本发明涉及生物医药技术领域，涉及一种dna甲基化标志物lpcat1在制备诊断多囊卵巢综合征(pcos)试剂盒中的应用。具体涉及lpcat1基因的表达水平及其启动子区dna甲基化在用于制备研究或检测多囊卵巢综合征的试剂盒中的用途，还提供了用于检测lpcat1基因的表达水平及其启动子区dna甲基化的探针引物。
背景技术：
多囊卵巢综合征(polycysticovarysyndrome,pcos)是育龄女性最常见的内分泌疾病，其症状为高雄激素血症，慢性无排卵和多囊卵巢。它也被认为是女性身体机能障碍的常见原因，常见的临床表现包括多毛症、痤疮、肥胖、月经失调和不孕。它也被认为增加了包括血脂异常、心血管疾病、ii型糖尿病、高胰岛素血症和子宫内膜癌等代谢相关疾病的患病风险。鉴于pcos呈现出的复杂性和特异性，临床上对其具体发病原因及发病的机制尚缺乏明确的结论和定义。从病因学到临床表现和长期预后中的异质性是pcos固有的特征，目前普遍观点认为，pcos是由外部环境因素和遗传因素共同导致的一种涉及多组织多器官的系统性代谢综合征，其相关机制一直是研究的热点和难点。
随着测序技术的飞速发展，精准医学取得了巨大的进步。基于高通量测序的全基因组范围系统性的研究结果表明：表观遗传和转录调控参与了多囊卵巢综合征的发病机制。在伴随有代谢紊乱的pcos患者中，卵巢、卵巢颗粒细胞和脂肪组织的全基因组dna甲基化和转录模式发生了显著变化，这一证据表明，甲基化作为表观遗传调控的重要组成部分之一参与pcos发病机制，这可能是由不良的宫内环境或后天的环境因素如饮食和肥胖引起的。dna甲基化过程中并不伴随基因序列的改变，但其能通过改变染色质结构、dna构象、dna稳定性及dna与蛋白质相互作用方式控制基因的表达。
传统的多囊卵巢综合征诊断主要依靠临床表现、雄激素水平检测和卵巢b超检测。根据鹿特丹eshre/asrm(2003)标准，须满足下述三项中的两项：月经稀发；临床或者生化雄激素过多症；双侧或单侧卵巢多囊样改变和/或体积增大。但上述技术不易检测到症状不明显的多囊卵巢综合征患者，随着生物技术的发展，分子生物标志物为pcos的诊断提供了一种新的途径。目前关于pcos的分子诊断标志物有代谢产物、卵泡数目、snp标记等。关于lpcat1基因启动子区dna甲基化及其表达水平可作为pcos诊断生物标志物的应用尚未见报道。
lpcat1基因编码溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶(lysophosphatidylcholineacyltransferase，lpcat)的亚型，lpcat能在磷脂酰辅酶a(acyl-coa)存在的情况下，在循环中利用磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine，pc)，即卵磷脂，产生溶血磷脂酰胆碱(lysophosphatidylcholines，lpc)，而lpc也可以被lpcat转化回pc，这两条途径是lands循环的一部分，是人体循环合成和降解pc的机制之一。pc是在肝脏中合成的，分泌到血流后，通过脂蛋白相关磷脂酶a2的水解，在各种生理和病理条件下产生lpc。在健康人中，lpc的血清水平为125-143nmol/ml，但在心血管疾病、糖尿病、卵巢癌和肾功能衰竭等病人中，lpc的血清水平会上升。一项针对pcos患者的血清脂质谱研究发现：肥胖伴脂肪肝的pcos患者存在pc代谢异常，导致血清中的pc水平明显升高，同时lpc水平降低；花生四烯酸代谢产生的一系列前列腺素，包括pge2、pgf2a和pgi2的浓度也较低。而非肥胖的pcos患者血清中以上指标均变化不显著，这一现象在pcos大鼠模型中也得到了验证。因此，lpcat1基因甲基化通过调控溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶合成影响pc合成。而磷脂成分的改变，又进而胰岛素信号转导和能量代谢相关膜蛋白的活性，因此本发明人提出了lpcat1作为代谢过程的潜在调节因子，是调节pcos和相关疾病相关复杂途径的潜在分子标志物和靶标。
技术实现要素：
本发明针对现有技术的不足，提供一种dna甲基化标志物lpcat1在诊断多囊卵巢综合征(pcos)试剂盒中的应用。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明提供了一种pcos相关的dna甲基化标志物lpcat1基因。
本发明还提供了一种dna甲基化标志物lpcat1基因在制备诊断pcos试剂盒中的应用。
本发明还提供了一种用于合成lpcat1基因启动子区甲基化的msp引物，包括序列如seqidno.1和seqidno.2所示的引物对和seqidno.1和seqidno.2所示的引物对。
本发明还提供了一种用于扩增lpcat1基因的qpcr引物，包括序列如seqidno.5和seqidno.6所示的引物对。
本发明还提供了一种pcos诊断试剂盒，包括前述的用于合成lpcat1基因启动子区甲基化的msp引物或用于扩增lpcat1基因的qpcr引物。
本发明利用rna-seq和mbd-seq(蛋白质富集全基因组甲基化测序)技术检测pcos患者与正常育龄女性卵巢颗粒细胞，发现可作为潜在标志物的启动子区异常甲基化基因lpcat1；具体处理如下：
1、分别提取pcos患者和正常女性颗粒细胞样品基因组dna和总rna，dna利用超声破碎法进行片段化处理。
2、利用mbd蛋白捕获高cpg甲基化密度的双链dna片段，对颗粒细胞基因组dna的甲基化片段进行富集；随后构建mbd-seq文库并上机测序。
3、利用总rna样品构建rna-seq文库并上机测序。
4、对转录组和甲基化组测序数据分别进行分析，得到pcos颗粒细胞中差异表达基因和差异甲基化的基因启动子区；筛选出表达水平与启动子区甲基化水平呈负相关的基因lpcat1。
本发明进一步利用甲基化特异性的pcr(msp)法在在临床pcos患者和正常组颗粒细胞样品中进行lpcat1基因启动子区甲基化变化的验证：
1、设计并合成lpcat1基因启动子区甲基化的msp引物。引物共两对，一对特异性结合重亚硫酸盐转化后的甲基化dna链(甲基化引物，m)，另一对特异性结合重亚硫酸盐转化后的非甲基化dna链(非甲基化引物，u)。
2、分别提取pcos患者和正常女性颗粒细胞样品基因组dna，重亚硫酸盐转化后利用合成的引物进行pcr。
3、通过凝胶电泳的方法检测两对引物的pcr产物，判断相对于正常对照组，pcos患者颗粒细胞lpcat1基因启动子区甲基化水平变化。
本发明还利用qpcr法在临床pcos患者和正常组颗粒细胞样品中进行lpcat1基因表达水平的验证：
1、设计并合成lpcat1基因的qpcr引物；
2、分别提取pcos患者和正常女性颗粒细胞样品rna；反转录后利用合成的引物进行qpcr，采用相对定量法检测pcos患者和正常女性颗粒细胞样品中lpcat1基因的表达水平变化。
本发明实验证明在正常卵巢颗粒细胞和pcos患者颗粒细胞中lpcat1基因启动子区dna甲基化及其表达产物存在显著差异，据此可将lpcat1基因启动子区dna甲基化及其表达产物作为诊断pcos的生物标志物。
需要说明的是，针对lpcat1基因的表达水平和其启动子区dna甲基化水平进行大规模检测时，还可以使用适用于本领域技术人员已知的、检测生物样品中的rna表达水平和dna甲基化水平的任意技术。例如，利用rna印迹分析、原位杂交、定制芯片等方法检测rna表达水平；利用亚硫酸氢盐测序法、高分辨率熔解曲线法检测dna甲基化水平。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1、本发明首次发现相对于正常组织，lpcat1基因的表达水平和启动子区dna甲基化水平在pcos患者卵巢颗粒细胞中呈现显著性差异，可作为pcos相关的生物标志物，开发为pcos诊断检测试剂盒。
2、本发明通过检测卵巢颗粒细胞样品中的lpcat1基因的表达水平和启动子区dna甲基化水平，可以快速、准确及清楚的确定pcos的发生。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为pcos患者和对照组颗粒细胞样品基因组dna和超声片段化后的基因组dna琼脂糖凝胶电泳结果；其中图1a为pcos患者和对照组颗粒细胞样品基因组dna电泳结果；图1b为pcos患者和对照组颗粒细胞样品超声片段化后的基因组dna电泳结果；图1c为图1a中的dl2000marker分布；图1d为图1b中的50bpdnaladder分布；
图2为平行对照组甲基化富集效率验证结果；
图3为mbd-seq及rna-seq文库的agilent2100bioanalyzer检测结果；其中图3a为mbd-seq的2100结果；图3b为rna-seq的2100结果；
图4为pcos患者和对照组颗粒细胞品总rna琼脂糖凝胶电泳结果；
图5为mbd-seq和rna-seq下机数据利用fastqc软件进行基本的质检结果；其中图5a为mbd-seq原始测序数据fastqc质检结果；图5b为rna-seq原始测序数据fastqc质检结果；
图6为msp验证lpcat1基因启动子区甲基化结果电泳图；其中图6a为pcos患者和对照组颗粒细胞样品中lpcat1基因启动子区msp电泳图；图6b为50bpdnaladder分布图；
图7为pcos患者和对照组颗粒细胞样品中lpcat1基因表达结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变化和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1利用mbd-seq(蛋白质富集全基因组甲基化测序)和rna-seq技术检测pcos患者与正常育龄女性卵巢颗粒细胞dna甲基化和基因表达水平，发现可作为潜在标志物的启动子区异常甲基化基因lpcat1：
1、基因组dna的提取和片段化。
利用axyprep基因组dna小量制备试剂盒，采取柱吸附的方法进行颗粒细胞基因组dna的提取，具体实验操作流程参考使用说明书。
(1)分选并收集颗粒细胞：所有参与者(分为pcos患者组与正常育龄女性组)于黄体中期开始接受促性腺激素释放激素激动剂(gnrha)注射，然后超声监测卵泡大小。当3个或3个以上平均直径为16mm的卵泡存在时，将5000至10000iu的人绒毛膜促性腺激素(hcg)注射到受试者体内。36小时后，超声引导下收集卵母细胞，取卵母细胞周围的颗粒细胞，去除卵母细胞后，用dmem培养基(dulbecco改良的eagle培养基)洗涤2次。将得到的颗粒细胞样品加入离心管中，然后加入350μl1×pbs缓冲液悬浮细胞。
(2)向离心管中加入0.8μlrnasea(试剂盒提供)，置于涡旋混匀仪上振荡15s，室温静置1min。
(3)向离心管中先后加入150μlbufferc-l和8μlproteinasek(试剂盒提供，第一次使用时将蛋白酶k溶解于bufferpk中，用移液器轻柔吹打混匀)。然后立即置于涡旋混匀仪上振荡1min，充分混合均匀。
(4)将离心管放入微型离心机中瞬时离心后，置于56℃金属浴上10min。
(5)向离心管中加入350μlbufferp-d，置于涡旋混匀仪上振荡30s，混合均匀后室温下12000×g离心10min。
(6)将小量制备管(试剂盒提供)置于2ml收集管(试剂盒提供)中，将步骤(5)中的上清液移至小量制备管中，室温下12000×g离心1min。
(7)弃滤液，将小量制备管放回原来的2ml收集管中，向小量制备管中加入500μlbufferw1，室温下12,000×g离心1min。
(8)弃滤液，将小量制备管放回原来的2ml收集管中，加入700μlbufferw2(第一次使用时，按试剂瓶上的指示向bufferw2瓶中加入指定体积的无水乙醇并混合均匀)，室温下12000×g离心1min。
(9)以步骤(8)中同样的方法，用700μlbufferw2再洗涤一次。
(10)弃滤液，将小量制备管放回原来的2ml收集管中，室温下12000×g离心1min。
(11)将步骤(10)离心后的小量制备管放入洁净的1.5ml离心管(试剂盒提供)中，向小量制备管膜中央加入52μleluent(提前加热至65℃)，室温下静置1min。
(12)室温下12000×g离心1min，洗脱得基因组dna。
(13)取1μl步骤(12)制得的基因组dna样品，使用nanodropone超微量分光光度计进行dna的定量检测，测得dna量在500ng至5000ng之间，a260/280均在1.8-2.0之间。
(14)取1μl步骤(12)制得的基因组dna样品，采用水平式琼脂糖凝胶电泳的方式进行dna的完整性检测：配制1％的琼脂糖凝胶，使用0.5×tbe缓冲液作为电泳缓冲液，120v恒压下电泳30min，之后将胶块放置在凝胶成像仪上观察，以其中两位pcos患者和对照组正常女性的颗粒细胞样品基因组dna为例，其中p代表pcos患者，n代表对照组。结果如图1a和所示，表明样品基因组dna完整无降解，可进行后续的实验。
(15)使用covarism220超声波破碎仪对基因组dna进行片段化，超声破碎完成后，将样品从核酸打断管中转移至新的1.5ml离心管中保存。
(16)取1μl步骤(15)保存的样品，采用水平式琼脂糖凝胶电泳的方式进行dna超声破碎后的片段分布检测：配制1％的琼脂糖凝胶，使用0.5×tbe缓冲液作为电泳缓冲液，120v恒压下电泳30min，之后将胶块放置在凝胶成像仪上观察。超声破碎成功的dna样品电泳图应该为集中在200-500bp的片段，以其中两位pcos患者和对照组体检正常女性的颗粒细胞样品基因组dna为例，其中p代表pcos患者，n代表对照组，结果如图1b和1d所示，表明片段化后的dna片段分布在200bp-500bp之间，满足后续mbd蛋白富集甲基化dna片段及建库要求。
2、mbd蛋白进行全基因组dna甲基化片段富集及验证
第一步进行磁珠的准备，主要步骤包括预洗磁珠、mbd-biotin蛋白与磁珠的偶联，磁珠的再次清洗：
(1)用移液器轻柔地吹打重悬dyna
(2)取10μl磁珠至1.5ml离心管中，加入1×bindingbuffer补至100μl，用移液器轻柔地吹打混匀。
(3)将离心管置于磁架上，静置3min富集磁珠，至磁珠全部吸附在管壁上后小心吸去上清。
(4)向离心管中加入1×bindingbuffer100μl重悬磁珠，轻柔吹打混匀。
(5)重复步骤(3)至(4)一次，待用。
(6)用移液器轻柔地吹打混匀mbd-biotin蛋白(商用建库试剂盒提供)，吸取3.5μg(7μl)至一个新的1.5ml离心管中。
(7)向步骤(6)的离心管中加入1×bindingbuffer补足100μl，轻柔吹打混匀。
(8)将步骤(7)的离心管中的mbd-biotin蛋白转移至步骤(5)处理后含磁珠的离心管中，使终体积为200μl。
(9)将离心管口用封口膜密封，置于翻转摇匀仪上，转速900rpm，室温下孵育1h。
(10)将离心管放在磁架上，静置3min富集磁珠，至磁珠全部吸附在管壁上后小心吸去上清。
(11)向离心管中加入100μl1×bindingbuffer，轻柔吹打重悬磁珠。
(12)将离心管口用封口膜密封，置于翻转摇匀仪上，转速900rpm，室温下混匀5min。
(13)重复步骤(10)至(12)2次。
(14)将离心管置于磁架上，静置3min富集磁珠，至磁珠全部吸附在管壁上后小心吸去上清。
(15)加入100μl1×bindingbuffer轻柔吹打混匀，重悬磁珠，得mbd-磁珠。
第二步进行mbd-磁珠与dna样品的结合，在该部分实验中准备由片段化的k-562细胞基因组(试剂盒提供)与合成双链甲基化dna(试剂盒提供)、合成双链非甲基化dna(试剂盒提供)混合成的平行对照组，用于实验后富集效率的质检。
(1)准备平行对照组：准备与样品组dna量一致的片段化的k-562基因组dna，按照每1μgk-562dna加入各10pg的合成双链甲基化dna和合成双链非甲基化dna(使用前，将试剂盒中提供的合成双链甲基化和非甲基化dna1μl稀释于99μl的ddh2o中，终浓度为10pg/μl，现用现配)。
(2)向1.5ml离心管中加入20μl5×bindingbuffer。
(3)将步骤1获得的dna片段和平行对照组分别用ddh2o补至90μl，各取10μl作为不进行甲基化富集的input(起始样品)组，剩余加入步骤(2)的离心管中，吹打混匀，使终体积为100μl。
(4)将离心管中的dna片段和平行对照组分别转入第一步制备的含有mbd-磁珠的离心管中，使终体积为200μl。
(5)将离心管口用封口膜密封，置于翻转摇匀仪上，转速900rpm，室温下孵育1h或4℃过夜孵育。
第三步进行dna片段的洗脱，主要步骤包括mbd-磁珠上未结合的非甲基化dna片段的洗脱，甲基化dna片段的洗脱和乙醇沉降。
(1)将第二步孵育后的离心管放在磁架上，静置3min富集磁珠，至磁珠全部吸附在管壁上。
(2)弃掉含dna片段的离心管中上清。将含平行对照组的离心管上清转移至新的1.5ml离心管，暂存于冰上，标为unbond(未结合的非甲基化dna片段，200μl)。
(3)向步骤(2)去掉上清后的离心管中加入200μl1×bindingbuffer，将离心管口用封口膜密封，置于翻转摇匀仪上，转速900rpm，室温下摇匀3min。
(4)将离心管放在磁架上，静置3min富集磁珠，至磁珠全部吸附在管壁上。
(5)弃掉含dna片段的离心管中上清。将含平行对照组的离心管上清转移至新的1.5ml离心管，暂存于冰上，标为wash(洗液，200μl)。
(6)重复步骤(3)至(5)一遍，合并上清存于冰上(wash，400μl)。
(7)向步骤(6)去掉上清后的离心管中加200μl2mnacl，将离心管口用封口膜密封，置于翻转摇匀仪上，转速900rpm，室温下摇匀3min。
(8)将离心管放在磁架上，静置3min富集磁珠，至磁珠全部吸附在管壁上。
(9)将含dna片段的离心管和平行对照组离心管中的上清分别转移至新的1.5ml离心管中，暂存于冰上，标为elution(甲基化dna片段洗脱液，200μl)。
(10)重复步骤(7)至(9)一遍，合并上清存于冰上(elution，400μl)。
(11)向各去除上清后的离心管中加入2.5×无水乙醇、0.1×naac、1μlglycogen，置于涡旋混匀仪上5s混匀。
(12)将各离心管口用封口膜密封，放入-80℃冰箱中静置2h。
(13)将各离心管放入低温离心机中，4℃下14000g离心1h。
(14)小心吸走上清，加入500ml预冷至-20℃的70％乙醇，4℃下14000g离心5min。
(15)重复步骤(14)一次。
(16)小心吸走上清，打开离心管盖风干3min；
(17)平行对照组各去除上清后的离心管加入10μlddh2o，样品组各去除上清后的离心管加入57μlddh2o，吹打重悬dna。
(18)步骤(17)得到的各样品取2μl进行qubit定量：取200μlqubitbuffer和1μlqubit染料，混合均匀配置成为qubit工作液。然后取qubit管，加入198μlqubit工作液和2μl样品混匀，终体积200μl。室温下避光2min后将qubit工作液和样品的混合液放入校正了标准曲线的qubit定量仪中，选择“dsdna”菜单下的“highsensitivity”选项，读取样品的浓度。将富集后的甲基化dna进行qubit定量，结果表明dna量足够做后续的建库实验(只需5ng以上的dna片段即可)。富集的dna总量约为起始dna量的5％-10％，这一点符合dna甲基化的特点。
第四步利用聚合酶链式反应(pcr)的方法对平行对照组进行质检。将第三步中平行对照组的input组、unbond组、wash组和elution组，分别用合成双链甲基化dna和合成双链非甲基化dna的对应引物进行聚合酶链式反应。
(1)分别取2μl平行对照组-input、平行对照组-unbond、平行对照组-wash和平行对照组-elution，配置如下的pcr体系(检测引物primersformethylation/non-methylationdna由商用建库试剂盒提供)：
(2)pcr反应程序为：
(3)pcr反应完成后，采用水平式琼脂糖凝胶电泳的方式进行合成双链甲基化dna和合成双链非甲基化dna的检测：配制2％的琼脂糖凝胶，使用0.5×tbe缓冲液作为电泳缓冲液，取10μlpcr样品上样，在120v恒压下电泳30min，之后将胶块放置在凝胶成像仪上观察，结果如图2所示，non-methylated与methylated分别代表由非甲基化和甲基化引物扩增出的片段。其中甲基化片段为69bp，均富集于elution组中，即甲基化dna富集后回收得到的样品；非甲基化片段65bp长短，仅存在于input与unbond组中，即在甲基化dna富集过程中弃掉的部分。因此判断样品组的甲基化dna富集成功，样品可用于下一步文库构建实验。
3、构建mbd蛋白富集全基因组甲基化文库
实验采用文库构建试剂盒
每个样品均构建两个文库：甲基化富集后的mbd组和作为background的未进行甲基化富集的input组。
第一步进行甲基化富集片段化dna的末端修复：
(1)在200μlpcr管中混合以下成分：
(2)将200μl移液枪刻度设置为50μl，然后将pcr管中液体上下吹打至少10次，直至完全混匀。
(3)将pcr管置于微型离心机上瞬时离心后放置在pcr仪中，将热盖温度设置为95℃，并运行以下程序：
20℃30min
65℃30min
4℃hold
第二步进行测序接头(adaptor)的连接：
(1)将adaptor(15μm)用10mmtris-hcl稀释10倍至最终浓度1.5μm，现用现配。
(2)将以下成分加入末端修复反应混合物中并混合均匀：
(3)将200μl移液器刻度设置为80μl，然后将pcr管中液体上下吹打至少10次，直至完全混匀。(blunt/taligasemastermix呈粘稠状，为确保连接反应必须保证充分混合)
(4)将pcr管放入pcr仪中，在20℃下孵育15分钟。
(5)向pcr管中进一步加入3μlusertm酶。
(6)将pcr管中液体上下吹打至混合均匀，放入pcr仪中，将热盖温度设置为47℃，在37℃下孵育15分钟。
第三步使用ampurexp磁珠进行连接体系的纯化，得纯化后的片段化dna：
(1)将存放在4℃冰箱的ampurexp磁珠取出，放入超净台中静置至少30min恢复至室温，之后放在涡旋仪上5s混匀。
(2)取1×连接体系体积的磁珠(86.5μl)至1.5ml离心管中，加入第二步(6)处理后的样品液，置于涡旋仪上5s混匀，瞬时离心后(在磁珠开始沉降之前停止离心)，室温下静置孵育5min。
(3)将离心管置于磁力架上，磁力富集至少5min，待溶液澄清后小心吸走上清(注意不要扰动磁珠)。
(4)向置于磁力架上的离心管中加入200μl新鲜配制的80％乙醇，静置30s，小心吸走乙醇(注意不要扰动磁珠)。
(5)重复步骤(4)一次。
(6)将1.5ml离心管瞬时离心后放回磁架上，用10μl移液器吸出残留的乙醇(注意不要扰动磁珠)。
(7)打开离心管盖，待磁珠表面液体风干(注意此步磁珠不能过干)。
(8)将离心管从磁力架上取下，加入16μl10mmtris-hcl(ph＝8.0)，置于涡旋仪上5s混匀，瞬时离心后(在磁珠开始沉降之前停止离心)，室温下静置孵育2min。
(9)将离心管放回磁力架上，磁力富集至少5min，待溶液澄清后小心将上清转移至新的1.5ml离心管中(注意不要扰动磁珠)。
第四步将纯化后的片段化dna进行文库的pcr扩增，在此步中同时将测序用的p5/p7接头连接到dna片段上：
(1)在200μlpcr管中混合以下成分(indexprimer/i7primer和universalpcrprimer/i5primer由建库试剂盒提供)：
(2)将200μl移液枪刻度设置为40μl，然后将pcr管中液体上下吹打至少10次，直至完全混匀。
(3)将pcr管进行瞬时离心后放置在pcr仪中，将热盖温度设置为95℃，并运行以下程序：
第五步为了去除文库中的接头二聚体，并且筛选插入片段长度最理想的文库片段，使用跑胶后切胶，利用axyprepdna凝胶回收试剂盒来进行胶回收法纯化文库：
(1)配制2％的琼脂糖凝胶，使用0.5×tbe缓冲液作为电泳缓冲液，取前述的第四步得到的全部pcr样品上样，用50bpladder作电泳marker在120v恒压下电泳30min，之后将胶块放置在凝胶成像仪上观察片段大小分布。
(2)在紫外灯切胶台下切下300-600bp范围的胶块(尽量远离二聚体所在位置)，用无尘纸吸尽胶块表面液体，洁净刀片切成小碎块后装入1.5ml离心管中。
(3)记录1.5ml离心管重量，再称量装有胶块的1.5ml离心管重量，算出胶块的重量。
(4)依据胶块重量估算胶块体积(100mg＝100μl体积)，向离心管中加入3×胶块体积的bufferde-a，混合均匀后置于75℃恒温金属浴中加热，每2min取出上下颠倒混匀，并观察凝胶块是否完全熔化，整个过程约7min。
(5)向离心管中加入0.5×bufferde-a体积的bufferde-b，加入后混合物呈黄色，充分混匀以形成均一的黄色溶液。
(6)将dna制备管置于2ml收集管(试剂盒内提供)中，吸取并转移步骤(5)中的混合液到dna制备管中，室温下12000×g离心1min，弃滤液。
(7)将dna制备管放回收集管中，向dna制备管中加入500μlbufferw1，室温下12000×g离心30s，弃滤液。
(8)将dna制备管放回收集管中，向dna制备管中加入700μlbufferw2(第一次使用前按试剂瓶上的指示加入一定体积无水乙醇)，室温下12000×g离心30s，弃滤液。
(9)重复步骤(8)一次。
(10)将dna制备管置回收集管中，室温下12000×g离心1min后弃滤液。
(11)将dna制备管置于新的1.5ml收集管(试剂盒内提供)中，向dna制备管的膜中央加预热至65℃的eluent25μl，室温静置1min。
(12)室温下12000×g离心1min，将除去接头二聚体的合适片段长度的文库dna洗脱到收集管中。
(13)取2μl除去接头二聚体的合适片段长度的文库dna样品进行qubit定量。
(14)取1μl除去接头二聚体的合适片段长度的文库dna样品进行2100检测文库片段大小分布，实验操作按照说明书进行。主要步骤包括，将染料和凝胶混匀并过滤；取出芯片，将配好的混合物加入芯片中，然后在芯片中再加入dnaladder，放在配套的混匀仪上，涡旋混匀；清洗电极，将加好样品和dnamarker的芯片放入2100仪器中；在电脑上设置好软件参数，开始运行；结束后导出实验结果并注意清洗电极。符合上机要求的文库片段应该不存在120bp大小左右的引物二聚体片段，且为了适应2×150bp测序的要求，文库主体最短不适于短于300bp，最长不适于超过1000bp。结果如图3a所示。以其中三位pcos患者和对照组正常女性的颗粒细胞样品文库为例，其中p代表pcos患者，n代表对照组。结果均表明文库质量良好，可用于进行下一步数据分析。
4、颗粒细胞样品总rna样品提取
采用trizol说明书中分离rna的方法进行总rna的提取，具体步骤如下：
(1)将保存于-80℃的颗粒细胞样品取出，加入1mltrizol后将离心管在室温下平衡5min；
(2)向离心管中加入200ml氯仿，盖好管盖，置于涡旋混匀仪上15s，室温下静置5min，4℃条件下12000×g离心15min。
(3)离心过后可看见明显的分层现象，小心吸取上清的无色水相，转移至新的1.7mldnase/rnasefree离心管中。
(4)向离心管中加入500ml异丙醇，置于涡旋混匀仪15s，在室温下静置10min，4℃条件下12000×g离心10min，此时可见管底有白色的总rna沉淀。
(5)小心弃去上清，加入1ml预冷于4℃的75％乙醇，用移液器混匀吹起沉淀，4℃条件下7500×g离心5min。
(6)小心弃去上清，打开管盖，晾干约5min(不应超过10min)，直至观察到沉淀表面干燥，然后加入适量的dnase/rnase-free无菌水溶解rna沉淀，保存于-80℃备用。
完成总rna的提取后，使用nanodropone超微量分光光度计对总rna进行定量，之后用琼脂糖凝胶电泳检测rna的完整性。
a.对总rna进行定量的方法如下：取1μl样品，使用nanodropone超微量分光光度计进行总rna的定量检测：首先，在“主页”屏幕上，选择核酸选项卡并点击rna选项。然后取1μl空白检测溶液(此处为dnase/rnase-free无菌水)点样至下基座探头上，降下检测臂，点击空白检测并等待检测完成。之后，抬起检测臂，用新的低尘精密擦拭纸擦拭上下基座，然后取1μl样品点样至下基座探头上，然后降下检测臂并点击检测。检测完成后，记录数据并抬起检测臂，用新的抹布擦拭上下基座后结束实验。
质量较好的总rnaa260/280＝2.0-2.2，若偏高则有可能是存在rna降解，可能需要再次进行rna的抽提。若偏低，则可能存在dna或者蛋白质的污染。高质量的总rna的a260/230＝2.0-2.5，若偏低表示可能是有残余的有机溶剂或盐离子。存在以上污染则该样品总rna不能用于后续分析，需要进行进一步纯化。
b.琼脂糖凝胶电泳检测rna的完整性:清洗干净凝胶电泳所用的电泳槽、胶槽、胶板、胶梳以及配胶用的锥形瓶，喷洒rna酶抑制剂并擦干，必须与dna凝胶电泳所用器材分开。
采用的电泳缓冲液为0.5×tbe，120v恒压电泳15min，之后在凝胶成像仪上观察。结果如图4所示。图4展示了其中2个pcos组和2个对照组的样品凝胶电泳胶图，其中p代表pcos患者，n代表对照组。结果表明样品中的28s、18s条带均清晰可见，且亮度28s＞18s，满足后续rna-seq技术和mirna-seq技术建库要求。5s条带略有模糊，但是结合nanodrop结果分析，rna并没有发生降解。电泳时使用的琼脂糖凝胶不是专门用于rna电泳的琼脂糖变性胶，有可能是在电泳时发生了rna的部分降解。
5、构建rna-seq文库
实验采用kapastrandedrna-seq文库构建试剂盒进行rna-seq文库的构建，具体步骤参考其说明书。
第一步是进行总rna的片段化。
(1)向pcr管中加入约400ng总rna样品(步骤4制得)，稀释至总体积为10μl。
(2)向pcr管中加入10μl的2×fragment,primeandelutebuffer，混合均匀后，将管放入pcr仪中，94℃孵育6min。
第二步是进行cdna第一链的合成。
(1)在pcr管中配一链合成体系如下：
(2)取10μl一链合成体系加入20μl体积的样本管(即前面的第一步孵育后获得的含片段化rna的pcr管)中，总体积30μl。吹打至完全混匀。
(3)将步骤(2)的pcr管置于微型离心机上瞬时离心后放置在pcr仪中，将热盖温度设置为95℃，并运行以下程序：
第三步是进行cdna第二链的合成和标记。
(1)在pcr管中配二链合成和标记体系如下：
(2)取30μl二链合成和标记体系加入现30μl体积的样本管(即前面的第二步pcr后形成的含一链合成体系的pcr管)中，总体积40μl，吹打至完全混匀。
(3)将pcr管置于微型离心机上瞬时离心后放置在pcr仪中16℃孵育60min。
第三步是利用ampurexp磁珠进行第二链的合成和标记体系的纯化。
(1)将存放在4℃冰箱的ampurexp磁珠取出，放入超净台中静置至少30min恢复至室温，之后放在涡旋仪上5s混匀。
(2)取1.8×二链合成和标记体系体积的磁珠(108μl)至1.5ml离心管中，加入样品液(第二步孵育后的二链合成和标记体系溶液)，置于涡旋仪上5s混匀，瞬时离心后(在磁珠开始沉降之前停止离心)，室温下静置孵育5min。
(3)将离心管置于磁力架上，磁力富集至少5min，待溶液澄清后小心吸走上清(注意不要扰动磁珠)。
(4)向置于磁力架上的离心管中加入200μl新鲜配制的80％乙醇，静置30s，小心吸走乙醇(注意不要扰动磁珠)。
(5)重复步骤(4)一次。
(6)将pcr管瞬时离心后放回磁架上，用10μl移液器吸出残留的乙醇(注意不要扰动磁珠)。
第四步是加da尾。
(1)在pcr管中配置加da尾体系如下
(2)用30μl加da尾体系加入装有纯化磁珠的离心管中，置于涡旋仪上5s重悬，瞬时离心(在磁珠开始沉降之前停止离心)后转移至pcr管中。
(3)将pcr管放置在pcr仪中运行如下程序：
30℃30min
60℃30min
4℃∞
第五步是进行测序接头连接。
(1)在pcr管中配置测序接头连接体系如下：
(2)向pcr管中按下表加入样本：
(3)用移液器吹打混合均匀后，将pcr管放置在pcr仪中20℃孵育15min，得连接体系。
第六步是连接后第一次纯化。
(1)将第五步制得的连接体系转移至1.5ml离心管中。
(2)向离心管中加入70μlpeg/naclsolution(1×)，置于涡旋仪上5s混匀，瞬时离心后(在磁珠开始沉降之前停止离心)，室温下静置孵育5min。
(3)将离心管置于磁力架上，磁力富集至少5min，待溶液澄清后小心吸走上清(注意不要扰动磁珠)。
(4)向置于磁力架上的离心管中加入200μl新鲜配制的80％乙醇，静置30s，小心吸走乙醇(注意不要扰动磁珠)。
(5)重复步骤(4)一次。
(6)将1.5ml离心管瞬时离心后放回磁架上，用10μl移液器吸出残留的乙醇(注意不要扰动磁珠)。
(7)将离心管从磁力架上取下，加入50μl10mmtris-hcl(ph＝8.0)，置于涡旋仪上5s混匀，瞬时离心后(在磁珠开始沉降之前停止离心)，室温下静置孵育2min，完成第一次纯化。
第七步是连接后第二次纯化
(1)向第六步第一次纯化后的离心管中加入50μlpeg/naclsolution(1×)混匀，置于涡旋仪上5s混匀，瞬时离心后(在磁珠开始沉降之前停止离心)，室温下静置孵育5min。
(2)将离心管置于磁力架上，磁力富集至少5min，待溶液澄清后小心吸走上清(注意不要扰动磁珠)。
(3)向置于磁力架上的离心管中加入200μl新鲜配制的80％乙醇，静置30s，小心吸走乙醇(注意不要扰动磁珠)。
(4)重复步骤(3)一次。
(5)将1.5ml管瞬时离心后放回磁架上，用10μl移液器吸出残留的乙醇(注意不要扰动磁珠)。
(6)将离心管从磁力架上取下，加入22μl10mmtris-hcl(ph＝8.0)，置于涡旋仪上5s混匀，瞬时离心后(在磁珠开始沉降之前停止离心)，室温下静置孵育2min。
(7)将离心管放回磁力架上，磁力富集至少5min，待溶液澄清后，小心将20μl上清转移至新的pcr管中(注意不要扰动磁珠)，得纯化后的连接体系。
第八步是文库的pcr扩增。
(1)在pcr管中配置pcr扩增体系如下(libraryamplificationprimermix由建库试剂盒提供)：
(2)用移液器吹打混合均匀后取30μl加入第七步含纯化后的连接体系的pcr管中。
(3)将pcr管置于微型离心机上瞬时离心后放置在pcr仪中，反应程序如下：
第九步是pcr扩增体系纯化。
(1)向离心管(前述第八步中进行了pcr反应后的pcr管)中加入45μl(0.9x)ampurexp磁珠混匀，置于涡旋仪上5s混匀，瞬时离心后(在磁珠开始沉降之前停止离心)，室温下静置孵育5min。
(2)将离心管置于磁力架上，磁力富集至少5min，待溶液澄清后小心吸走上清(注意不要扰动磁珠)。
(3)向置于磁力架上的离心管中加入200μl新鲜配制的80％乙醇，静置30s，小心吸走乙醇(注意不要扰动磁珠)。
(4)重复步骤(3)一次。
(5)将pcr管瞬时离心后放回磁架上，用10μl移液器吸出残留的乙醇(注意不要扰动磁珠)。
(6)将离心管从磁力架上取下，加入22μl10mmtris-hcl(ph＝8.0)，置于涡旋仪上5s混匀，瞬时离心后(在磁珠开始沉降之前停止离心)，室温下静置孵育2min。
(7)将离心管放回磁力架上，磁力富集至少5min，待溶液澄清后小心将20μl上清转移至新管中(注意不要扰动磁珠)，得文库样品。
最后将文库样品进行2100检测，具体的操作方法与mbd-seq文库构建中的2100质检步骤相同，结果如图3b所示。以其中三位pcos患者和对照组正常女性的颗粒细胞样品文库为例，其中p代表pcos患者，n代表对照组，结果均表明文库质量良好，可用于进行下一步数据分析。
6、上机测序及数据分析
1)上机测序
mbd-seq和rna-seq文库经illuminahiseqxten平台进行双端测序后得到原始数据，首先经过fastqc进行初步的质量检测，从而对产出的数据质量进行初步的整体评估，检测结果如图5所示。mbd-seq和rna-seq下机数据利用fastqc软件进行基本的质检，fastqc结果中黄色柱代表25％-75％的数据分布，只有其质量分数在30(代表测序错误率为千分之一)以上的数据才可以进行下一步分析。图5a和5b分别展示了mbd-seq和rna-seq其中一个样品文库下机数据的质检结果。结果显示，测序的下机数据中1-150位碱基质量分数均位于30以上，表示该数据质量良好。
2)数据分析
mbd-seq测序的原始数据经过读取和过滤低质量序列后利用bowtie2比对到参考基因组上(humanhg38)。使用r软件包medips(v1.24.0)对pcos和对照组的dna甲基化数据集进行分析比较。满足|log2差异倍数|≥1和p值<0.05的被认为是差异甲基化区域。
rna-seq测序数据在预处理后，使用hisat2(v2.0.5)比对到ucsc人的参考基因组hg38上。然后使用stringtie(v1.3.3)程序根据来自gencoderelease31(grch38.p12)的ensembl进行基因注释。最后的未标准化计数通过r软件(v3.6.0)组装成一个计数矩阵，利用r包deseq2(v1.24.0)和edger(v3.26.5)分别进行差异表达分析。deseq2和edger得出差异表达基因(differentialexpressedgenes，degs)的交集被用作进行下一步分析，筛选所用的阈值为|log2差异倍数|≥1、p值<0.05。
对转录组和甲基化组测序数据分别进行分析，得到pcos颗粒细胞中差异表达基因和差异甲基化的基因启动子区，最终筛选出表达水平与启动子区甲基化水平呈负相关的基因lpcat1。与正常组颗粒细胞样品相比，pcos患者颗粒细胞样品中，lpcat1基因启动子区出现显著高甲基化，转录水平显著下调。
实施例2利用甲基化特异性的pcr(msp)法在在临床pcos患者和正常组颗粒细胞样品中进行lpcat1基因启动子区甲基化变化的验证：
1、基因组dna的抽提与质检
具体的操作方法与实施例1中步骤1的基因组dna抽提与质检步骤(步骤(1)-(14))相同。
2、利用ezdnamethylation-goldtmkit对颗粒细胞基因组dna(gdna)进行重亚硫酸盐转化，取20ulgdna样品，按照zymoezbs转化试剂盒说明书操作，20ulelutionbuffer洗脱。
3、用pcr的方法检测m和u两对引物的pcr扩增产物：
(1)取200ulpcr管置于冰上，配置反应体系如下：
(2)压紧盖板，充分混匀后瞬离，轻轻弹击管壁以除去气泡，再次离心。
(3)将pcr仪程序设定如下：
其中根据预实验确定的最佳退火温度，将grad.temp.设置为47-58℃，将pcr管分别置于对应温度的孔中。
(4)pcr结束后取10ul产物(即为以甲基化的lpcat1基因片段为模板，分别利用甲基化、非甲基化引物进行pcr后的产物)加入2ulloadingbuffer进行2％凝胶电泳检测扩增产物。如果m引物扩增条带的亮度明显高于u引物扩增条带的亮度，则证明目标区域为高甲基化，如果u引物扩增条带的亮度明显高于m引物扩增条带的亮度则证明目标区域为低甲基化。结果如图6所示，与正常组相比，pcos患者颗粒细胞lpcat1基因启动子区出现明显高甲基化。pcos组m引物扩增条带的亮度明显高于u引物扩增条带的亮度，且条带清晰而特异性好，证明目标区域在pcos组中高甲基化。而对照组中u引物扩增条带的亮度明显高于m引物扩增条带的亮度，且条带清晰而特异性好，证明目标区域在对照组中低甲基化。与对照组相比，lpcat1基因的启动子区在pcos组颗粒细胞中呈现显著高甲基化，这与我们之前的高通量测序数据分析结果一致。
·下表为实验中用到的msp引物序列：
实施例3、利用qpcr法在临床pcos患者和正常组颗粒细胞样品中进行lpcat1基因表达水平的验证：
1、总rna的抽提与质检
具体的操作方法与实施例1中步骤4的总rna抽提与质检步骤相同。
2、总rna的反转录
使用takara公司的primescripttmrtreagent试剂盒对步骤1提取的总rna进行反转录，包括去除基因组dna和反转录两个过程，具体步骤如下所示：
(1)去除总rna样品中的基因组dna，体系配方如下所示：
置于pcr仪中进行反应，42℃反应2min。
(2)反转录反应
将去除gdna后的总rna样品转移至pcr管中，在冰上配置mrna反转录体系，配方如下所示(oligodtprimer和random6mers为常规反转录试剂盒提供的引物)：
轻柔混匀后立即置于pcr仪中进行反转录反应，反应条件为:
45℃15min
85℃5sec
4℃5min
3、进行qpcr反应体系配置。
(1)取4ul由第2步反转录反应所得的rna-qpcrcdna稀释20倍，配成模板母液。
(2)每个样品各准备一个pcr管，向其中分别加入对应的9.6ul模板液、6.4ul(f r)引物(10um，序列为seqidno.5和seqidno.6)、16ulqpcrmix(thermofisherpowerupsybrqpcrmastermix)，以actb作为内参基因(引物序列如seqidno.7和seqidno.8所示)。
(3)混匀后，分别加入8连管上的3个平行孔中，每孔10ul。压紧盖板，充分混匀后瞬离，轻轻弹击管壁以除去气泡，再次离心。之后置于steponeplusreal-timepcrsystem中，设定程序并进行qpcr反应，反应程序如下：
4、qpcr数据分析
qpcr反应完成之后对获得的数据进行lpcat1基因的相对表达量分析，具体计算过程如下：
δct(pcos)＝ct(pcos)-ct(pcosactb)
δct(对照组)＝ct(对照组)-ct(对照组actb)
δδct＝δct(pcos)-δct(对照组)
目的基因的表达量的倍数变化的相对表达量＝2(-δδct)做图展示lpcat1基因表达水平变化，结果如图7所示。在临床pcos患者和正常组颗粒细胞样品中验证lpcat1基因的表达水平相对变化，相对于正常组，lpcat1基因在pcos颗粒细胞中表达显著下调，与其启动子区甲基化水平呈负相关(*代表p值小于0.05)。
下表为实验中用到的qpcr引物序列：
综上所述，lpcat1基因的表达水平和启动子区dna甲基化水平在pcos患者卵巢颗粒细胞中呈现显著性差异，可作为pcos相关的生物标志物，开发为pcos诊断检测试剂盒。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。
序列表
<110>上海交通大学
<120>dna甲基化标志物lpcat1在制备诊断pcos试剂盒中的应用
<130>kag43497
<160>8
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>25
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
atgaaggaattaatagggttagtcg25
<210>2
<211>25
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
aataaaataaactcctacctccgaa25
<210>3
<211>25
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
tgaaggaattaatagggttagttgg25
<210>4
<211>25
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>4
aataaaataaactcctacctccaaa25
<210>5
<211>23
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>5
ggggttggttaggtggtttaaat23
<210>6
<211>25
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>6
acaaccactaaaacacaaaaatccc25
<210>7
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>7
ggacttcgagcaagagatgg20
<210>8
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>8
agcactgtgttggcgtacag20
1.一种pcos相关的dna甲基化标志物lpcat1基因。
2.一种dna甲基化标志物lpcat1基因在制备诊断pcos试剂盒中的应用。
3.一种用于合成lpcat1基因启动子区甲基化的msp引物，其特征在于，包括序列如seqidno.1和seqidno.2所示的引物对和seqidno.1和seqidno.2所示的引物对。
4.一种用于扩增lpcat1基因的qpcr引物，其特征在于，包括序列如seqidno.5和seqidno.6所示的引物对。
5.一种诊断pcos试剂盒，其特征在于，包括权利要求3所述的用于合成lpcat1基因启动子区甲基化的msp引物或用于扩增lpcat1基因的qpcr引物。
技术总结