本发明涉及生物医药技术领域，涉及一种dna甲基化标志物pcyt1a在制备诊断多囊卵巢综合征(pcos)试剂盒中的应用。具体涉及pcyt1a基因的表达水平及其启动子区dna甲基化在用于制备研究或检测多囊卵巢综合征的试剂盒中的用途，还提供了用于检测pcyt1a基因的表达水平及其启动子区dna甲基化的探针引物。
背景技术：
多囊卵巢综合征(polycysticovarysyndrome,pcos)是育龄妇女常见的内分泌系统疾病。该疾病最常见的临床表现是女性出现高雄激素血症，导致月经紊乱、稀少、闭经或不规则阴道出血、不孕、肥胖、多毛、子宫内膜过度增生及恶性变化、以及双侧或单侧卵巢呈多囊性改变并多伴有肥胖表型；在糖脂内分泌代谢方面出现胰岛素抵抗，继而引发糖尿病等并发症，远期并发症还包括、心血管疾病、子宫内膜癌等。表观遗传调控被认为是pcos发病机制中的重要一环，逐渐成为研究的热点和重点方向之一。dna甲基化(dnamethylation)是最早发现的基因表观修饰方式之一,也是表观遗传学中最常见和重要的修饰之一，对基因表达调控、x染色体失活、基因组印迹、胚胎发育等有非常重要的作用。在最新研究显示，pcos患者的卵泡、卵巢颗粒细胞及脂肪组织等中的dna甲基化模式均发生了改变，并与转录组变化呈线性相关。这一证据表明，甲基化作为表观遗传调控的重要组成部分之一参与pcos发病机制，可能是由不良的宫内环境或后天的环境因素如饮食和肥胖引起的。
pcos中已知的dna甲基化异常与脂质代谢和类固醇合成异常、高雄激素水平及排卵障碍有关。研究表明，与脂质和类固醇合成相关的cd9、bnip3、lif和nr4a1基因的启动子区低甲基化可能调节基因的表达，促进包括雄激素在内的类固醇激素的合成。高雄激素血症还被证明通过改变pcos患者颗粒细胞中pparg1、ncor1和hdac3基因的甲基化水平，下调了pparg1的表达，并促进了其阻遏子ncor1和hdac3的上调，参与介导卵巢功能障碍。cyp19a1基因编码雌激素生成关键酶，其在pcos卵巢中的表达由于启动子的高甲基化而被抑制，引起下游细胞色素p450的异常转录和翻译，间接地影响雌激素、雄激素水平，是高雄激素水平、排卵障碍并最终导致pcos的发生的一个重要原因。
传统的多囊卵巢综合征诊断主要依靠临床表现、雄激素水平检测和卵巢b超检测。根据鹿特丹eshre/asrm(2003)标准，须满足下述三项中的两项：月经稀发；临床或者生化雄激素过多症；双侧或单侧卵巢多囊样改变和/或体积增大。但上述技术不易检测到症状不明显的多囊卵巢综合征患者，随着生物技术的发展，分子生物标志物为pcos的诊断提供了一种新的途径。目前关于pcos的分子诊断标志物有代谢产物、卵泡数目、snp标记等。关于pcyt1a基因启动子区dna甲基化及其表达水平可作为pcos诊断生物标志物的应用尚未见报道。
pcyt1a基因编码磷酸胞苷转移酶(phosphocholinecytidylyltransferase，ctp)1胆碱酶的α亚型，是磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine，pc)合成的关键调节酶，通过与pc缺陷膜结合而被激活，将pc转化为胞苷二磷酸胆碱(cdp-choline)，是磷脂生物合成途径中的关键中间步骤。pcyt1a基因的突变在人类中会引发脂肪代谢不良的症状，在小鼠中敲除pcyt1a基因会导致胚胎死亡。pcyt1a通过编码磷酸胞苷转移酶参与到pc合成的过程中。而pc是所有哺乳动物细胞膜中最稳定的磷脂之一，不同组织中磷脂水平的微小变化极大的影响了生物体血脂、肥胖和胰岛素抵抗水平。由于pcos患者普遍存在高雄激素和高胰岛素血症症状，本发明人由此认为pcyt1a基因异常甲基化引发的基因表达和蛋白翻译水平变化，或将通过改变磷脂成分，调控胰岛素信号转导和能量代谢相关膜蛋白的活性，作为pcos疾病潜在分子标志物，并为相关代谢疾病的研究提供新的思路。
技术实现要素：
本发明针对现有技术的不足，提供一种dna甲基化标志物pcyt1a在诊断多囊卵巢综合征(pcos)试剂盒中的应用。本发明所提供的试剂盒，可大大提高pcos诊断的特异性和灵敏度。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明提供了一种pcos相关的dna甲基化标志物pcyt1a基因。
本发明还提供了一种dna甲基化标志物pcyt1a基因在制备诊断pcos试剂盒中的应用。
本发明还提供了一种用于合成pcyt1a基因启动子区甲基化的msp引物，包括序列如seqidno.1和seqidno.2所示的引物对和seqidno.1和seqidno.2所示的引物对。
本发明还提供了一种用于扩增pcyt1a基因的qpcr引物，包括序列如seqidno.5和seqidno.6所示的引物对。
本发明还提供了一种pcos诊断试剂盒，包括前述的用于合成pcyt1a基因启动子区甲基化的msp引物或用于扩增pcyt1a基因的qpcr引物。
本发明利用甲基化特异性的pcr(msp)法在在临床pcos患者和正常组颗粒细胞样品中进行pcyt1a基因启动子区甲基化变化的检测：
1、设计并合成pcyt1a基因启动子区甲基化的msp引物。引物共两对，一对特异性结合重亚硫酸盐转化后的甲基化dna链(甲基化引物，m)，另一对特异性结合重亚硫酸盐转化后的非甲基化dna链(非甲基化引物，u)。
2、分别提取pcos患者和正常女性颗粒细胞样品基因组dna，重亚硫酸盐转化后利用合成的引物进行pcr。
3、通过凝胶电泳的方法检测两对引物的pcr产物，判断相对于正常对照组，pcos患者颗粒细胞pcyt1a基因启动子区甲基化水平变化。
本发明还利用qpcr法在临床pcos患者和正常组颗粒细胞样品中进行pcyt1a基因表达水平的检测：
1、设计并合成pcyt1a基因的qpcr引物；
2、分别提取pcos患者和正常女性颗粒细胞样品rna；反转录后利用合成的引物进行qpcr，采用相对定量法检测pcos患者和正常女性颗粒细胞样品中pcyt1a基因的表达水平变化。
本发明首次发现编码磷脂代谢通路关键酶的pcyt1a基因的表达水平和其启动子区甲基化水平与多囊卵巢综合征密切相关，其启动子区高甲基化与表达水平下调可用于pcos诊断；并提供了用于检测pcyt1a基因启动子区甲基化与表达水平的相关试剂盒。
需要说明的是，针对pcyt1a基因的表达水平和其启动子区dna甲基化水平进行大规模检测时，还可以使用适用于本领域技术人员已知的、检测生物样品中的rna表达水平和dna甲基化水平的任意技术。例如，利用rna印迹分析、原位杂交、定制芯片等方法检测rna表达水平；利用亚硫酸氢盐测序法、高分辨率熔解曲线法检测dna甲基化水平。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1、本发明首次发现相对于正常组织，pcyt1a基因的表达水平和启动子区dna甲基化水平在pcos患者卵巢颗粒细胞中呈现显著性差异，可作为pcos相关的生物标志物，开发为pcos诊断检测试剂盒。
2、本发明通过检测卵巢颗粒细胞样品中的pcyt1a基因的表达水平和启动子区dna甲基化水平，可以快速、准确及清楚的确定pcos的发生。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为pcos患者和对照组颗粒细胞品基因组dna琼脂糖凝胶电泳结果；
图2为msp验证pcyt1a基因启动子区甲基化结果电泳图；其中，图2a为pcos患者和对照组颗粒细胞样品中pcyt1a基因启动子区msp电泳图；图2b为50bpdnaladder分布图；
图3为pcos患者和对照组颗粒细胞品总rna琼脂糖凝胶电泳结果；
图4为pcos患者和正常组颗粒细胞样品中pcyt1a基因表达结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变化和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1临床pcos患者和正常育龄妇女卵巢颗粒细胞样品的收集
所有参与者于黄体中期开始接受促性腺激素释放激素激动剂(gnrha)注射，然后超声监测卵泡大小。当3个或3个以上平均直径为16mm的卵泡存在时，将5000至10000iu的人绒毛膜促性腺激素(hcg)注射到受试者体内。36小时后，超声引导下收集卵母细胞，取卵母细胞周围的颗粒细胞，去除卵母细胞后，用dmem培养基(dulbecco改良的eagle培养基)洗涤2次。然后将分离的颗粒细胞样品快速放入液氮中，-80℃条件下保存。
术前，在参与者月经第2-5天检测基础性激素水平。由医生取血样，利用全dxi800自动化学发光免疫分析仪分析样品的卵泡生成激素(folliclestimulatinghormone，fsh)、黄体生成激素(luteinizinghormone，lh)、雌二醇(estrogen，e2)、孕酮(progesterone，p)、睾酮(testosterone，t)、催乳激素(prolactin，prl)，人绒毛膜促性腺激素β(humanchorionicgonadotropinβ，β-hcg)和空腹血糖。利用spss(v.20)软件进行统计学分析，分析结果见表1。
表1多囊卵巢综合征(pcos患者)组和对照组(正常育龄妇女)受试者临床信息
表1中所有数据均以平均数±sem表示，p<0.05时被认为差异显著。其结果表明：pcos患者与育龄正常女性相比，bmi指数明显显著升高，促黄体生成素(lh)水平显著升高(p<0.05)，卵泡生成激素(fsh)水平略有下降，但并不显著。其他特征无明显差异。肥胖、lh水平升高，fsh水平降低是pcos患者的一般特征，这与我们的临床观察基本一致。
实施例2利用甲基化特异性的pcr(msp)法在在临床pcos患者组和正常育龄妇女组颗粒细胞样品中进行pcyt1a基因启动子区甲基化变化的检测
1、颗粒细胞样品基因组dna的提取和质检
利用axyprep基因组dna小量制备试剂盒，采取柱吸附的方法进行颗粒细胞基因组dna的提取，具体实验操作流程参考使用说明书。
(1)将实施例1的方法分离得到的临床pcos患者组和正常育龄妇女组颗粒细胞样品加入离心管中，然后加入350μl1×pbs缓冲液悬浮细胞。
(2)向离心管中加入0.8μlrnasea(试剂盒提供)，置于涡旋混匀仪上振荡15s，室温静置1min。
(3)向离心管中先后加入150μlbufferc-l和8μlproteinasek(试剂盒提供，第一次使用时将蛋白酶k溶解于bufferpk中，用移液器轻柔吹打混匀)。然后立即置于涡旋混匀仪上振荡1min，充分混合均匀。
(4)将混合均匀后的离心管放入微型离心机中瞬时离心后，置于56℃金属浴上10min。
(5)向离心管中加入350μlbufferp-d，置于涡旋混匀仪上振荡30s，混合均匀后室温下12000×g离心10min。
(6)将小量制备管(试剂盒提供)置于2ml收集管(试剂盒提供)中，将步骤(5)获得的上清液移至小量制备管中，室温下12000×g离心1min。
(7)弃滤液，将小量制备管放回原来的2ml收集管中，向小量制备管中加入500μlbufferw1，室温下12,000×g离心1min。
(8)弃滤液，将小量制备管放回原来的2ml收集管中，加入700μlbufferw2(第一次使用时，按试剂瓶上的指示向bufferw2瓶中加入指定体积的无水乙醇并混合均匀)，室温下12000×g离心1min。
(9)以步骤(8)中同样的方法，用700μlbufferw2再洗涤一次。
(10)弃滤液，将小量制备管放回原来的2ml收集管中，室温下12000×g离心1min。
(11)将步骤(10)离心后的小量制备管放入洁净的1.5ml离心管(试剂盒提供)中，向小量制备管膜中央加入52μleluent(提前加热至65℃)，室温下静置1min。
(12)室温下12000×g离心1min，洗脱得基因组dna。
(13)取1μl基因组dna样品，使用nanodropone超微量分光光度计进行dna的定量检测。该定量结果只影响后续实验起始样品体积，不影响实验结果，原则上大于1ug即可。
(14)取1μl基因组dna样品，采用水平式琼脂糖凝胶电泳的方式进行dna的完整性检测：配制1％的琼脂糖凝胶，使用0.5×tbe缓冲液作为电泳缓冲液，120v恒压下电泳30min，之后将胶块放置在凝胶成像仪上观察，以其中两位受试者的颗粒细胞样品基因组dna为例，其中p代表pcos患者，n代表对照组，颗粒细胞样品基因组dna质检结果如图1所示。图1结果表明样品基因组dna完整无降解。满足后续msp实验要求。
2、利用ezdnamethylation-goldtmkit对颗粒细胞基因组dna(gdna)进行重亚硫酸盐转化，取20ulgdna样品，按照zymoezbs转化试剂盒说明书操作，20ulelutionbuffer洗脱。
3、用pcr的方法检测m和u两对引物的pcr扩增产物：
(1)取200ulpcr管置于冰上，配置反应体系如下：
(2)压紧盖板，充分混匀后瞬离，轻轻弹击管壁以除去气泡，再次离心。
(3)将pcr管程序设定如下：
其中根据预实验确定的最佳退火温度，将grad.temp.设置为47-58℃，将pcr管分别置于对应温度的孔中。
(4)pcr结束后取10ul产物(即为以甲基化的lpcat1基因片段为模板，分别利用甲基化、非甲基化引物进行pcr后的产物)加入2ulloadingbuffer进行2％凝胶电泳检测扩增产物。如果m引物扩增条带的亮度明显高于u引物扩增条带的亮度，则证明目标区域为高甲基化，如果u引物扩增条带的亮度明显高于m引物扩增条带的亮度则证明目标区域为低甲基化。结果如图2所示，pcos组m引物扩增条带的亮度明显高于u引物扩增条带的亮度，且条带清晰而特异性好，证明目标区域在pcos组中高甲基化。而对照组中u引物扩增条带的亮度明显高于m引物扩增条带的亮度，条带清晰而且特异性好，证明目标区域在对照组中低甲基化。与对照组相比，pcos患者颗粒细胞pcyt1a基因启动子区出现明显高甲基化。
本发明设计并合成pcyt1a基因启动子区甲基化的msp引物。引物共两对，一对特异性结合重亚硫酸盐转化后的甲基化dna链(甲基化引物，m)，另一对特异性结合重亚硫酸盐转化后的非甲基化dna链(非甲基化引物，u)。下表为实验中用到的msp引物序列：
实施例3利用qpcr法在临床pcos患者和正常组颗粒细胞样品中进行pcyt1a基因表达水平的检测：
1、总rna的抽提与质检
采用trizol说明书中分离rna的方法进行总rna的提取，具体步骤如下：
(1)将实施例1所制得的保存于-80℃的颗粒细胞样品取出，加入1mltrizol后将离心管在室温下平衡5min；
(2)向离心管中加入200ml氯仿，盖好管盖，置于涡旋混匀仪上15s，室温下静置5min，4℃条件下12000×g离心15min。
(3)离心过后可看见明显的分层现象，小心吸取上清的无色水相，转移至新的1.7mldnase/rnasefree离心管中。
(4)向离心管中加入500ml异丙醇，置于涡旋混匀仪15s，在室温下静置10min，4℃条件下12000×g离心10min，此时可见管底有白色的总rna沉淀。
(5)小心弃去上清，加入1ml预冷于4℃的75％乙醇，用移液器混匀吹起沉淀，4℃条件下7500×g离心5min。
(6)小心弃去上清，打开管盖，晾干约5min(不应超过10min)，直至观察到沉淀表面干燥，然后加入适量的dnase/rnase-free无菌水溶解rna沉淀，保存于-80℃备用。
完成总rna的提取后，使用nanodropone超微量分光光度计对总rna进行定量，之后用琼脂糖凝胶电泳检测rna的完整性。
a.对总rna进行定量的方法如下：取1μl样品，使用nanodropone超微量分光光度计进行总rna的定量检测：首先，在“主页”屏幕上，选择核酸选项卡并点击rna选项。然后取1μl空白检测溶液(此处为dnase/rnase-free无菌水)点样至下基座探头上，降下检测臂，点击空白检测并等待检测完成。之后，抬起检测臂，用新的低尘精密擦拭纸擦拭上下基座，然后取1μl样品点样至下基座探头上，然后降下检测臂并点击检测。检测完成后，记录数据并抬起检测臂，用新的抹布擦拭上下基座后结束实验。
质量较好的总rnaa260/280＝2.0-2.2，若偏高则有可能是存在rna降解，可能需要再次进行rna的抽提。若偏低，则可能存在dna或者蛋白质的污染。高质量的总rna的a260/230＝2.0-2.5，若偏低表示可能是有残余的有机溶剂或盐离子。存在以上污染则该样品总rna不能用于后续分析，需要进行进一步纯化。
b.琼脂糖凝胶电泳检测rna的完整性:清洗干净凝胶电泳所用的电泳槽、胶槽、胶板、胶梳以及配胶用的锥形瓶，喷洒rna酶抑制剂并擦干，必须与dna凝胶电泳所用器材分开。
采用的电泳缓冲液为0.5×tbe，120v恒压电泳15min，之后在凝胶成像仪上观察。以其中两位pcos患者和两位对照正常女性的颗粒细胞样品总rna为例，其中p代表pcos患者，n代表对照组，颗粒细胞样品总rna质检结果如图3所示。结果表明样品中的28s、18s条带均清晰可见，且亮度28s＞18s，满足后续rna-seq技术和mirna-seq技术建库要求。5s条带略有模糊，但是结合nanodrop结果分析，rna并没有发生降解。电泳时使用的琼脂糖凝胶不是专门用于rna电泳的琼脂糖变性胶，有可能是在电泳时发生了rna的部分降解。
2、总rna的反转录
使用takara公司的primescripttmrtreagent试剂盒对步骤1提取的总rna进行反转录，包括去除基因组dna和反转录两个过程，具体步骤如下所示：
(1)去除总rna样品中的基因组dna，体系配方如下所示：
置于pcr仪中进行反应，42℃反应2min。
(2)反转录反应
将去除gdna后的总rna样品转移至pcr管中，在冰上配置mrna反转录体系，配方如下所示(oligodtprimer和random6mers为常规反转录试剂盒中提供的引物)：
轻柔混匀后立即置于pcr仪中进行反转录反应，反应条件为:
45℃15min
85℃5sec
4℃5min
3、qpcr反应体系配置。
(1)分别取4ul第2步rna反转录反应所得的rna-qpcrcdna稀释20倍，配成模板母液。
(2)每个样品各准备一个pcr管，向其中分别加入对应的9.6ul模板母液、6.4ul(f r)引物(10um，序列如seqidno.5和seqidno.6)、16ulqpcrmix(thermofisherpowerupsybrqpcrmastermix)，以actb作为内参基因(引物序列如seqidno.7和seqidno.8所示)。
(3)混匀后，分别加入8连管上的3个平行孔中，每孔10ul。压紧盖板，充分混匀后瞬离，轻轻弹击管壁以除去气泡，再次离心。之后置于steponeplusreal-timepcrsystem中，设定程序并进行qpcr反应，反应程序如下：
4、进行qpcr数据分析
qpcr反应完成之后对获得的数据进行pcyt1a基因的相对表达量分析，具体计算过程如下：
δct(pcos)＝ct(pcos)-ct(pcosactb)
δct(对照组)＝ct(对照组)-ct(对照组actb)
δδct＝δct(pcos)-δct(对照组)
目的基因的表达量的倍数变化的相对表达量＝2(-δδct)
做图展示pcyt1a基因表达水平变化，结果如图4所示。结果表明，相对于正常组，pcyt1a基因在pcos颗粒细胞中表达显著下调，与其启动子区甲基化水平呈负相关(**代表p值小于0.01)。
下表为实验中用到的qpcr引物序列：
综上所述，pcyt1a基因的表达水平和启动子区dna甲基化水平在pcos患者卵巢颗粒细胞中呈现显著性差异，可作为pcos相关的生物标志物，开发为pcos诊断检测试剂盒。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。
序列表
<110>上海交通大学
<120>dna甲基化标志物pcyt1a在制备诊断pcos试剂盒中的应用
<130>kag43496
<160>8
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>24
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
ttttagttattcgggatgaggtac24
<210>2
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
aacgaaacctcgctctatcg20
<210>3
<211>25
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
tttagttatttgggatgaggtatga25
<210>4
<211>25
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>4
aaaaacaaaacctcactctatcacc25
<210>5
<211>29
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>5
agattagtttgattattatggtgaaattt29
<210>6
<211>30
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>6
ccaactaaactaaaataaaaaaccttttaa30
<210>7
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>7
ggacttcgagcaagagatgg20
<210>8
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>8
agcactgtgttggcgtacag20
1.一种pcos相关的dna甲基化标志物pcyt1a基因。
2.一种dna甲基化标志物pcyt1a基因在制备诊断pcos试剂盒中的应用。
3.一种用于合成pcyt1a基因启动子区甲基化的msp引物，其特征在于，包括序列如seqidno.1和seqidno.2所示的引物对和seqidno.1和seqidno.2所示的引物对。
4.一种用于扩增pcyt1a基因的qpcr引物，其特征在于，包括序列如seqidno.5和seqidno.6所示的引物对。
5.一种诊断pcos试剂盒，其特征在于，包括权利要求3所述的用于合成pcyt1a基因启动子区甲基化的msp引物或用于扩增pcyt1a基因的qpcr引物。
技术总结