本发明涉及一种前列腺癌术后预测领域，尤其涉及一种前列腺癌术后gs升级的预测方法。
背景技术：
前列腺癌(prostatecancer,pca)是欧美国家男性发病率最高的恶性肿瘤，死亡率仅次于肺癌。随着我国经济水平的提高、人口老龄化加重和饮食结构的改变，pca的发病率和死亡率逐年升高。我国最新癌症统计数据显示前列腺癌已成为男性泌尿生殖系统发病率和死亡率最高的恶性肿瘤。pca正在加速影响着全世界老年男性的生活质量及预期寿命，是泌尿外科领域研究的重点和难点。pca发病发展隐匿，早期可无任何症状，传统观点认为只有肿瘤突破包膜才开始向全身进展，而pca早期就可以发生微转移。随着前列腺特异性抗原(serumprostatespecificantigen,psa)筛查与影像学技术(多参数mri)的发展，特别是近些年来规范化的12针前列腺穿刺活检使越来越多的早期pca被发现后得到了及时的治疗。前列腺穿刺活检被认为pca诊断的金标准，但由于组织取量仅约占前列腺总体积的0.04％，而pca又是多灶性疾病，穿刺的局限性及不同病理医生之间评分差异难免会导致gs(gleasonscore)低估。本研究团队和国外的研究均报道了这一现象，约30～50％患者在前列腺癌根治术(radicalprostatectomy，rp)术后会出现病理gs升级，gs升级的患者预后差。gleason评分系统是由donaldf.gleason在1966年根据2911个pca患者标本通过手描绘出的pca组织生长特征。国际泌尿病理协会(internationalsocietyofurologicalpathology，isup)在2005年根据患者的预后对gs分级系统做了较多修改，使该系该评分真实的反映pca患者的生物学特性。2014年美国的epsteinji团队对20845例rp患者进行长达10年的随访，根据患者的生存状况，提出了更加贴合pca生物学特性的gs评分及分级系统，并获得了fda认可，2016年正式列入aua及nccn指南。项目申请人紧跟知识更新步伐，将gs评分最新进展及评估中国pca人群的预后进行了系统分析，发现rp术后gs升级的pca患者生化复发率(biochemicalrecurrence,bcr)及疾病进展率较未升级者高，差异具有统计学意义。pca的合理治疗得益于术前的准确分期及精准的预后判断。临床上psa检测会受前列腺增生(benignprostatichyperplasia,bph)、尿路侵入性检查、直肠指检、炎症以及射精等因素影响。所以目前指南中以psa、术前穿刺gs评分及影像建立的术前分级评估标准并不能准确反映患者病情程度，导致rp术后患者出现较高的bcr、较快的疾病进展甚至死亡，严重影响患者术前病情准确评估及治疗方案选择。随着分子生物学研究的不断进步，探寻肿瘤早期诊断的分子标记物及其潜在预测价值正被研究者们所重视。与传统的诊断技术相比，分子层面的表达变化早于细胞形态学且决定肿瘤的表型，精准的个性化的治疗基于这些分子水平的差异来决定。因此，寻找与pca发生发展及恶性程度演变密切相关的生物标记物迫在眉睫。特别是有利于为pca患者术前建立准确的病理分级指标，指导pca患者的“个体化”治疗意义重大。
技术实现要素：
针对上述问题，本发明提供一种前列腺癌术后gs升级的预测方法，旨在寻找与pca发生发展及恶性程度演变密切相关的生物标记物。
本发明的提供一种前列腺癌术后gs升级的预测方法，其具体预测方法步骤包括：
步骤一，提取临床肿瘤dna标本，对提取临床肿瘤dna标本进行处理优化；
步骤二，进行焦磷酸测序模板pcr扩增，扩增pcr焦磷酸测序，设计甲基化检测pcr引物和测序引物，将测序引物标记为s。
步骤三，进行焦磷酸测序，将pcr产物与配体亲和介质(英文streptavidinsepharosehpbeads出自amershambiosciences,uppsala,sweden)混合孵育后进行焦磷酸测序，通过焦磷酸检测，得到各病例启动子定量甲基化值；
pcr结束后，使用pyrosequencing提供的试样预处理装置，用20-25μl连有生物素的pcr产物和streptavidinsepharosehpbeads(amershambiosciences,uppsala,sweden)进行单链dna模板的制备。然后，每个样本加入15pmol的测序引物，将准备好的样本放置在psq96ma仪器上，并使用snpreagentkit(pyrosequencingab)进行检测。
步骤四，根据定量甲基化值设定特异性甲基化检测及分析位点。
更进一步地，选定最终甲基化检测及分析位点，最终甲基化检测及分析位点选定为位点-848和-841。
更进一步地，两个位点-848和-841的平均甲基化值进行分析和判断的依据进行前列腺癌术后gs升级的预测。
更进一步地，步骤一中提取临床肿瘤dna标本步骤包括如下步骤：
步骤1.1.1在已脱蜡收集好的显微切割的肿瘤组织中加200ulpbs，加入20ul蛋白酶k，涡旋震荡2分钟。(收集前列腺癌细胞5×106个，方法同前。)
步骤1.1.2加入200ulbufferal，涡旋震荡1分钟，56℃孵育15min。
步骤1.1.3加入等体积乙醇96-100％，涡旋震荡2分钟。
步骤1.1.4将步骤3中的混合物转移至dneasymini离心柱(离心柱至于2ml收集管中)，6000g离心2min。将离心管放于一个新的收集管中，将滤液和用过的收集管丢弃。
步骤1.1.5加入500ulbufferaw1至dneasymini离心柱，6000g离心2min，将离心管放于一个新的收集管中，将滤液和用过的收集管丢弃。
步骤1.1.6加入500ulbufferaw2至dneasymini离心柱，6000g离心2min，将离心管放于一个新的收集管中，将滤液和用过的收集管丢弃。
步骤1.1.7加入500ulbufferae至dneasymini离心柱，室温(20-25℃)孵育2min，6000g离心2min，收集管中即是dna。
更进一步地，步骤一中在提取临床肿瘤dna标本后，对所述临床肿瘤dna标本进行dna纯度检测，取dna样品2μl，1.5％琼脂糖凝胶电泳80v×20min，用凝胶成像系统观察总dna条带，条带完整的话即可证明总dna抽提比较完整。
更进一步地，步骤一中对提取临床肿瘤dna标本进行处理优化步骤包括进行dna修饰,在dna修饰后进行msp检测,具体包括如下步骤：
1.2.1调整dna浓度(500ng，20ul)，加入900ul的水，300ulm-dilutionbuffer,50ulm-dissolvingbuffer到ctconversionreagent管，混合10min。
1.2.2将130ulctconversionreagent加到每20uldna样品中，混匀。
1.2.3将所述样品在98℃孵育10min，64℃孵育2.5h，4℃取出。
1.2.4将600ul的m-dilutionbuffer到zymo-spintmiccolumn柱中。
1.2.5加入样品，盖好盖子，颠倒柱子数次混匀。
1.2.613000g离心30s，将滤液丢弃。
1.2.7加入100ul的m-washbuffer到柱中，13000g离心30s。
1.2.8加入200ul的m-desulphonationbuffer到柱中，室温孵育10-20min,13000g离心30min。
1.2.9加入100ul的m-washbuffer到柱子中，13000g离心30s，重复3次。
1.2.10加入30ul的m-elutionbuffer到柱中，将柱子放在1.5ml离心管中，13000g离心60s后收集dna。
更进一步地，所述步骤二中的进行焦磷酸测序模板pcr扩增，包括如下步骤：pcr引物在上游引物上的5’端标记生物素；设定反应条件为95℃15min；94℃30s；50℃30s，72℃40s读板，45cycles；72℃5min，4℃hold；pcr产物1.5％琼脂糖凝胶电泳分析。
进一步地，焦磷酸测序步骤中包括如下步骤：
步骤3.1将pcr产物与配体亲和介质混合孵育；
步骤3.2将下述反应体系(表3.)在pcr板中用mixer混合20min(离心1500转)，同时准备测序引物，25ulannealingbuffer到pyromarkq24platecontaining3umsequencingprimers；
步骤3.3打开负压，用吸引头在pcr板吸取混合物15-30s。先吸取70％乙醇槽5-10s，washingbuffer槽10s，然后提起吸头让负压继续吸引5-10s，然后关闭负压，把吸头放在含有测序引物的pyromarkq24plate，释放beads到pyromarkq24plate；
步骤3.4，把plate放在80℃孵育2min；
步骤3.5，在cartidge加入dntp，酶与底物，打开测序仪，pyromarkid96system(biotage,uppsala,sweden)withinstrumentsoftware(psq96ma2.1)；
步骤3.6，进行结果判读与分析。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：通过crmp4甲基化检测可尽量避免该类患者因术前gs低估造成的病情误判，可补充建立更为准确的术前分级，指导医师为患者建立精准的治疗方案。与传统的诊断技术相比，表观遗传学中甲基化的差异表达早于肿瘤细胞形态学且决定肿瘤的表型，精准的个性化的治疗基于这些分子水平的差异来决定。特别是有利于为pca患者术前建立准确的病理分级指标，指导pca患者的“个体化”治疗意义重大。
附图说明
图1是临床不同gs评分与crmp4甲基化检测图；
图2是crmp4启动子cpg岛预测图；
图3是前列腺癌crmp4启动子甲基化bsp检测结果图；
图4是crmp4启动子区甲基化位点筛选图；
图5是453例穿刺及术后组织标本crmp4甲基化一致性分析及gs升级分析图；
图6是k-m曲线分析453例gs升级与未升级pca患者生存比较趋势图；
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
本发明提供一种前列腺癌术后gs升级的预测方法，旨在寻找与pca发生发展及恶性程度演变密切相关的生物标记物。
实施例一
本发明的提供一种前列腺癌术后gs升级的预测方法，其具体预测方法步骤包括：
步骤一，提取临床肿瘤dna标本，对提取临床肿瘤dna标本进行处理优化；
步骤二，进行焦磷酸测序模板pcr扩增，扩增pcr焦磷酸测序，设计甲基化检测pcr引物和测序引物，将测序引物标记为s(如表1)。
pcr结束后，使用pyrosequencing提供的试样预处理装置，用20-25μl连有生物素的pcr产物和streptavidinsepharosehpbeads(amershambiosciences,uppsala,sweden)进行单链dna模板的制备。然后，每个样本加入15pmol的测序引物，将准备好的样本放置在psq96ma仪器上，并使用snpreagentkit(pyrosequencingab)进行检测。
步骤三，进行焦磷酸测序，将pcr产物与配体亲和介质(英文streptavidinsepharosehpbeads出自amershambiosciences,uppsala,sweden)混合孵育后进行焦磷酸测序，通过焦磷酸检测，得到各病例启动子定量甲基化值；
步骤四，根据定量甲基化值设定特异性甲基化检测及分析位点。
更进一步地，选定最终甲基化检测及分析位点，最终甲基化检测及分析位点选定为位点-848和-841。
更进一步地，两个位点-848和-841的平均甲基化值进行分析和判断的依据进行前列腺癌术后gs升级的预测。
更进一步地，步骤一中提取临床肿瘤dna标本步骤包括如下步骤：
步骤1.1.1在已脱蜡收集好的显微切割的肿瘤组织中加200ulpbs，加入20ul蛋白酶k，涡旋震荡2分钟。(收集前列腺癌细胞5×106个，方法同前。)
步骤1.1.2加入200ulbufferal，涡旋震荡1分钟，56℃孵育15min。
步骤1.1.3加入等体积乙醇96-100％，涡旋震荡2分钟。
步骤1.1.4将步骤3中的混合物转移至dneasymini离心柱(离心柱至于2ml收集管中)，6000g离心2min。将离心管放于一个新的收集管中，将滤液和用过的收集管丢弃。
步骤1.1.5加入500ulbufferaw1至dneasymini离心柱，6000g离心2min，将离心管放于一个新的收集管中，将滤液和用过的收集管丢弃。
步骤1.1.6加入500ulbufferaw2至dneasymini离心柱，6000g离心2min，将离心管放于一个新的收集管中，将滤液和用过的收集管丢弃。
步骤1.1.7加入500ulbufferae至dneasymini离心柱，室温(20-25℃)孵育2min，6000g离心2min，收集管中即是dna。
更进一步地，步骤一中在提取临床肿瘤dna标本后，对所述临床肿瘤dna标本进行dna纯度检测，取dna样品2μl，1.5％琼脂糖凝胶电泳80v×20min，用凝胶成像系统观察总dna条带，条带完整的话即可证明总dna抽提比较完整。
更进一步地，步骤一中对提取临床肿瘤dna标本进行处理优化步骤包括进行dna修饰,在dna修饰后进行msp检测,具体包括如下步骤：
1.2.1调整dna浓度(500ng，20ul)，加入900ul的水，300ulm-dilutionbuffer,50ulm-dissolvingbuffer到ctconversionreagent管，混合10min。
1.2.8将130ulctconversionreagent加到每20uldna样品中，混匀。
1.2.9将所述样品在98℃孵育10min，64℃孵育2.5h，4℃取出。
1.2.10将600ul的m-dilutionbuffer到zymo-spintmiccolumn柱中。
1.2.11加入样品，盖好盖子，颠倒柱子数次混匀。
1.2.1213000g离心30s，将滤液丢弃。
1.2.13加入100ul的m-washbuffer到柱中，13000g离心30s。
1.2.8加入200ul的m-desulphonationbuffer到柱中，室温孵育10-20min,13000g离心30min。
1.2.10加入100ul的m-washbuffer到柱子中，13000g离心30s，重复3次。
1.2.10加入30ul的m-elutionbuffer到柱中，将柱子放在1.5ml离心管中，13000g离心60s后收集dna。
更进一步地，所述步骤二中的进行焦磷酸测序模板pcr扩增，包括如下步骤：pcr引物在上游引物上的5’端标记生物素；设定反应条件为95℃15min；94℃30s；50℃30s，72℃40s读板，45cycles；72℃5min，4℃hold；pcr产物1.5％琼脂糖凝胶电泳分析。
进一步地，焦磷酸测序步骤中包括如下步骤：
步骤3.1将pcr产物和streptavidinsepharosehpbeads混合孵育；
步骤3.2将下述反应体系(表3.)在pcr板中用mixer混合20min(离心1500转)，同时准备测序引物，25ulannealingbuffer到pyromarkq24platecontaining3umsequencingprimers；
步骤3.3打开负压，用吸引头在pcr板吸取混合物15-30s。先吸取70％乙醇槽5-10s，washingbuffer槽10s，然后提起吸头让负压继续吸引5-10s，然后关闭负压，把吸头放在含有测序引物的pyromarkq24plate，释放beads到pyromarkq24plate；
步骤3.4，把plate放在80℃孵育2min；
步骤3.5，在cartidge加入dntp，酶与底物，打开测序仪，pyromarkid96system(biotage,uppsala,sweden)withinstrumentsoftware(psq96ma2.1)；
步骤3.6，进行结果判读与分析。
实施例二
crmp4甲基化检测方法的建立：
根据crmp4启动子碱基序列预测到crmp4启动子cpg岛(如图2)所示。对crmp4启动子cpg岛所有的潜在位点进行标记并设计甲基化检测特异性引物(如表1)所示。
crmp4基因启动子分析存在2个cpgisland，bsp测序结果显示转移性pca及其淋巴结cpgisland1的存在两个连续甲基化的区域：regiona(甲基化位点-848,-841)和regionb(甲基化位点-690,-680,-678,-674,-671,-665,-660,-658)；而在局限性pca、前列腺增生及正常前列腺组织中这10个位点则未甲基化或有偶发的甲基化。
a：crmp4启动子区存在的两个cpg岛测序峰，tss为转录起始位点。硫化处理并行pcr扩增后cpg位点中甲基化的碱基c保持不变，未甲基化的碱基c变为碱基t。b：转移性前列腺癌cpgisland1存在两个连续甲基化的区域，局限性前列腺癌及非肿瘤组织cpg位点则未甲基化或偶发甲基化。圆圈为cpg位点，黑色实心者即为甲基化的cpg位点，空心者为未甲基化位点。
项目申请人围绕启动子不同位点设计了7对(s1-s7)特异性测序引物，焦磷酸测序后发现s1及s2检测到相关位点甲基化频率较高(如图4-a～b)，s3-s7检测的位点甲基化不明显(如图4-c～f)。同时也为本研究建立pca术前术后标本crmp4甲基化检测奠定了规范的检测流程。
提取临床石蜡组织肿瘤标本dna(dna提取试剂盒qiagen(#69506))，亚硫酸氢盐处理试剂盒(ezdnamethylation-goldtmkit)进行dna修饰后行msp检测，pcr扩增焦磷酸测序，设计检测引物。将pcr产物和streptavidinsepharosehpbeads混合孵育后行焦磷酸测序(上海基因科技有限公司，pyromarkid96system(biotage,uppsala,sweden).targetcpgislandswereevaluatedbyinstrumentsoftware(psq96ma2.1))。焦磷酸检测(上海基因科技有限公司，pyromarkid96system(biotage,uppsala,sweden)，得到各病例crmp4启动子定量甲基化值，为特异性甲基化检测及分析位点。regiona(甲基化位点-848,-841)为最终分析位点。
time-dependent及suvivaltree分析169例gs升级患者穿刺标本crmp4甲基化值与rp术后bcr关系及对应的gs评分。在169例gs升级患者术前crmp4甲基化检测得到各gs分组对应甲基化平均值：gs≤6时crmp4甲基化值9.5％、gs＝3 4时crmp4甲基化值11.5％、gs＝4 3时crmp4甲基化值15.5％、gs≥8时crmp4甲基化值22.5％。对比研究发现穿刺标本gs评分3 3术后升级为3 4、穿刺标本gs评分3 4术后升级为4 3、穿刺标本gs评分4 4术后升级为≥9的患者中crmp4术前术后甲基化值因入组例数问题暂无统计学差异(p＞0.05)。穿刺标本gs评分3 3术后升级为4 3及以上、gs评分3 4术后升级为8分及以上、gs评分4 3术后升级为8分及以上的患者中crmp4术前术后甲基化值有统计学差异(p＜0.05)。在gs评分一致的患者中，crmp4前后的甲基化值无统计学差异。结果提示术前crmp4甲基化检测建立的各gs分组对应的平均值具有预测价值，各穿刺组织gs评分分组中大于平均值时应高度怀疑gs评分存在低估。术前crmp4甲基化检测可尽量避免该类患者因术前gs低估造成的病情误判。
通过随访及k-m曲线分析gs升级的患者对比gs评分一致的患者术后bcr明显升高(p<0.001)。多因素分析显示gs升级是rp术后bcr和肿瘤进展密切相关，相对危险度分别为bcr(hr:2.21(1.45-4.80),p<0.001)、进展(hr:1.67(1.06-3.96),p<0.001)、癌特异性死亡相关性(hr:0.83(0.55-2.08),p＝0.502)(图6)。这一临床现象的发现与crmp4甲基化相关性使该项目的开展意义重大，项目申请人对临床gs升级有了深刻的认识，更为重要的是前期研究明确了gs升级的患者较未升级的患者预后差。
实施例三
进入比如“crmp4”，然后进行基因序列搜索，这时候会搜出来很多不同物种的序列，通常我们做的样本是人的，选择带有人类的标记的即可。
可以看到crmp4这个基因序列是反向的。下拉可以看到如下信息，通常选择第一个genomic(比较公认的序列)，可以查看这个序列的详细情况。一般甲基化都在基因的启动子区域(或第一个外显子区)，所以我们要在这条序列前找到启动子区。通常是在基因序列前再加1000bp的长度。这时候可以在灰色框显示的起止位置修改。通常正向序列直接在将数字减少1000即可，但是前面我们知道这条序列是反向的，所以需要改“to”后面的数字，加上1000进行更新。
核对基因组序列：有时候genebank中的序列会有问题，所以需要将找到的序列提交进行核对一下。
一般第一个结果都是一致性(identity)最高的，100％。这就说明这个序列基本上没问题。注：有时候会出现一致性是百分之九十多的，这时候要点击左边的“details”查看详情，把有snp多态性的位点标记出来，后面设计引物的时候尽量避开这些位点。
预测cpg岛：根据上面核对过的序列，来预测出现的cpg岛。
记下蓝色标记出的横轴线的大概位置，在后续分析cpg岛时可以参考这一段。
转化序列：将核对过的原始序列转化为亚硫酸盐处理过的序列。
甲基化引物设计注意事项：a、先修改psq软件中sequecingprimer的设置参数：将maxprimerlength[bp]值改为25；将maxdistancefromtarget[bp]值改为80或100；将allowprimeroversnp后的方框打钩；b、设计的pcr引物中最好含有较多的转化的t(这样可以对亚硫酸盐处理的效果有个检测：如果亚硫酸盐对样本dna处理完全，那么引物就能完全匹配；如果处理不完全，那么引物与dna间就会不匹配，后续pcr不大会扩增出来)c、通常来说引物都是要全部匹配的，特殊情况下可以人工引进错配。在引物3’-端最后三个碱基一定要匹配，倒数第四个碱基勉强可以错配(对延伸有影响)，第五个可以错配(对延伸影响不大)。d、一般情况下设计的pcr产物长度在一两百bp左右较好，特殊情况下两百多甚至三百也可以。
需要说明的是，本发明的说明书及其附图中给出了本发明的较佳的实施例，但是，本发明可以通过许多不同的形式来实现，并不限于本说明书所描述的实施例，这些实施例不作为对本发明内容的额外限制，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。并且，上述各技术特征继续相互组合，形成未在上面列举的各种实施例，均视为本发明说明书记载的范围；进一步地，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
1.一种前列腺癌术后gs升级的预测方法，其具体预测方法步骤包括：
步骤一，提取临床肿瘤dna标本，对提取临床肿瘤dna标本进行处理优化；
步骤二，进行焦磷酸测序模板pcr扩增，扩增pcr焦磷酸测序，设计甲基化检测pcr引物和测序引物，并对测序引物进行标记；
步骤三，进行焦磷酸测序，将pcr产物与配体亲和介质混合孵育后进行焦磷酸测序，通过焦磷酸检测，得到各病例启动子定量甲基化值；
步骤四，根据定量甲基化值设定特异性甲基化检测及分析位点。
2.如权利要求1所述的一种前列腺癌术后gs升级的预测方法，其特征在于，根据焦磷酸测序后的检测到相关位点甲基化值，选择其中甲基化频率最高的两个点位作为gs升级的预测方法的参考点位。
3.如权利要求2所述的一种前列腺癌术后gs升级的预测方法，其特征在于，根据焦磷酸测序后的检测到相关位点甲基化值，选择其中甲基化频率最高的两个点位的甲基化值的平均值作为析和判断的依据进行前列腺癌术后gs升级的预测。
4.如权利要求1-3任一项所述的一种前列腺癌术后gs升级的预测方法，其特征在于，步骤一中在提取临床肿瘤dna标本后，对所述临床肿瘤dna标本进行dna纯度检测。
5.如权利要求1-3任一项所述的一种前列腺癌术后gs升级的预测方法，其特征在于，所述步骤一中对提取临床肿瘤dna标本进行处理优化步骤包括进行dna修饰,在dna修饰后进行msp检测。
6.如权利要求1-3任一项所述的一种前列腺癌术后gs升级的预测方法，其特征在于，所述步骤二中的进行焦磷酸测序模板pcr扩增，pcr产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳分析。
7.如权利要求1-3任一项所述的一种前列腺癌术后gs升级的预测方法，其特征在于，焦磷酸测序步骤中包括将pcr产物与配体亲和介质混合孵育。
8.如权利要求1-3任一项所述的一种前列腺癌术后gs升级的预测方法，其特征在于，所述测序引物围绕不同位点设计有7对测序引物。
9.如权利要求1所述的一种前列腺癌术后gs升级的预测方法，其特征在于，该方法还包括步骤五：选定最终甲基化检测及分析位点，最终甲基化检测及分析位点选定为位点-848和-841。
10.如权利要求2所述的一种前列腺癌术后gs升级的预测方法，其特征在于，该方法还包括根据两个位点-848和-841的平均甲基化值进行分析和判断的依据进行前列腺癌术后gs升级的预测。
技术总结