本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种基于实时荧光环介导等温扩增(real-timefluorescenceloop-mediatedisothermalamplification，realamp)技术的大西洋三文鱼(salmosalar)快速检测方法的建立。
背景技术：
大西洋三文鱼(salmosalar)属于鲑形目(salmoniformes)鲑科(salmonidae)鲑属(salmo)，其肌肉坚实而富有弹性，白色纹理清晰，肉质鲜美，口感颇佳，被国际美食界被誉为“冰海之皇”。
大西洋三文鱼原产于北大西洋及周边的一些海域，英文得名为atlanticsalmon。大西洋三文鱼是迄今为止世界上最重要的养殖鱼类种类之一，由于其具有生长速度快，抗病力强，经济价值高等特点，也是目前人工养殖生产最多的冷水性鱼类。
20世纪60年代，大西洋三文鱼于挪威人工养殖成功。因具备良好的自然环境，海水网箱养殖是挪威进行大西洋鲑成鱼培养的主要方式。网箱通常布置在岛屿周围或者峡湾中，水质良好且可提高躲避自然灾害的能力。现在除挪威外，欧洲的丹麦法罗群岛、爱尔兰，北美加拿大，南美的智利以及澳洲都有大量饲养。其中智利有日资大量投入并主要销往日本，产量已接近挪威。目前，国内在山东有专业的大西洋三文鱼循环水池养殖，大型沉水网箱已投入建设，并在不久的将来会投入黄渤海区。
大西洋三文鱼作为低热量、高蛋白的健康食品，富含深海鱼油(不饱和脂肪酸，omega-3)，二十二碳六烯酸(dha，脑黄金)、多种维生素以及矿物质，对高血压、心脏病、乳腺癌、关节炎等疾病均有益处，深受消费者的青睐。
近年来，我国大西洋三文鱼及其制品掺假情况日益严重，其中以次充好、近缘鱼种假冒替代现象时有发生。cawthorn等在南非市场上发现大西洋三文鱼片被廉价的虹鳟鱼片替代。最近在马德里餐馆进行的一项调查发现，大西洋三文鱼被狗鲑和马苏鱼替代。我国的一些不法商家为了牟取暴利，将低价的虹鳟鱼(oncorhynchusmykiss)来替代高价的大西洋三文鱼，严重地损害了消费者的利益。就市场上出售的大西洋三文鱼而言，有较多经过加工的产品。如通过切片后的生鲜冷冻生鱼片、寿司等产品，或者是经过水浸或者油浸加工处理后的罐头制品，还有进行切片后烘烤的干制品、烟熏制品等，较少以鲜活的整鱼进行出售。因而，通过形态学的方法对大西洋三文鱼鱼产品达到物种鉴定的目的相对来说就变得比较困难。因此，急需一种大西洋三文鱼鱼快速、准确的鉴定方法为相关部门提供技术支撑。
现有的鉴别大西洋三文鱼的技术主要是基于pcr技术，如扩增片段长度多态性(amplifiedfragmentlengthpolymorphis，aflp)、微卫星(simplesequencerepeats，ssr)、dna条形码(dnabarcoding)，实时pcr(real-timepcr)和多重pcr(multiplexpcr)技术等。然而，所有这些基于pcr技术的存在要求检验人员有丰富的操作经验、要求专门的检测设备等缺点。相比之下，实时荧光环介导等温扩增技术(real-timefluorescenceloop-mediatedisothermalamplification，realamp)是一种新的dna扩增方法。该技术依赖于自动循环的链置换反应，通过识别靶序列上6个特异区域的引物和具有链置换的dna聚合酶，在等温条件下扩增不到1h，可合成109～1010个数量级的目标dna，具有快速高效、操作简便、特异性强、灵敏度高等特点。专利(201310038388.x)提供一种利用普通pcr技术检测大西洋三文鱼的鉴别方法，专利(cn201510482509.9)提供了一种利用荧光定量pcr技术检测大西洋三文鱼的鉴别方法，该两种方法与本发明相比，具有反应时间久，要求检验人员有丰富的操作经验，要求专门的检测设备，无法实现现场检测的缺点。
技术实现要素：
发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种检测大西洋三文鱼的引物组、试剂盒和检测方法。
为了解决上述技术问题，本发明公开了一种检测大西洋三文鱼的引物组，所述的引物组是由以下4条特异性引物构成的：核苷酸序列如seqidno.1所示的上游外引物f3、核苷酸序列如seqidno.2所示的下游外引物b3、核苷酸序列如seqidno.3所示的上游内引物fip、核苷酸序列如seqidno.4所示的下游内引物bip。
包括权利要求1所述的引物组的检测大西洋三文鱼的试剂盒也在本发明的保护范围之内。
其中，上游外引物f3、下游外引物b3、上游内引物fip和下游内引物bip的浓度均为10μm。
其中，所述的试剂盒还包括阴性对照品、dna提取试剂、realamp反应试剂和电泳检测试剂。
其中，所述的阴性对照品为ddh2o，或超纯水高温灭菌即可。
其中，所述的dna提取试剂为天根生化科技有限公司产的型号为dp304的dna提取试剂盒。
其中，所述的realamp反应试剂为25μl的体系：10mm的dntpmix3μl、8000u/ml的bstdna聚合酶1μl、100mm的mgso41μl、10×thermopol缓冲液2.5μl、5倍的sybrgreeni1μl、10μm的上游外引物f31μl、10μm的下游外引物b31μl、10μm的上游内引物fip3μl、10μm的下游内引物bip3μl、25ng/μldna模板2μl、剩下的为灭菌水，具体见表1。
其中，酶活力单位(u)，酶活力单位：用来表示酶活力大小的单位，通常用酶量来表示。定义：其中一个称酶活力国际单位，规定为：在特定条件下，1分钟内转化1微摩尔底物，或者底物中1微摩尔有关基团所需的酶量，称为一个酶活力国际单位(iu，又称u)
表1
其中，所述的电泳检测试剂为6×loadingbuffer(宝日医生物技术有限公司)、琼脂糖凝胶(西班牙biowest公司)、gelredtm核酸凝胶染料(美国biotium公司)和biodl100(日本bioflux株式会社)。
采用上述试剂盒进行检测的方法也在本发明的保护范围之内，其包括如下步骤：
(1)dna提取试剂：采用天根生化科技有限公司产的型号为dp304的dna提取试剂盒；
(2)样品组realamp反应体系：25μl的体系：10mm的dntpmix3μl、8000u/ml的bstdna聚合酶1μl、100mm的mgso41μl、10×thermopol缓冲液2.5μl、5倍的sybrgreeni1μl、10μm的上游外引物f31μl、10μm的下游外引物b31μl、10μm的上游内引物fip3μl、10μm的下游内引物bip3μl、25ng/μldna模板2μl、剩下的为灭菌水；
(3)荧光检测：将步骤(2)制得的样品组于65℃恒温80min，利用罗氏荧光pcr仪
(4)判断结果：当荧光检测中有“s”型扩增曲线则为阳性，无“s”型扩增曲线则为阴性。
步骤(3)中，由于bst酶80℃就失活了，灭活后就不会再进行反应，可保证产物恒定，因此，每分钟收集荧光主要是看65℃反应情况的，80℃反应可不进行荧光采集。
优选地，所述的方法还包括如下步骤：将步骤(3)所得的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测；具体的为配置2％琼脂糖凝胶，并加gelredtm核酸凝胶染料染色，倒入电泳板中凝固备用。在100μl离心管中吸取2.5μl产物和2.5μl的6×loadingbuffer，混匀；以水作为阴性对照，以biodl100作为marker；将产物及缓冲液的混合液加入凝固的凝胶槽中，电压设定150v，时间设定为35min；检测：当有梯形条带时则为阳性，无梯形条带时则为阴性。
优选地，所述的方法还包括如下步骤：在步骤(3)所述的扩增产物中添加0.2μlsybrgreeni(10000×)，在日光和紫外下进行可视化检测；在日光下呈黄色时为阳性，呈橘色时阴性；在紫外下，呈荧光黄绿色时为阳性，呈橘色时为阴性。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优势：
(1)本发明基于大西洋三文鱼的线粒体cytb基因设计特异性引物，可以对大西洋三文鱼进行定性检测，检测限达5pg。
(2)本发明检测时间大约仅需30min。
附图说明
图1为本发明中不同mg2 体系终浓度条件下测得的realamp体系试验荧光图，图中所示(-)为未加dna的阴性对照，其余曲线分别为mg2 终浓度为0mm、2mm、4mm、6mm条件下测得的实时荧光扩增曲线。
图2为本发明中不同f3/b3体系终浓度条件下测得的realamp体系试验荧光图，图中所示(-)为未加dna的阴性对照，其余曲线分别为f3/b3终浓度为0.2μm、0.4μm、0.6μm、0.8μm、1μm条件下测得的实时荧光扩增曲线。
图3为本发明中不同fip/bip体系终浓度条件下测得的realamp体系试验荧光图，图中所示(-)为未加dna的阴性对照，其余曲线分别为fip/bip终浓度为0.4μm、0.8μm、1.2μm、1.6μm条件下测得的实时荧光扩增曲线。
图4为本发明中不同dntpmix体系终浓度条件下测得的realamp体系试验荧光图，图中所示(-)为未加dna的阴性对照，其余曲线分别为dntpmix终浓度为1mm、1.2mm、1.4mm、1.6mm、1.8mm条件下测得的实时荧光扩增曲线。
图5为本发明中不同10×thermopol缓冲液体系添加量条件下测得的realamp体系试验荧光图，图中所示(-)为未加dna的阴性对照，其余曲线分别为10×thermopol缓冲液添加量为0.5μl、1.5μl、2.5μl、3.5μl、4.5μl条件下测得的实时荧光扩增曲线。
图6为本发明中不同倍数的sybrgreeni染料条件下测得的realamp体系试验荧光图，图中所示(-)为未加dna的阴性对照，其余曲线分别为1倍、3倍、5倍、7倍、9倍、11倍、13倍、15倍sybrgreeni染料条件下测得的实时荧光扩增曲线。
图7为本发明realamp检测方法的特异性验证结果图。(a)为realamp实时荧光的扩增曲线结果。(-)代表未加dna的阴性对照。(b)为添加0.2μlsybrgreeni(10000×)在日光下的可视化检测结果。(c)为添加0.2μlsybrgreeni(10000×)在紫外下的可视化检测结果。(d)为2％琼脂糖凝胶电泳的检测结果。其中01和02为大西洋三文鱼(salmosalar)，03和04为虹鳟鱼(oncorhynchusmykiss)、05和06为狗鲑(o.keta)、07和08为马苏鱼(o.masou)、09和10为红鲑(o.nerka)、11和12为粉鲑(o.gorbuscha)、13和14为帝王鲑(o.tshawytscha)，15和16为西鲤(cyprinuscarpio)、17和18为刀鲚(coiliaectenes)、19和20为小黄鱼(larimichthyspolyactis)、21和22为日本真鲈(lateolabraxjaponicus)、23和24为未加dna的阴性对照，m为100bp的marker。
图8为本发明realamp检测方法的灵敏度验证结果。(e)为realamp实时荧光的扩增曲线结果。(-)代表未加dna的阴性对照。(f)为添加0.2μlsybrgreeni(10000×)在日光下的可视化检测结果。(g)为添加0.2μlsybrgreeni(10000×)在紫外下的可视化检测结果。(h)为2％琼脂糖凝胶电泳的检测结果。01和02为50ng/μl、03和04为5ng/μl、05和06为0.5ng/μl、07和08为0.05ng/μl、09和10为5pg/μl、11和12为0.5pg/μl、13和14为0.05pg/μl、15和16为5fg/μl、17和18为0.5fg/μl、19和20为阴性对照，m为100bp的marker。
图9为市售样品的realamp检测方法验证。01-29分别为从网络电商平台采集29份商品名标注为“三文鱼”的鱼肉样品，30为未加dna的阴性对照，m为100bp的marker。(i)为realamp实时荧光的扩增曲线结果。(-)代表未加dna的阴性对照。(j)为添加0.2μlsybrgreeni(10000×)在日光下的可视化检测结果。(k)为添加0.2μlsybrgreeni(10000×)在紫外下的可视化检测结果。(l)为2％琼脂糖凝胶电泳的检测结果。
图10为本发明realamp检测体系与生工公司试剂盒体系对比结果；(-)代表未加dna的阴性对照。
图11为生工公司试剂盒方法灵敏度检测结果。(m)为添加0.2μlsybrgreeni(10000×)在日光下的可视化检测结果。(n)为添加0.2μlsybrgreeni(10000×)在紫外下的可视化检测结果。(p)为2％琼脂糖凝胶电泳的检测结果；01和02为50ng/μl、03和04为5ng/μl、05和06为0.5ng/μl、07和08为0.05ng/μl、09和10为5pg/μl、11和12为0.5pg/μl、13和14为0.05pg/μl、15和16为5fg/μl、17和18为0.5fg/μl、19和20为阴性对照，m为100bp的marker。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实验例1：
本发明建立的方法主要分为样品采集，dna提取，realamp特异性引物的设计，realamp体系建立并优化，特异性试验，灵敏性试验，realamp方法适用性分析7个步骤。
样品采集：本试验共采集11个鱼类品种，包括鲑科品种7个(大西洋三文鱼salmosalar、虹鳟鱼oncorhynchusmykiss、狗鲑o.keta、马苏鱼o.masou、红鲑o.nerka、粉鲑o.gorbuscha、帝王鲑o.tshawytscha)，非鲑科品种4个(西鲤cyprinuscarpio、刀鲚coiliaectenes、小黄鱼larimichthyspolyactis、日本真鲈lateolabraxjaponicus)。同时，从本地市场采集29份商品名标注为“三文鱼”的市售鱼肉制品。
dna提取：采用细胞/血液/组织基因组dna提取试剂盒(天根生化科技有限公司，dp304)提取总dna。采用biophotometerd30核酸蛋白测定仪(德国eppendorf公司)测定dna浓度和纯度，并将dna置于-20℃保存备用。经测定，所有样品dna的a260/280值在1.7-2.0范围内，表明提取的dna中蛋白质残留较少，适用于后续的分子检测。
realamp特异性引物的设计：从genebank数据库下载大西洋三文鱼(eu492280、ky122205、hq167697、jx960833)的cytb基因序列，并使用bioedit软件进行比对，选择大西洋三文鱼的保守区域。使用primerexplorerv5软件(http://primerexplorer.jp/lampv5e/index.html)基于大西洋三文鱼cytb基因的保守区域设计realamp引物组。在引物筛选时需确保大西洋三文鱼和非目标物种(虹鳟鱼、狗鲑、马苏鱼、红鲑、粉鲑、帝王鲑)之间的充分错配，以保证引物的特异性。引物序列如下表1。
表1
realamp反应体系优化：
设置mg2 体系终浓度梯度为0mm、2mm、4mm、6mm，阴性对照的终浓度为6mm，其他条件下相同。由图1可以看出mg2 终浓度为4mm，所需扩增时间最短，将4mm作为mg2 的最优体系终浓度。其中，全文的阴性对照均指空白对照，即不含有物种dna的ddh2o。
设置f3/b3体系终浓度梯度为0.2μm、0.4μm、0.6μm、0.8μm、1μm，阴性对照的终浓度为0.2μm，其他条件下相同。由图2可以看出f3/b3终浓度为0.4μm，所需扩增时间最短，将0.4μm作为f3/b3的最优体系终浓度。
设置fip/bip体系终浓度梯度为0.4μm、0.8μm、1.2μm、1.6μm，阴性对照的终浓度为0.8μm，其他条件下相同。由图3可以看出fip/bip终浓度为1.2μm，所需扩增时间最短，将1.2μm作为fip/bip的最优体系终浓度。
设置dntpmix体系终浓度梯度为1mm、1.2mm、1.4mm、1.6mm、1.8mm，阴性对照的终浓度为1.4mm，其他条件下相同。由图4可以看出dntpmix终浓度为1.2mm，所需扩增时间最短，将1.2mm作为dntpmix的最优体系终浓度。
设置10×thermopol缓冲液体系添加量梯度为0.5μl、1.5μl、2.5μl、3.5μl、4.5μl，阴性对照的添加量为2.5μl，其他条件下相同。由图5可以看出10×thermopol缓冲液体系添加量为2.5μl，所需扩增时间最短，将2.5μl作为10×thermopol缓冲液的最优添加量。
设置sybrgreeni染料浓度梯度为1倍、3倍、5倍、7倍、9倍、11倍、13倍、15倍sybrgreeni染料，阴性对照的为5倍的sybrgreeni染料，其他条件下相同。由图6可以看出sybrgreeni染料浓度为1、3、5倍，所需扩增时间最短。因此确定将1、3、5倍sybrgreeni染料为最优浓度。由图可知，选择1、3、5倍sybrgreeni染料的反应体系效果相同，但sybrgreeni是需要避光保存的试剂，若1倍的sybrgreeni染料久置或者遇光，可能会导致分解，则无法达到1-5倍的浓度要求。而5倍的sybrgreeni染料即使分解部分，仍可达到1-5倍的浓度要求。因此，在最终体系中选择5倍的sybrgreeni染料。
realamp体系确定：25μl的体系：10mm的dntpmix3μl、8000u/ml的bstdna聚合酶1μl、100mm的mgso41μl、10×thermopol缓冲液2.5μl、5倍的sybrgreeni1μl、10μm的上游外引物f31μl、10μm的下游外引物b31μl、10μm的上游内引物fip3μl、10μm的下游内引物bip3μl、25ng/μldna模板2μl、剩下的为灭菌水。
反应条件为65℃恒温80min利用罗氏荧光pcr仪
特异性验证：以大西洋三文鱼和其他10个非特异性物种的dna为模板，进行realamp扩增，验证引物的特异性，结果如图7所示。图(a)中，只有大西洋三文鱼(s.salar)具有特异性扩增曲线。图(b)、(c)、(d)中只有大西洋三文鱼(即01和02)具有阳性反应。因此，本发明设计的引物对大西洋三文鱼具有特异性。
灵敏性试验：将大西洋三文鱼的基因组dna进行倍比稀释，浓度设定为成50ng/μl、5ng/μl、0.5ng/μl、0.05ng/μl、5pg/μl、0.5pg/μl、0.05pg/μl、5fg/μl、0.5fg/μl。作为反应模板进行realamp扩增，确定所立方法的灵敏度，结果如图8所示。由图(e)可知，该方法灵敏度可达5pg。由图(f)、(g)、(h)也可知，该方法灵敏度可达5pg。
方法适用性分析：从本地市场采集29份商品名标注为“三文鱼”的市售鱼肉制品。按照上述方法进行realamp扩增结果。结果如图9所示。由图(i)可知01、02、03、04、05、28具有特异性扩增曲线。由图(j)、(k)、(l)仍可知01、02、03、04、05、28具有特异性扩增曲线。结果表明，本方法适用于大西洋三文鱼的物种鉴定工作，准确度高，特异性好，操作便捷，可以用于实际样品的检测。
对比例1
使用生工公司等温扩增试剂盒进行realamp反应。反应体系25μl，含12.5μl2×lampmastermix、1udna聚合酶、上游外引物(f3)0.2μm、下游外引物(b3)0.2μm、上游内引物(fip)0.8μm、下游内引物(bip)0.8μm、50ng模板dna，剩下的用灭菌水补齐。所用引物序列、反应条件、检测方法均与本发明相同。
由图10可知，本发明体系约30min即可完成“s”型曲线扩增，而等温扩增试剂盒则约60min才可完成“s”型曲线扩增，节约时间约30min。图11为生工公司试剂盒方法对于大西洋三文鱼的灵敏度检测结果。图(m)、(n)、(p)均在01、02、03、04处出现阳性反应，即生工公司试剂盒方法灵敏度为0.5ng，而本发明方法的灵敏度由图8可知，可达5pg。因此，本发明能够有效减少时间，且检测限更低。
本发明提供了一种检测大西洋三文鱼的引物组、试剂盒和检测方法的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。
序列表
<110>南京工业大学
<120>一种检测大西洋三文鱼的引物组、试剂盒和检测方法
<160>4
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>19
<212>dna
<213>上游外引物(f3)
<400>1
tccgcctcatatcaagcct19
<210>2
<211>20
<212>dna
<213>下游外引物(b3)
<400>2
tgcctccaattcaggtaagg20
<210>3
<211>46
<212>dna
<213>上游内引物(fip)
<400>3
ggcgagtactccgcctagtttgttttacttcctattcgcctacgca46
<210>4
<211>44
<212>dna
<213>下游内引物(bip)
<400>4
cgtccccatcctccatacctctttttcgctaccagggtccagaa44
1.一种检测大西洋三文鱼的引物组，其特征在于，所述的引物组是由以下4条特异性引物构成的：核苷酸序列如seqidno.1所示的上游外引物f3、核苷酸序列如seqidno.2所示的下游外引物b3、核苷酸序列如seqidno.3所示的上游内引物fip、核苷酸序列如seqidno.4所示的下游内引物bip。
2.一种检测大西洋三文鱼的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物组。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，上游外引物f3、下游外引物b3、上游内引物fip和下游内引物bip的浓度均为10μm。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括dna提取试剂、realamp反应试剂和电泳检测试剂。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的dna提取试剂为天根生化科技有限公司产的型号为dp304的dna提取试剂盒。
6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的realamp反应试剂为25μl的体系：10mm的dntpmix3μl、8000u/ml的bstdna聚合酶1μl、100mm的mgso41μl、10×thermopol缓冲液2.5μl、5倍的sybrgreeni1μl、10μm的上游外引物f31μl、10μm的下游外引物b31μl、10μm的上游内引物fip3μl、10μm的下游内引物bip3μl、25ng/μldna模板2μl、剩下的为灭菌水。
7.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的电泳检测试剂为6×loadingbuffer、琼脂糖凝胶、gelredtm核酸凝胶染料和biodl100。
8.采用权利要求2～7中任意一项所述的试剂盒进行检测的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)dna提取试剂：采用天根生化科技有限公司产的型号为dp304的dna提取试剂盒；
(2)样品组realamp反应体系：25μl的体系：10mm的dntpmix3μl、8000u/ml的bstdna聚合酶1μl、100mm的mgso41μl、10×thermopol缓冲液2.5μl、5倍的sybrgreeni1μl、10μm的上游外引物f31μl、10μm的下游外引物b31μl、10μm的上游内引物fip3μl、10μm的下游内引物bip3μl、25ng/μldna模板2μl、剩下的为灭菌水；
(3)荧光检测：将步骤(2)制得的样品组于65℃恒温80min，利用罗氏荧光pcr仪
(4)判断结果：当荧光检测中有“s”型扩增曲线则为阳性，无“s”型扩增曲线则为阴性。
9.根据权利要求8所述的检测的方法，其特征在于，其还包括如下步骤：将权利要求8步骤(3)所得的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测；当有梯形条带时则为阳性，无梯形条带时则为阴性。
10.根据权利要求8所述的检测的方法，其特征在于，其还包括如下步骤：在权利要求8步骤(3)所得的扩增产物中添加0.2μlsybrgreeni(10000×)，在日光和紫外下进行可视化检测；在日光下呈黄色时为阳性，呈橘色时阴性；在紫外下，呈荧光黄绿色时为阳性，呈橘色时为阴性。
技术总结