本发明属于水产动物dna分子标记的技术领域，具体涉及一种三疣梭子蟹耐盐碱的分子标记c325及其应用。
背景技术：
三疣梭子蟹(portunustrituberculatus)属甲壳纲、十足目、梭子蟹科，俗称梭子蟹，是我国重要的大型海洋经济蟹类。梭子蟹肉质鲜美、营养丰富，深受消费者喜爱。盐碱水域是一种世界性的低产水资源，仅中国就有4587万hm2盐碱水域，由于具有高盐度、高碱度、高ph以及复杂离子组成等特点，一般常规的水产动物无法在其中正常生存繁殖，很大程度上阻碍了该类水资源的开发利用。三疣梭子蟹在高盐碱刺激下会对其生理生化造成一定的影响，而且高盐碱会使幼蟹的摄食率、变态率和存活率下降。因此，耐盐碱性状是三疣梭子蟹重要的育种性状之一，对于提高梭子蟹的养成率及促进其在盐碱地的养殖推广具重要意义。然而，耐盐碱性状具明显的低遗传力特征，通过传统的育种方法遗传进展缓慢，迫切需要借助先进的分子标记辅助育种技术以加快选育进程，而耐盐碱分子标记的鉴定及创新应用是开展分子标记辅助育种的必要前提和途径。
目前有关三疣梭子蟹耐盐碱的分子标记开发的研究较少，并且产业中缺乏可应用于分子标记辅助育种的标记。因此，开发耐盐碱性状相关分子标记对梭子蟹的健康养殖及选育具有重要的意义。
技术实现要素：
本发明提供了一种三疣梭子蟹耐盐碱的分子标记c325及其应用，本发明利用测序数据的多态性位点过滤及比对分析、pcr测序的方法，得到snp和indel标记，再经过对标记的逐步筛选和验证，最终获得一个新的三疣梭子蟹耐盐碱的分子标记c325，该分子标记有利于三疣梭子蟹耐受盐碱性状的选育。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明提供了一种三疣梭子蟹耐盐碱的分子标记c325，所述分子标记c325的核苷酸序列如seqidno.1所示。
进一步的，所述分子标记c325为indel标记。
进一步的，所述分子标记c325的盐碱耐受基因型为缺失纯合基因型。
本发明还提供了用于检测权利要求1所述的分子标记c325的引物对，所述引物中的正向引物的核苷酸序列如seqidno.2所示，反向引物的核苷酸序列如seqidno.3所示。
本发明还提供了所述的分子标记c325在筛选三疣梭子蟹耐受盐碱性状品种中的应用。
进一步的：所述应用步骤为：提取三疣梭子蟹待测试样品的dna并将其作为模板，使用分子标记c325的扩增引物进行pcr扩增，并将pcr产物进行测序，如果测序结果中分子标记c325的基因型为缺失纯合基因型，则待测试样品选择作为培育三疣梭子蟹耐盐碱品种的亲本。
进一步的：所述pcr扩增体系为：模板1μl，正向引物(10μm)0.2μl，反向引物(10μm)0.2μl，buffer缓冲液1μl，dntps0.8μl，hifi0.2μl，ddh2o6.6μl。
进一步的：所述pcr扩增程序为：预变性94℃2-5min；变性94℃30s，退火55℃30s，延伸72℃1-2kb/min，共重复35个循环；最后延伸72℃5-10min。
本发明还提供了所述的分子标记c325在三疣梭子蟹遗传多样性分析、种质鉴定和遗传图谱构建中的应用。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：
1、本发明提供的三疣梭子蟹耐盐碱的分子标记c325可以不受三疣梭子蟹生长阶段的限制，能够用于三疣梭子蟹早期蟹苗的选育，进而明显加快三疣梭子蟹的选育进程以及快速选育出具备耐受盐碱优良性状的蟹种。
2、利用本发明提供的分子标记c325检测三疣梭子蟹耐盐碱的性状，方法准确可靠、操作简单，能够有效、快速的筛选出符合要求的性状，辅助早期实现短时间、低成本的选育出耐受盐碱的三疣梭子蟹的品种，增加优良品质的三疣梭子蟹数量，提高三疣梭子幼蟹的摄食率、变态率及养成率，进而提高梭子蟹产量，促进其健康繁殖，因此具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为本发明以筛选的敏感群体混合模板和耐感群体混合模板两组对应位置差异明显的引物进行pcr扩增后的产物的凝胶电泳条带结果。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细的说明。
本发明所用的三疣梭子蟹均来自中国水产科学研究院黄海水产研究所昌邑海丰水产有限公司实验基地，通过拖网捕捞的方法随机从池塘中获得健康活泼的三疣梭子蟹，短暂安置于网筐之中并铺上一层水草以防止螃蟹打斗，最后获得体重35±3g的三疣梭子蟹300只，放置于4个养殖池(500cm×300cm×150cm)中暂养7d，暂养期间水温保持在22±1℃，加水至20cm，碳酸盐碱度为4mmol/l，ph8.2±0.5，持续供氧，每天早上8点更换新鲜海水，下午5点投喂新鲜杂鱼，喂食量约为螃蟹总重量的1/3。7d后挑选活力、形态较好的梭子蟹进行后续实验。
正式实验时把活力旺、体表完好的螃蟹放置于4个水泥池中，每池50只螃蟹，利用碳酸氢钠将海水碳酸盐碱度先调为25mmol/l，此时水体ph为8.0±0.5，水温保持在22±1℃，水深20cm。下午5点投喂新鲜杂鱼，喂食量约为螃蟹重量的1/4，保证池底无大量饵料残留影响水质。记录首先死亡的20只螃蟹的死亡时间、体重、褪壳期等数据，24h后增加碳酸盐碱度至35mmol/l，此时水体的ph为8.5±0.5，水温保持在22±1℃。继续记录死亡时间和数量等数据，直至4个池中幸存螃蟹数量为20只时停止实验。最先死亡的20个个体认为是盐碱敏感组(记为q)，最后存活的20个个体认为是盐碱耐受组(记为h)，解剖取肌肉组织于冻存管中，放于液氮保存。
实施例1
一、耐盐碱性状相关候选分子标记筛选
1、测序数据过滤和比对
采用全式金公司的试剂盒进行dna的提取，利用硅胶膜离心柱特异吸附dna原理进行dna提取。首先，将大约30mg的组织样品放到无菌的1.5ml的离心管，加入200μllysisbuffer8(lb8)和20μlrnasea(10mg/m1)，振荡10s左右的时间，室温条件下孵育2min，加入20μlproteinasek(20mg/ml)，充分振荡混匀，55℃孵育至完全裂解，加入1.5倍体积的bindingbuffer8(bb8)，混匀后加入离心柱中，在高速低温冷冻离心机(型号为eppendorf5804r)中12000rpm离心30s，弃废液。然后加入500μl的cleanbuffer8(cb8)，12000rpm离心30s，弃废液(重复一次)，再加入500μl的washbuffer8(wb8)，12000rpm离心30s，弃废液(重复一次)，12000rpm空离2min，以彻底除去残留的wb8。将离心柱置于一干净的离心管中，在柱的中心加入50微升elutionbuffer(eb)，室温静置2min，12000rpm离心1min，洗脱dna。通过琼脂糖凝胶电泳分析dna的纯度和完整性；利用nanodrop检测dna的纯度(od260/280比值)，利用qubit对dna浓度进行精确定量。
将检验合格的dna样品等量混合为两个混合池，分别命名为盐碱敏感dna混合池(sg)和盐碱耐受dna混合池(tg)。混合dna样品通过covaris破碎机随机打断成长度为350bp的片段，采用truseqlibraryconstructionkit进行建库，dna片段经末端修复、加ploya尾、加测序接头、纯化、pcr扩增等步骤完成整个文库制备。构建好的文库通过illuminahiseqpe150进行测序。对测序得到的rawreads进行过滤，得到cleanreads，用于后续分析，测序数据结果见表1。
表1测序数据质量汇总
过滤后的有效数据通过burrows-wheeleralignmenttool(bwa)软件进行比对，比对结果经samtools去除重复。所有样本的比对率在84.94％～86.21％之间，平均覆盖深度在44.65x～48.31x之间，1x覆盖度(至少有一个碱基的覆盖)在80.37％以上。比对结果正常，可用于后续的变异检测及相关分析。
2、标记检测及注释
通过genomeanalysistoolkit3.8(gatk)软件中的unifiedgenotyper模块检测snp和indel，indel过滤参数设置为qd＜4，fs＞200，最终获得的indel标记总数为1,427,108个。
3、indel频率差异分析
分析计算两组个体在每个位点的indel-index，并对多态性位点进行过滤，过滤标准如下：
(1)两组个体中indel-index频率都小于0.3；
(2)过滤掉一个个体中indel缺失的位点。
同时计算indel的频率差异分布，方向如下：△(index)＝index(耐盐碱性状)-index(盐碱敏感性状)，过滤掉△index小于0.3的位点，最后得到组间差异的indel1051个，上述均为耐盐碱相关候选分子标记，候选indel的结果统计如表2所示。
表2indel检测与注释统计结果
4、标记筛选
对候选的indel标记进行筛选，挑选个体中all-index接近0的位点或者挑选个体中all-index接近1的位点作为下一步验证的优先选择位点。筛选标准如下：
根据indel位点的注释信息，在根据△index进行从高到低进行排序的基础上，优先选择插入或缺失碱基大于5个的位点。
最终筛选出盐碱胁迫前后频率差异较大的标记，共筛选出11个indel标记
二、耐盐碱相关分子标记验证
采用pcr产物测序的方法在sg和tg群体里对耐盐碱性状相关候选分子标记进行验证：
(1)首先在标记位点侧翼序列设计引物，其中至少有一条引物距离标记位点70bp以上；
(2)利用设计好的引物分别以sg和tg组个体dna材料为模板进行pcr扩增，并将成功扩增的pcr产物进行2％的琼脂糖凝胶电泳分析；
(3)根据电泳结果统计每个个体的基因型，并通过spss软件分析标记与耐盐碱性状是否相关。
具体的操作步骤如下：
1、pcr扩增
本发明中的pcr扩增体系为：模板1μl，正向引物(10μm)0.2μl，反向引物(10μm)0.2μl，buffer缓冲液1μl，dntps0.8μl，hifi0.2μl，ddh2o6.6μl。
按照上述体系加入样品后，再按照如下的反应条件进行pcr扩增：预变性94℃2-5min；变性94℃30s，退火55℃30s，延伸72℃1-2kb/min，共重复35个循环；最后延伸72℃5-10min；4℃保存。
2、电泳检测
用琼脂糖配置2％的电泳胶，将一定量比的琼脂糖和tae混合后放在微波炉里加热至溶解为无色透明液体，倒入制胶模具中并插入梳子，静置20min凝固后拔出梳子，把制好的琼脂糖凝胶放入水平电泳槽中，点样孔位于负极，以浓度为0.5％的tae为缓冲液，选用genegreen为核酸染色剂，将混合模板的pcr产物用移液枪吸出3ul点到样孔中，然后将电压和电流分别调至120v、60ma，设定时间为30min进行凝胶电泳，待到染色区带到达凝胶2/3处时停止，电泳结束后用凝胶成像系统观察并拍照记录。
3、统计分析
根据电泳条带对个体进行标记分型，统计各基因型数量，将个体基因型信息导入spss软件，利用卡方检验方法计算p值，选出p＜0.05引物，最后共验证了7个indel标记。
根据表3所示，可以看出在c325中缺失纯合基因型在存活组中占比80％，而在早期死亡个体中杂合基因型占比45％，该组数据p值为0.000，具有显著差异性，因此可认为在该位点缺失纯合基因型为盐碱耐受基因型。c325分子标记的核苷酸序列如seqidno.1所示，其中开发该分子标记的扩增引物如seqidno.2和seqidno.3所示(表4)。
表3c325分子标记的基因型结果
表4分子标记的扩增引物
本发明获得的分子标记c325能够用来辅助选育三疣梭子蟹耐盐碱品种，应用步骤简单来说为：提取三疣梭子蟹待测试样品的dna并将其作为模板，使用分子标记c325的扩增引物进行pcr扩增，并将pcr产物进行测序，如果测序结果中分子标记的基因型为缺失纯合基因型，则待测试样品可以选择作为培育三疣梭子蟹耐盐碱品种的亲本。另外，分子标记还能够用来分析三疣梭子蟹遗传的多样性、种质鉴定以及构建三疣梭子蟹的遗传图谱。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
序列表
<110>中国水产科学研究院黄海水产研究所
<120>一种三疣梭子蟹耐盐碱的分子标记c325及其应用
<160>3
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>1028
<212>dna
<213>三疣梭子蟹(portunustrituberculatus)
<400>1
aaacaaaaaataaataaacaaacaaacaaacaaaacaaataaataaatattaatcagcaa60
tcaatcgctttcttgaagtggctcgcgcgcacacacaaataaaaaaaagtaaaataaaaa120
aaaaaaataaaaataaaaaaaaaaggacaatctttcgcctccaaaaatagcaaatgcgtc180
ttacttcccttcctttatcgcaatgactaatacgatgacaacacccaccaccgatacatc240
atgcgtcacacacaggccactttggtgcagagtagggtgccgcaagtaacgccttctatc300
agtgtaaaaaagcagactagattagaattactgtcatcatactgagagaaaaaattacgg360
agagcaatcataacagagagaagggcgggggagggaggaatgatctttgtaactagctct420
ttaaactcgtcagtcatctttcttctctcaacacactaatctaatcccaatacttaaaat480
cttccccaaataagcttgcctaactcttcactaacaaaccttcctctcaactttcatcct540
gattataacacatacttcctttgatcgcggatattacacaacgccaataaccaaacatat600
aaggtcaagcagtcacctaacaggacatcacctcatggctaacttcaagctaattatacg660
acttaagtactgaacactagcttagcatataccttgcgctgattagatgtaatataaaga720
ccagtgtggtatatgaaaaataggcttcgggagttcggcttacctattattccccatcac780
gtctcggaatctgccacgactcaacctctcaccagcttcactgatcactcactcgtctct840
gaccataaaggagactctttgaagtgatcctgctttgccccttgcctaccctggctagta900
ttgctccctctgccccactagattatcgtgataaaagttaaagtgtgtgtggatgtaatc960
aaggtgtgatataatgttttgaggctttatactcttttgaggctttatactcaaaactcg1020
atagaact1028
<210>2
<211>23
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
tcgtcagtcatctttcttctctc23
<210>3
<211>19
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
tgtttggttattggcgttg19
1.一种三疣梭子蟹耐盐碱的分子标记c325，其特征在于，所述分子标记c325的核苷酸序列如seqidno.1所示。
2.根据权利要求1所述的三疣梭子蟹耐盐碱的分子标记c325，其特征在于，所述分子标记c325为indel标记。
3.根据权利要求1或2所述的三疣梭子蟹耐盐碱的分子标记c325，其特征在于，所述分子标记c325的盐碱耐受基因型为缺失纯合基因型。
4.用于检测权利要求1所述的分子标记c325的引物对，其特征在于，所述引物中的正向引物的核苷酸序列如seqidno.2所示，反向引物的核苷酸序列如seqidno.3所示。
5.权利要求1所述的分子标记c325在筛选三疣梭子蟹耐盐碱性状品种中的应用。
6.根据权利要求5所述的分子标记c325在筛选三疣梭子蟹耐盐碱性状品种中的应用，其特征在于：所述应用步骤为：提取三疣梭子蟹待测试样品的dna并将其作为模板，使用分子标记c325的扩增引物进行pcr扩增，并将pcr产物进行测序，如果测序结果中分子标记的基因型为缺失纯合基因型，则待测试样品选择作为培育三疣梭子蟹耐盐碱品种的亲本。
7.根据权利要求6所述的分子标记c325在筛选三疣梭子蟹耐盐碱性状品种中的应用，其特征在于：所述pcr扩增体系为：模板1μl，正向引物（10μm）0.2μl，反向引物（10μm）0.2μl，buffer缓冲液1μl，dntps0.8μl，hifi0.2μl，ddh2o6.6μl。
8.根据权利要求6所述的分子标记c325在筛选三疣梭子蟹耐盐碱性状品种中的应用，其特征在于：所述pcr扩增程序为：预变性94℃2-5min；变性94℃30s，退火55℃30s，延伸72℃1-2kb/min，共重复35个循环；最后延伸72℃5-10min。
9.权利要求1所述的分子标记c325在三疣梭子蟹遗传多样性分析、种质鉴定和遗传图谱构建中的应用。
技术总结