脑，打开测序软件，测序芯片是否合格，若合格，进行芯片的清洗试剂的配制和芯片的清洗，以备下面上机用，
3)、上机和时实测序：主要包括第一步的上机文库75μl，完全加到第二步备好的芯片样品孔中，把芯片连接到测序仪上，设置好文件名和测序程序，选择将电测序信号fast5文件时实转换为核酸序列信息fastq文件，实现时实测序，并随时观察样品测序信息和测序孔的使用情况。
8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，(4)生物信息学分析，包括以下步骤：首先建立本地的含有300多条reseq标准病毒数据库，从纳米孔测序数据中用guppy软件去barcoder分组，用blastn与本地数据库比，取比对前5的结果导入megan软件，准确分析血液样本中的病毒组成，标准核酸内参作为评价结果的灵敏度指标。
9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)血液样本病毒富集、核酸提取和建库核酸制备
1)血浆样本病毒富集：取健康无临床主要症状成人的含有edta抗凝剂的全血6-8ml，3000g离心15min，取上清即为血浆，血浆再10000g离心10min，去除细胞碎片后，上清0.5-6ml加到超离管中，用hank’s液加到体积为12ml，小心混匀，用天平配平后，选择w41转头，离心速度为28800g，4℃离心2h，小心移去上清，用hank’s液加到管底，然后转移到1.5ml离心管中，用核酸酶消化的方法去除宿主细胞核酸，其中核酸酶包括turbodnase脱氧核糖核酸酶，rnaseone是核糖核酸酶，和nuclease核酸酶，在37℃消化30min，
2)提取病毒核酸dna或rna：用qiagen公司的qiampviralrnaminikit提取dna或rna病毒的核酸,30μlave洗脱，操作按照说明书，用superscripttmivfirst-strandsynthesissystem合成cdna，并用klenow完成上述cdna第二链的合成dsdna，方法按操作说明书，
3)病毒核酸纯化和标准内参核酸：用磁珠纯化第2)步获得的病毒核酸，用25μl无核酸酶水回收，每个核酸样本加入100个copy的标准内参核酸，作为整个检测和生物信息分析的质控和灵敏度指标，制备成含核酸标准内参的核酸样本用于后续的建库和测序及生物信息分析，
(2)纳米孔测序文库构建和验证，步骤如下：
1)纯化的病毒核酸准确定量和稀释：用nanodrop对步骤(1)纯化的病毒核酸检测，满足od260/280为1.8-1.9及od260/230为附合要求的核酸，用qubit方法对步骤(1)纯化的病毒核酸进行定量，并稀释到100ng/50ul的核酸浓度，
2)dna修复及末端准备：通过nebnext末端修复/da尾添加模块进行修复和da尾添加，操作按说明书进行，接着用1*磁珠纯化，方法参考说明书,并用16μl无rna酶的水回收获得s-dsdna-a，
3)添加条码并放大：以pcrbarcodingkit为例，将上述纯化的s-dsdna-a,用pcr条码试剂盒的12x引物对来扩增每个样本，使每个样本核酸加barcode接头,即为条码后的s-dsdna-a-bc，再用磁珠纯化后,条码后的s-dsdna-a-bc再pcr放大，加adapters后的pcr反应如下：
4)混池和dna文库：计算混合所需样品量，确保混合后样品摩尔数相等且总量介于10-50fmol之间，根据样品计算结果，混合样品至新的1.5ml离心管中，若混池后的体积大于11μl，使用2x的磁珠进行纯化浓缩，洗脱至11μl，取1μl定量，取混池的dna样品10μl，加上1μlrap混匀在室温下5min，冰上放置以备上机测序用s-dsdna-a-bc-r-bank，
(3)文库上机及纳米孔时实测序
1)上机文库的准备：
上机之前制备,并混匀,保证无气泡，
2)nanopore芯片的准备：先连接测序仪和电脑，打开测序软件，测序芯片是否合格，若合格，进行芯片清洗试剂的配制和芯片的清洗，以备下面上机用，
3)上机和时实测序：主要包括第一步的上机文库75μl，完全加到第二步备好的芯片样品孔中，把芯片连接到测序仪上，设置好文件名和测序程序，选择将电测序信号fast5文件时实转换为核酸序列信息fastq文件，实现实时测序，并随时观察样品测序信息和测序孔的使用情况，
(4)生物信息学分析
首先建立本地的含有300多条reseq标准病毒数据库，从纳米孔测序数据中用guppy软件去barcoder分组，用blastn与本地数据库比，取比对前5的结果导入megan软件，准确分析血液样本中的病毒组成，标准核酸内参作为评价结果的灵敏度和质量控制指标。
10.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)、血液样本病毒富集、核酸提取和建库核酸制备
1)血浆样本病毒富集：取健康无临床主要症状成人的含有edta抗凝剂的全血6-8ml，3000g离心15min，取上清即为血浆，血浆再10000g离心10min，去除细胞碎片后，上清即为血浆样本0.5-6ml加到超离管中，用hank’s液加到体积为12ml，小心混匀，用天平配平后，选择w41转头，离心速度为28800g，4℃离心2h，小心移去上清，用hank’s液加到管底溶解，并转移到1.5ml离心管中，同时加入turbodnase脱氧核糖核酸酶、nuclease核酸酶及rnaseone核糖核酸酶，然后在37℃，消化30min，以去除宿主细胞核酸，
2)提取病毒核酸dna或rna并合成双链dna:用qiagen公司的qiampviralrnaminikit提取dna或rna病毒的核酸包括的dna或rna,用30μlave洗脱样品中的病毒rna，操作按说明书进行,并将病毒rna用superscripttmivfirst-strandsynthesissystem合成cdna，用klenow合将cdna合成双链dna即dsdna,操作按说明书进行，
3)用磁珠纯化第2)步获得的病毒dsdna，用25μl无核酸酶水回收，每个核酸样本加入100个copy的标准内参核酸，作为整个检测和生物信息分析的质控和灵敏度指标，制备成含核酸标准内参的核酸样本用于后续的建库和测序及生物信息分析，
(2)纳米孔测序文库构建和验证：将含核酸标准内参的核酸样本，用nanopore建库试剂盒进行建库，具体如下：
1)纯化的病毒核酸准确定量和稀释：用nanodrop对步骤(1)纯化的病毒核酸检测，满足od260/280为1.8-1.9及od260/230为附合要求的核酸，用qubit方法对步骤一纯化的病毒核酸s-dsdna进行定量，并稀释到100ng/50ul的核酸浓度，
2)dna修复及末端准备：通过nebnext末端修复/da尾添加模块进行修复和da尾添加，
执行下列程序：20℃,5min；65℃,5min，
3)纯化：用磁珠纯化上步的dna.方法同(1)中的步骤6)病毒核酸纯化,最后用16μl无rna酶的水回收得s-dsdna-a，
4)添加条码并放大：以pcrbarcodingkit按操作说明书进行，获得带barcode的dna，并用用0.6比例的磁珠做分选，最后用10μl50mmnacl 10mmtris.hclph8.0洗脱，1μl用qubit定量,使用agilent2100跑胶，初步判定目标片段的大小，主要用于混合样本后浓度的计算，并稀释成200pg/ul纯化样品s-dsdna-a-bc，
5)混池和dna文库：计算混合所需样品量，确保混合后样品摩尔数相等且总量介于10-50fmol之间，根据样品计算结果，混合样品至新的1.5ml离心管中，若混池后的体积大于11μl，使用2x的纯化磁珠进行纯化浓缩，洗脱至11μl，取1μl定量，10μls-dsdna-a-bc加上1μlrap混匀在室温下5min做快速测序结头连接，冰上放置以备上机测序用，最终dna文库构建完成11μls-dsdna-a-bc-r，
(3)文库上机及纳米孔时实测序
1)上机文库的准备：
上机之前制备,混匀,保证无气泡，
2)nanopore芯片的准备：先连接测序仪和电脑，打开测序软件，测序芯片是否合格，若合格，进行芯片清洗试剂的配制和芯片的清洗，以备下面上机用，芯片的清洗按说明书进行，整个操作避免引入气泡进入芯片
3)上机和实时测序：主要包括第一步的上机文库75μl，完全加到第二步备好的芯片样品孔中，把芯片连接到测序仪上，设置好文件名和测序程序，选择将电测序信号fast5文件时实转换为核酸序列信息fastq文件，实现时实测序，并随时观察样品测序信息和测序孔的使用情况，
(4)生物信息学分析
建立本地的含有300多条reseq标准病毒数据库，从纳米孔测序数据中用guppy软件去barcoder分组，用blastn与本地数据库比，取比对前5的结果导入megan软件，准确分析血液样本中的病毒组成，标准核酸内参作为评价结果的灵敏度和质量控制指标。
技术总结