本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种检测血清外泌体及大肠癌组织中cacclnc相对含量的试剂盒以及其在预测大肠癌患者化学治疗效果中的应用。
背景技术：
大肠癌是消化系统常见的恶性肿瘤，其致死率在恶性肿瘤中居前5位。近年来，随着生活水平的提高，在我国大肠癌的发病率也逐年增加。对于中晚期大肠癌患者，目前的一线化疗方案多为奥沙利铂、氟尿嘧啶或伊替立康[1]。铂类药物杀伤肿瘤细胞的主要机制是在低氯的内环境中，铂原子形成水合阳离子，与dna形成共价键，形成加合物，从而造成dna发生链内和链内的交联，阻滞dna的复制，最终导致细胞的死亡[2]。氟尿嘧啶的杀伤肿瘤细胞的作用是通过在体内转化为氟尿嘧啶脱氧核苷酸，阻断脱氧核糖尿苷酸转化为胸苷酸，进而抑制dna合成。因此，修复这种dna损伤与肿瘤细胞的化疗耐药相关。由于化疗耐药，中晚期大肠癌患者的生存率不足10％[3]。因此，尽早明确患者是否对化疗敏感至关重要。目前，判断肿瘤患者化疗效果的方法主要是通过影像学检查或者手术标本的肿瘤退缩分级(trg)评分。大肠癌患者进行2-3个月化疗后通过ct、pet-ct、mr等影像学检查及肠镜判断肿瘤是否缩小[1]。化疗后进行手术者，根据其手术标本的术后病理进行肿瘤退缩分级(trg)评分，从而判断化疗效果，进而决定术后治疗方案。另外，还可在化疗后检测患者血清中癌胚抗原(cea),监测患者化疗效果。
上述判断大肠癌患者化疗效果的方案均需要在化疗后方可明确是否有效，对于对化疗抵抗的患者来说，增加了无用的治疗成本，且影像学及肠镜等检查的成本较高。此外，对于化疗抵抗的患者而言，化疗几个疗程及手术之后判断化疗效果的影像学检查、术后病理肿瘤退缩分级(trg)评分、血清癌胚抗原(cea)需要的时间较长，可能会使化疗抵抗的患者错失其他治疗方案的时机。
因此，需要使用更加简便，成本更低，且能早期甚至在化疗前就能判断化疗是否有效的标志物，从而促进化疗效果并为大肠癌患者选择合适的治疗方法，提高大肠癌患者的生存率。
长链非编码rna(lncrna)是一种转录长度大于200nt，没有蛋白质编码功能的转录产物，能够在转录及转录后水平调控基因表达。近年来研究发现lncrna参与肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭及血管新生等多种生物学功能。一些lncrna还可以通过不同机制参与肿瘤细胞的化疗耐药。cacclnc(enst00000534398)是与大肠癌相关的一条lncrna，目前尚未有cacclnc与大肠癌化疗耐药相关的报道，也没有cacclnc可能用于预测大肠癌患者化疗效果的相关报道。
[1]nccnclinicalpracticeguidelinesinoncology-coloncancer(2018version2)[db/ol].http://www.nccn.org.
[2]helledayt,petermanne,lundinc,etal.dnarepairpathwaysastargetsforcancertherapy.natrevcancer2008；8:193-204.
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技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种简便且能早期预测大肠癌患者化疗效果的生物标志物试剂盒。
本发明的技术方案如下：
cacclnc作为生物标志物制备用于预测大肠癌患者化疗效果的试剂盒的应用。
一种预测大肠癌患者化疗效果的试剂盒，其特征在于，包括能够扩增cacclnc的特异性引物和/或能够检测cacclnc的特异性探针。
优选地，所述能够检测cacclnc的特异性探针为用于做石蜡切片原位杂交的cacclnc的探针。
优选地，所述能够扩增cacclnc的特异性引物的核苷酸序列如seqidno.1-2所示，能够检测cacclnc的特异性探针的核苷酸序列如seqidno.3所示。
本发明提供了上述用于预测大肠癌患者化疗效果的试剂盒在预测大肠癌患者化疗效果中的应用，其特征在于，包括：通过检测大肠癌患者血清外泌体中cacclnc的相对含量或者利用大肠癌组织石蜡切片cacclnc的原位杂交染色评分来预测大肠癌患者的化疗效果。
优选地，所述检测大肠癌患者血清外泌体中cacclnc的相对含量的具体包括以下步骤：在患者确诊为大肠癌，进行化疗前，收集其血清，提取血清外泌体，加入外参polya，抽提rna，进行逆转录，然后利用qpcr，分别扩增cacclnc及外参polya，将产物定量和均一化处理后，进行数据分析；计算cacclnc和外参的ct值之差(△ct)；ct值指循环阈值，为样本的荧光信号达到设定的阈值需要经历的循环数，利用△ct计算cacclnc的相对表达量为0.5^(△ct)，根据界定值进行分类，若相对表达量高于界定值，则预测大肠癌患者化疗效果不佳；若相对表达量低于界定值，则预测大肠癌患者化疗有效；血清外泌体中cacclnc的界定值为0.356(△ct值为1.490)。
预测由以上步骤得出的cacclnc的相对表达含量低于界定值0.356的大肠癌患者化疗有效；预测由以上步骤得出的cacclnc的相对表达含量高于界定值0.356的大肠癌患者化疗抵抗。本发明提供的技术方案可应用于大肠癌患者。
优选地，所述利用大肠癌组织石蜡切片cacclnc的原位杂交染色评分的具体步骤包括：当患者确诊时有病理石蜡切片，用石蜡切片做cacclnc的原位杂交，然后根据染色深浅及阳性细胞百分比进行评分，染色深浅分为0-3四级：0，无染色；1，浅染色；2中度染色；3；强染色；阳性细胞百分比分为0-4五级：0，无阳性细胞；1，1％-25％；2，26％-50％；3，51％-75％；4，>75％；最终原位杂交染色评分为s*p；根据界定值进行分类，若相对表达量高于界定值，则预测大肠癌患者化疗效果不佳；若相对表达量低于界定值，则预测大肠癌患者化疗有效，肿瘤组织中cacclnc的原位杂交评分界定值为6，若评分低于或等于界定值6则预测患者化疗有效，若患者高于界定值6则预测患者化疗抵抗。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
与影像学检查或手术标本的trg评分相比，本发明基于cacclnc预测大肠癌患者化疗效果的方法具有实施较为方便，成本较低的特点，且能更早预测化疗效果，不仅在经济上，更在治疗方案的选择上使患者获益。本检测操作简便，易于推广，因此具有广阔的应用前景。
附图说明
图1a显示在大肠癌细胞系sw480及其奥沙利铂耐药株中，利用rt-qpcr计算所得cacclnc相对于统一的内参gapdh的△ct值；
图1b显示rt-qpcr检测到在sw480耐药株中有效敲低了cacclnc；
图1c显示敲低cacclnc后，sw480耐药株对奥沙利铂的耐受能力下降，细胞生存率降低；
图1d显示化疗效果不同的大肠癌患者化疗前血清外泌体中cacclnc含量存在显著差异，双侧t检验显示p值如图所示；
图1e显示利用化疗前大肠癌患者血清外泌体中cacclnc的相对表达量对化疗反应预测的roc曲线，曲线下面积及置信区间如图所示；
图1f为化疗后复发及未复发的患者化疗前组织中cacclnc原位杂交图；
图1g为对图f的评分。
图1h显示化疗前癌组织中cacclnc的含量对大肠癌患者化疗后无复发生存期进行分类和预测的效果；
图1i显示利用化疗前大肠癌组织中cacclnc含量、美国癌症联合委员会分期(ajcc分期)及两者联合对大肠癌患者化疗反应预测的受试者工作特征曲线(roc曲线)，曲线下面积及置信区间、p值如图所示。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
本发明中的化疗主要是采用奥沙利铂和氟尿嘧啶的化疗方案。本发明基于以往未认知到的事实，即大肠癌患者血清外泌体中的cacclnc相对表达量可用于预测大肠癌患者对化疗的反应。
实施例1
在人大肠癌细胞系sw480及其奥沙利铂诱导耐药株中验证cacclnc在化疗耐药中的作用：
实验方法：利用rt-qpcr验证sw480耐药株及敏感株中cacclnc表达量，其中，特异性引物的正向序列为5’-caggagcagagggacagccac-3’(如seqidno.1所示)，反向序列为5’-cccttgtgccacgtccctcc-3’(如seqidno.2所示)。利用针对cacclnc的特异性小干扰rna(sirna序列如seqidno.2所示)分别对sw480耐药株中cacclnc表达进行敲低，利用随机序列的小干扰rna(controlsirna)作为阴性对照。其中，cacclncsirna1的正义链序列为5’-ccgaauuggacacacagagtt-3’(如seqidno.4所示)，反义链序列为5’-cucuguguguccaauucggtt-3’(如seqidno.5所示)；cacclncsirna2的正义链序列为5’-uccuagucccagaagcucatt-3’(如seqidno.6所示)，反义链序列为5’-ugagcuucugggacuaggatt-3’(如seqidno.7所示)。转染48小时后，抽提细胞的总rna，利用rt-qpcr检测cacclnc特异性小干扰的敲低效果。利用针对cacclnc的特异性小干扰rna对sw480耐药株中cacclnc表达进行敲低，以controlsirna作为阴性对照，24小时后加入不同浓度的奥沙利铂，以加奥沙利铂的溶剂组作为本底，48小时后加入cck8试剂，孵育2小时后测定样品在450nm检测吸光度值，计算cacclnc敲低组与阴性对照相比细胞的生存率。
实验结果：如图1a所示，cacclnc在sw480耐药株中表达量高于sw480敏感株。如图1b所示cacclnc的特异性小干扰能有效降低cacclnc在sw480耐药株中的表达量。如图1c所示在sw480耐药株中降低cacclnc表达量后该细胞的耐药性降低，证明cacclnc在大肠癌耐药中具有显著作用。
实施例2
证明cacclnc在大肠癌化疗耐药患者的血清外泌体中高表达，在化疗有效患者的癌组织中低表达：
实验方法：收集复旦大学附属肿瘤医院进行新辅助化疗的大肠癌患者首次化疗前的血标本，包括化疗有效31人，化疗抵抗28人。离心收集血清外泌体，qpcr检测血清外泌体中cacclnc的表达量。以polya作为外参，计算cacclnc和外参的ct值之差(△ct)，利用△ct计算cacclnc的相对表达量为0.5^(△ct)。比较化疗有效和化疗抵抗患者血清外泌体中cacclnc的相对表达量。
实验结果：如图1d所示，cacclnc在化疗抵抗患者中表达高于化疗有效患者，p值小于0.01。如图1e所示，利用cacclnc相对表达量预测大肠癌患者化疗效果对应生成的roc曲线下面积(auc)为0.846，选取0.356作为界定值，此时预测化疗效果的敏感性为0.710，特异性为0.857。
实施例3
利用一组独立的数据验证大肠癌患者血清外泌体中cacclnc相对表达量预测患者化疗效果：
实验方法：收集复旦大学附属肿瘤医院进行新辅助化疗的大肠癌患者首次化疗前的血标本，包括化疗有效10人，化疗抵抗9人。qpcr检测血清外泌体中cacclnc的相对表达量。
实验结果：以实施例2中选取的0.356为界定值，预测患者化疗效果的敏感性为0.889，特异性为0.700。
实施例4
证明cacclnc在大肠癌化疗耐药患者的癌组织中高表达，在化疗有效患者的癌组织中低表达，且不论是否耐药，癌组织中cacclnc表达均高于癌旁组织：
实验方法：用仁济医院队列的石蜡组织芯片(6um)做cacclnc的原位杂交，cacclnc探针的核苷酸序列为5’-tgcaggccaataagaggaggct-3’(如seqidno.3所示)。癌组织包括78例未复发患者，82例复发患者。未复发患者组的癌旁组织有49例，复发患者组的癌旁组织有53例。根据视野中阳性细胞的比例以及染色深浅进行评分。根据癌组织中cacclnc的表达评分与该群体的中位值比较，高于中位值的为高表达，低于中位值的为低表达，比较高表达与低表达cacclnc的患者在化疗后的无复发生存期，对治疗的预后进行预测和分类。
实验结果：如图1f、1g所示cacclnc在复发患者的癌组织中的表达高于未复发患者，且不论复发还是未复发，癌组织中cacclnc的表达均高于癌旁组织。如图1h所示cacclnc高表达的患者其无复发生存期显著低于cacclnc低表达的患者(p＝0.001)，提示cacclnc低表达的患者对化疗反应更好。如图1i所示用cacclnc作为生物标志物预测大肠癌患者化疗的效果，预测的敏感性和特异性对应生成的roc曲线下面积(auc)为0.72，ajcc对应的auc为0.65，cacclnc联合ajcc对应的auc可达0.75。
sequencelisting
<110>上海交通大学医学院附属仁济医院
<120>一种用于预测大肠癌化疗效果的生物标志物、试剂盒及其应用
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ugagcuucugggacuaggatt21
1.cacclnc作为生物标志物在制备用于预测大肠癌患者化疗效果的试剂盒的应用。
2.一种用于预测大肠癌患者化疗效果的试剂盒，其特征在于，包括能够扩增cacclnc的特异性引物和/或能够检测cacclnc的特异性探针。
3.如权利要求2所述的预测大肠癌患者化疗效果的试剂盒，其特征在于，所述能够扩增cacclnc的特异性引物的核苷酸序列如seqidno.1-2所示，所述能够检测cacclnc的特异性探针的核苷酸序列如seqidno.3所示。
4.权利要求2或3所述的用于预测大肠癌患者化疗效果的试剂盒在预测大肠癌患者化疗效果中的应用，其特征在于，通过检测大肠癌患者血清外泌体中cacclnc的相对含量或者利用大肠癌组织石蜡切片cacclnc的原位杂交染色评分来预测大肠癌患者的化疗效果。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述检测大肠癌患者血清外泌体中cacclnc的相对含量的具体包括以下步骤：在患者确诊为大肠癌，进行化疗前，收集其血清，提取血清外泌体，加入外参polya，抽提rna，进行逆转录，然后利用qpcr，分别扩增cacclnc及外参polya，将产物定量和均一化处理后，进行数据分析；计算cacclnc和外参的ct值之差(△ct)；ct值指循环阈值，为样本的荧光信号达到设定的阈值需要经历的循环数，利用△ct计算cacclnc的相对表达量为0.5^(△ct)，根据界定值进行分类，若相对表达量高于界定值，则预测大肠癌患者化疗效果不佳；若相对表达量低于界定值，则预测大肠癌患者化疗有效；血清外泌体中cacclnc的界定值为0.356(△ct值为1.490)。
6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述利用大肠癌组织石蜡切片cacclnc的原位杂交染色评分的具体步骤包括：当患者确诊时有病理石蜡切片，用石蜡切片做cacclnc的原位杂交，然后根据染色深浅及阳性细胞百分比进行评分，染色深浅分为0-3四级：0，无染色；1，浅染色；2中度染色；3；强染色；阳性细胞百分比分为0-4五级：0，无阳性细胞；1，1％-25％；2，26％-50％；3，51％-75％；4，>75％；最终原位杂交染色评分为s*p；根据界定值进行分类，若相对表达量高于界定值，则预测大肠癌患者化疗效果不佳；若相对表达量低于界定值，则预测大肠癌患者化疗有效，肿瘤组织中cacclnc的原位杂交评分界定值为6，若评分低于或等于界定值6则预测患者化疗有效，若患者高于界定值6则预测患者化疗抵抗。
技术总结