本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及一组染色体不稳定区域在制备诊断尿路上皮癌的试剂或试剂盒中的应用。
背景技术：
：尿路上皮癌(urotheilialcancer，uc)是指发生在膀胱粘膜、输尿管上皮、肾盂的恶性肿瘤。尿路系统肿瘤组织学分类中尿路上皮癌的病理类型包括膀胱尿路上皮癌、膀胱鳞状细胞癌、膀胱腺癌，其他罕见的还有膀胱透明细胞癌、膀胱小细胞癌、膀胱类癌。其中最常见的是膀胱尿路上皮癌，约占尿路上皮癌患者综述的90％以上，通常所说的尿路上皮癌就是指膀胱尿路上皮癌。染色体不稳定通常与肿瘤相关，具体包括整个染色体或者染色体片段拷贝的缺失或扩增。含有与肿瘤发生相关的染色体或者染色体片段的扩增和缺失经常是肿瘤发生所特有的，检测肿瘤染色体不稳定区域对于研究肿瘤发生和开发肿瘤诊断技术都至关重要。当前临床上有使用原位荧光杂交的方法对染色体上部分区域的不稳定性进行检测，但缺少尿路上皮癌患者整个基因组层面染色体不稳定性的分布特征。通过二代测序可以同时检测基因组上多个区域，可以很好地应用于全基因组或者基因组上大量区域同时检测分析。中国专利201910711954.6中公开了一组染色体不稳定区域在制备诊断尿路上皮癌的试剂或试剂盒中的应用。该专利提供用于诊断肝癌的10个染色体不稳定区域，总携带率占93.4％，对临床上尿路上皮癌的诊断、治疗、监测计预后评估具有很大的意义。本发明在研究我国尿路上皮癌(uc)所特有的染色体不稳定性的分布特征的基础上，公开了优化的全基因组二代测序方法的具体过程和染色体及基因不稳定区域，发现了21个与尿路上皮癌发生常见的染色体及基因变异区域，为应用二代测序技术对尿路上皮癌的临床早期诊断和制定个体化治疗方案提供科学依据。技术实现要素：本发明使用二代测序技术，通过分析尿路上皮癌全基因组不稳定信息，筛选出适宜表征尿路上皮癌的21个区域，通过该方法可以更准确地诊断尿路上皮癌，更全面地指导尿路上皮癌的诊断和预后。本发明中涉及的染色体和基因不稳定区域的编号依据本领域惯用编号规则进行限定，例如不稳定区1q在本领域惯用规则中指第1号染色体的长臂，不稳定区域3p指3号染色体短臂；e2f3指e2f3基因，本领域中常使用斜体表示。一方面，本发明基于二代测序技术，提供了一组我国尿路上皮癌患者中常发生的染色体及基因不稳定区域在制备用于尿路疾病的检测、预后评估、筛查、早期筛查或病情监测的试剂或试剂盒中的用途；所述的不稳定区域包括以下21个：1q、3p、3q、4q、5p、5q、6q、7p、7q、8p、8q、9p、9q、10q、11p、17p、17q、18q、20q、e2f3、rb1。具体地，所述的染色体不稳定包括整个染色体或者染色体片段拷贝的缺失或扩增。具体地，所述基因的不稳定包括整个基因的拷贝数的缺失或扩增。具体地，所述的7p区域的扩增可导致表皮生长因子egfr(原癌基因)高表达；所述的9p区域16位点抑癌基因的缺失，导致细胞周期调控的异常；所述的17p缺失导致抑癌基因tp53不能表达，促进肿瘤进展。具体地，所述的21个不稳定区域在尿路上皮癌患者中总的携带率高达83.9％具体地，所述的尿路疾病为尿路上皮癌，所述的尿路上皮癌包括：肾盂癌、输尿管癌、膀胱癌、尿道上皮细胞癌中的一种或多种。另一方面，本发明基于二代测序技术，提供了前述的一组染色体及基因不稳定区域在制备尿路疾病药物中的应用。具体地，所述的不稳定区域包括以下21个：1q、3p、3q、4q、5p、5q、6q、7p、7q、8p、8q、9p、9q、10q、11p、17p、17q、18q、20q、e2f3、rb1。具体地，所述的尿路疾病为尿路上皮癌，所述的尿路上皮癌包括：肾盂癌、输尿管癌、膀胱癌、尿道上皮细胞癌中的一种或多种。又一方面，本发明提供了一种基于二代测序技术的尿路上皮癌相关的试剂或试剂盒。具体地，所述的试剂或试剂盒包括但不限于：诊断尿路上皮癌的试剂或试剂盒、尿路上皮癌早期筛查的试剂或试剂盒、尿路上皮癌病情监测的试剂或试剂盒。具体地，所述的试剂或试剂盒包括检测前述21个染色体及基因不稳定区域的一种或多种试剂。具体地，所述的试剂或试剂盒还包含：阳性参考品、阴性参考品、缓冲液、酶、文库接头、可检测标签、核酸提取试剂、核酸纯化试剂中的一种或多种。进一步具体地，所述的文库接头包含seqidno:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、和47所示的核苷酸序列。进一步具体地，所述的文库接头包含seqidno:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、和48所示的核苷酸序列。进一步具体地，所述的酶包含打断酶、dna聚合酶、dna连接酶中的一种或多种。进一步具体地，所述的阳性参考品为混合具有前述的21个区域变异的细胞系；所述的阴性参考品为无染色体变异的细胞系。可选择地，所述的试剂盒可通过以下方法进行结果检测：数字pcr、原位荧光杂交、核酸探针杂交法等。可选择地，所述试剂盒还包含临床上用于尿路上皮癌的筛查、诊断、治疗方案选择、监测和预后评估的其它试剂，以辅助或验证通过检测上述21个染色体区域所得到的结果。优选地，所述的试剂或试剂盒可检测的临床样品包括但不限于：体液、组织、细胞等。又一方面，本发明还提供了前述尿路上皮癌相关的试剂盒的操作方法。具体地，所述的操作方法包括以下步骤：(1)从检测对象获得待测样品；(2)待测样品与利用本发明的检测试剂接触；(3)检测待测样本上述21个染色体区域；(4)根据检测结果进行尿路上皮癌的筛查、诊断、治疗方案选择、监测和预后评估。又一方面，本发明提供了一种用于二代测序的平末端y字形、带有特定分子标签且包含多个接头的接头混合物。具体地，所述的接头混合物包含24个相关接头，编号1-24，每个接头由两条序列组成，分别编号n-1、n-2。各接头的两条核苷酸序列如seqidno:1-48所示，其对应的编号和分子标签在序列中的位置如下：具体地，所述的接头改变传统二代粘末端y字型接头为平末端y字型接头，可省去建库流程中的加“a”操作。具体地，所述的接头为在已公开接头序列上设计增加特定6碱基序列，并将多个上述接头混合。不同于二代测序文库中普通样本标签，该分子标签不是用于样本区分，而是通过分析测序序列两端分子标签的不同，去除测序数据中的假阳性。具体地，该平末端y字型带分子标签的接头与普通粘末端y字型接头结构比较如图1。具体地，本发明提供的接头3’端为平末端，接头双链末端有重新设计的分子标签。又一方面，本发明还提供了一种用前述接头建立文库的构建方法。具体地，所述的方法减少常规文库构建中加“a”步骤，通过平末端连接y字型文库接头。本专利接头的建库方法与普通建库方法比较如图2所示。又一方面，本发明还提供了前述接头中分子标签建立的文库测序数据的去除假阳性策略。具体地，所述的策略为前述24种含不同分子标签的接头混合，经连接反应随机连接到核酸片段两侧，核酸片段两侧分子标签有576种组合。具体地，通过连接本专利接头，对于测序相同序列，若序列两侧接头不一致，极大概率(575/576＝99.8％)为片段化过程产生相同序列，为有效信息；若序列两侧接头一致，极大概率(99.8％)为pcr过程产生的复制，可进行去重。进一步具体地，通过序列两侧相同的分子标签，在复制去重之前对于某位置碱基信息不完全一致情况时，某一碱基在该位置出现频率大于50％为初始碱基信息，发生频率小于50％者为pcr扩增和测序反应引入的错误，予以去除。又一方面，本发明还提供了前述的接头和文库构建方法在制备诊断尿路上皮癌的试剂或试剂盒中的应用。具体地，所述的应用包括但不限于诊断肾盂癌、输尿管癌、膀胱癌、尿道上皮细胞癌的试剂或试剂盒。具体地，所述的试剂盒包括但不限于：诊断尿路上皮癌的试剂或试剂盒、尿路上皮癌早期筛查的试剂或试剂盒、尿路上皮癌病情监测的试剂或试剂盒。本发明收集临床确诊的尿路上皮癌患者、健康人及非尿路上皮癌疾病患者的样本，通过全基因组测序比较肿瘤患者与对照的染色体异常情况，阐述尿路上皮癌所特有的染色体不稳定性分布特征，公开了尿路上皮癌患者21个常见染色体不稳定区域，总的携带率高达83.9％，这对临床上尿路上皮癌的诊断、治疗、监测计预后评估具有很大的意义，为下一步进行早期诊断和制定个体化治疗方案提供科学依据。附图说明图1为本专利提供的平末端y字型带分子标签的接头与普通粘末端y字型接头结构比较，其中左侧为普通接头，右侧为本专利提供的接头。图2为本专利接头的建库方法与普通建库方法比较。图3为3p 和3q 、3q 、5p 染色体不稳定分析结果图；其中a为3p 和3q ，b为3q ，c为5p 。图4为7p ，7q ，8q 染色体不稳定分析结果图；其中a为7p ，b为7q ，c为8q 。图5为9p-，9q-，9p-和9q-染色体不稳定分析结果图；其中a为9p-，b为9q-，c为9p-和9q-。图6为17p-，17q 染色体不稳定分析结果图；其中a为17p-，b为17q 。图7为本发明21个染色体及基因roc曲线图，其中auc为roc曲线下面积。图8为全基因组roc曲线图，其中auc为roc曲线下面积。具体实施方式下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1文库接头的制备本实施例接头序列由生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成。使用退火缓冲液(annealingbuffer)将48个接头序列中编号n-1和n-2的干粉分别稀释成20μm，将两者稀释液等比例混合，得到的24个混合液至于pcr仪中，运行程序如表1：表1待上述程序运行完成，取出24个接头混合液，等体积混合，制成混合接头。实施例221个染色体及基因不稳定作为分析标识诊断泌尿上皮细胞癌1、基因组片段化：取20ng人基因组dna，配制如表2所示的酶切反应体系，按照表3程序进行反应。本实施例中人基因组dna的浓度为2ng/μl，反应体系中需加入10μl。如果人基因组dna为无细胞的游离dna，如血液中的cfdna，则不需要经过基因组片段化，直接进入下步操作。表2振荡混匀、离心(避免气泡)后在pcr仪上运行以下程序：表32、接头连接反应：将接头连接预混液(15μl/样本)、接头连接增强剂(0.5μl/样本，外购neb公司)按照所检测的样本数目吸取适当的体积进行混合后，吸取15.5μl混合液加入到上一步的末端处理反应混合液中，振荡混匀、离心后再吸取1.5μl实施例1中制备的混合接头加入到上述反应液中，振荡混匀、离心。最终形成下表4中的反应体系。表4接头连接反应体系末端修复反应混合液(上一步)35μl接头连接预混液15μl接头连接增强剂0.5μl混合接头1.5μl总体系52μl将上述体系置于pcr仪中，运行程序：20℃，30min，热盖关闭。3、连接反应后纯化步骤：a、提前从磁珠试剂盒中取出文库纯化磁珠，室温静置至少30min，使用前需混匀。b、将上述步骤中的接头连接反应液转移到相应编号的1.5ml离心管，加入46μl重悬的文库纯化磁珠，使用适当量程的移液器匀速吸打20次，室温孵育5min。c、将离心管置于磁力架上，待溶液澄清后，弃上层清液。d、向其中加入新鲜配置的200μl80％的乙醇，静置30s后，弃上层清液。e、重复步骤d一次。f、磁力架上取下离心管，瞬时离心3sec，离心管放回磁力架上，吸弃掉残留的80％乙醇，注意不要吸到磁珠。打开管盖，室温晾干2-10min。g、待磁珠成亚光色，离心管中加入16μllowte缓冲液(或者无核酸酶水)，轻微震荡使磁珠重悬，室温孵育5min。h、将离心管置于磁力架上，静置2min。待溶液澄清后，取15μl上清留待下一步扩增反应。4、pcr扩增：依下表5，加入相应试剂至pcr管中：表5pcr反应体系接头连接纯化后产物15μlpcr扩增酶预混液25μlpcr扩增通用引物5μlpcr扩增标签引物5μl总体系50μl将混合好的pcr管放入至pcr仪中，运行以下程序：表65、pcr产物纯化参考步骤3纯化步骤，其中：步骤b中重悬的文库纯化磁珠的用量为22.5μl；步骤g中lowte缓冲液(或者无核酸酶水)加入量为31μl；步骤h中取30μl上清留待下一步操作。6、文库定量上机上述纯化文库使用agilentbioanalyzer生物芯片分析系统对片段大小进行分析，使用dsdnahsassaykit对文库质量浓度进行测量，通过质量浓度和片段大小计算文库摩尔浓度，根据上测序仪说明书使用illuminahiseqx-ten进行测序。结果分析讨论：上机测序数据经过本发明所述数据分析方法后，得到染色体测序深度分布图，如图3-6所示。分析结果由三部分组成：染色体编号，染色体分区以及染色体测序深度分布。染色体测序深度分布区域中圆点为染色体小区域拷贝数分布情况，当其在纵轴scores值在-3到3之间时判定无不稳定发生，当其scores值大于3时判定为扩增，当其scores值小于-3时判定为缺失，对于发生扩增或缺失的区域使用灰色背景与正常区域进行区分。通过分析结果查看是否有上述染色体不稳定发生，若发生判定为阳性，若未发生判定为阴性。将二代分析结果与病理结果进行比较，计算本分析方法的灵敏度和特异性，得到roc曲线，如图7所示。本方法roc曲线的auc面积达到0.944，说明使用本专利21个染色体及基因不稳定作为分析标识，通过二代测序诊断泌尿上皮细胞癌具有很高的灵敏度和特异性。实施例3本专利检测方法与常规方法比较当前临床上对于尿路上皮癌检测常用的方法为膀胱镜和尿细胞学，其中膀胱镜为有创检测，患者承受痛苦较多，因此尿细胞学在临床上应用广泛。本专利方法为无创检测方法，本实例将本专利方法与尿细胞学检测方法在检出能力上进行比较。收集52例尿路上皮癌患者尿液，一部分尿液按照本专利实施例2进行检测，同时另一部分尿液进行细胞学检测。细胞检测流程如下：留取患者晨尿100ml左右，使用清洁、干燥、一次性容器盛取尿液，1小时内送检，时间不宜过久，保持尿液新鲜，以免出现细胞溶解，尿液成分变化。去除尿液中肉眼可见的血凝块和组织碎块，充分震荡使尿液中细胞分布均匀。将全部尿液样本转移到100ml离心管中，离心机以600g的转速离心10分钟。倒去上步离心上清液，计入10-30mlcytorich红色固定液，震荡10-20秒，静置30min。再次放入离心机，600g转速离心10min后倒去上清液，充分震荡。加入10ml缓冲液，震荡后全部转移至12ml离心管内，再次以600g的转速离心5min，倒去上清液，充分震荡。将上述12ml离心管放入prepstiantm全自动细胞学制片染色系统，使用巴氏染色法染色。得到细胞学涂片后将玻片转移至无水乙醇里脱水10min，放入二甲苯进行透明10min，随后封固涂片进行显微镜下阅片。尿细胞学诊断分四个类别：阴性：上皮细胞改变在正常范围内，未见非典型细胞和恶性细胞；非典型尿路上皮细胞：上皮细胞异型性较反应性改变明显，但缺乏明确恶性特征；可疑癌细胞：上皮细胞的改变具有一定的恶性特征但在数量和质量上不足以诊断为癌；癌细胞：具有恶性特征得上皮细胞。统计分析时将细胞学结果中的阴性与非典型尿路上皮细胞归于阴性诊断，将可疑癌细胞与癌细胞归为阳性诊断。比较52例尿路上皮癌患者检测结果，本专利方法检出46例，尿细胞学检出27例，尿细胞学检出27例阳性中只有1例本专利方法未检出，本专利方法比尿细胞学多检出19例，因此本专利方法检出能力明显高于尿细胞学，具有更高的临床应用价值。序列表<110>苏州宏元生物科技有限公司<120>一种尿路上皮癌诊断和预后评估试剂盒<130>20200302<160>48<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>38<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1cgtgatagatcggaagagcacacgtctgaactccagtc38<210>2<211>39<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2acactctttccctacacgacgctcttccgatctatcacg39<210>3<211>38<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3acatcgagatcggaagagcacacgtctgaactccagtc38<210>4<211>39<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4acactctttccctacacgacgctcttccgatctcgatgt39<210>5<211>38<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5gcctaaagatcggaagagcacacgtctgaactccagtc38<210>6<211>39<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6acactctttccctacacgacgctcttccgatctttaggc39<210>7<211>38<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7tggtcaagatcggaagagcacacgtctgaactccagtc38<210>8<211>39<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8acactctttccctacacgacgctcttccgatcttgacca39<210>9<211>38<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9cactgtagatcggaagagcacacgtctgaactccagtc38<210>10<211>39<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>10acactctttccctacacgacgctcttccgatctacagtg39<210>11<211>38<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>11attggcagatcggaagagcacacgtctgaactccagtc38<210>12<211>39<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>12acactctttccctacacgacgctcttccgatctgccaat39<210>13<211>38<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>13gatctgagatcggaagagcacacgtctgaactccagtc38<210>14<211>39<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>14acactctttccctacacgacgctcttccgatctcagatc39<210>15<211>38<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>15tcaagtagatcggaagagcacacgtctgaactccagtc38<210>16<211>39<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>16acactctttccctacacgacgctcttccgatctacttga39<210>17<211>38<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>17ctgatcagatcggaagagcacacgtctgaactccagtc38<210>18<211>39<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>18acactctttccctacacgacgctcttccgatctgatcag39<210>19<211>38<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>19aagctaagatcggaagagcacacgtctgaactccagtc38<210>20<211>39<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>20acactctttccctacacgacgctcttccgatcttagctt39<210>21<211>38<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>21gtagccagatcggaagagcacacgtctgaactccagtc38<210>22<211>39<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>22acactctttccctacacgacgc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技术特征：1.一组染色体和基因不稳定区域在制备用于尿路疾病的检测、预后评估、筛查、早期筛查或病情监测的试剂或试剂盒中的用途，其特征在于，通过二代测序技术，检测染色体和基因的不稳定性，所述的染色体和基因不稳定区域包括以下21个：1q、3p、3q、4q、5p、5q、6q、7p、7q、8p、8q、9p、9q、10q、11p、17p、17q、18q、20q、e2f3、rb1。
2.一组染色体和基因不稳定区域在制备用于治疗或辅助治疗尿路疾病的药物中的用途，其特征在于，通过二代测序技术，检测染色体和基因的不稳定性，所述的染色体和基因不稳定区域包括以下21个：1q、3p、3q、4q、5p、5q、6q、7p、7q、8p、8q、9p、9q、10q、11p、17p、17q、18q、20q、e2f3、rb1。
3.根据权利要求1-2任意一项所述的用途，其特征在于，所述的尿路疾病为尿路上皮癌，所述的尿路上皮癌包括：肾盂癌、输尿管癌、膀胱癌、尿道上皮细胞癌中的一种或多种。
4.一种用于尿路疾病的检测、预后评估、筛查、早期筛查或病情监测的试剂或试剂盒，其特征在于，所述的试剂或试剂盒包含用于检测以下21个染色体和基因不稳定区域的试剂：1q、3p、3q、4q、5p、5q、6q、7p、7q、8p、8q、9p、9q、10q、11p、17p、17q、18q、20q、e2f3、rb1。
5.根据权利要求4所述的试剂或试剂盒，其特征在于，所述的尿路疾病为尿路上皮癌，所述的尿路上皮癌包括：肾盂癌、输尿管癌、膀胱癌、尿道上皮细胞癌中的一种或多种。
6.根据权利要求4所述的试剂或试剂盒，其特征在于，包含阳性参考品、阴性参考品、缓冲液、酶、文库接头、核酸提取试剂、核酸纯化试剂中的一种或多种。
7.根据权利要求6所述的试剂或试剂盒，其特征在于，所述的文库接头包含seqidno:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、和47所示的核苷酸序列。
8.根据权利要求6所述的试剂或试剂盒，其特征在于，所述的文库接头包含seqidno:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、和48所示的核苷酸序列。
9.根据权利要求6所述的试剂或试剂盒，其特征在于，所述的酶包含打断酶、dna聚合酶、dna连接酶中的一种或多种。
10.根据权利要求6所述的试剂或试剂盒，其特征在于，所述的阳性参考品为混合有权利要求1所述的21个区域变异的细胞系；所述的阴性参考品为无染色体变异的细胞系。
技术总结本发明提供一种尿路上皮癌诊断和预后评估试剂盒。所述的试剂盒通过二代测序技术，检测染色体和基因的不稳定性，所述的染色体和基因不稳定区域包含以下21个：1q、3p、3q、4q、5p、5q、6q、7p、7q、8p、8q、9p、9q、10q、11p、17p、17q、18q、20q、E2F3、RB1。本发明对临床上尿路上皮癌的诊断、治疗、监测及预后评估具有很大的意义，为下一步进行早期诊断和制定个体化治疗方案提供科学依据。
技术研发人员：钱自亮;王白云;徐文胜;王艳红
受保护的技术使用者：苏州宏元生物科技有限公司
技术研发日：2020.03.09
技术公布日：2020.06.09
