本发明涉及猪分子标记制备技术领域，具体的说是涉及一种影响加系大白猪平均日增重的核苷酸多态性位点snp分子标记及其应用，本发明的分子标记可用于加系大白猪平均日增重性状的标记辅助选择。
背景技术：
我国是生猪的养殖和消费大国，以2018年为例，肉类消耗量占我国居民主要食品总消耗量7.36％，其中猪肉在肉类消耗量中占比超过80％。在受到非洲猪瘟的影响后，猪肉供应呈明显不足，与2018年相比，2019年的猪肉产量4255万吨，同比下降了21.26％。因此加快生猪稳产保供，提高出栏量就显得尤为重要。平均日增重作为猪中主要的经济性状，一直是各个养殖企业进行遗传改良的主要目标性状。平均日增重的提高意味着生猪养殖的出栏周期的缩短、猪肉产量的提升以及经济效益的增长，因而开发出一种新型的能提高猪平均日增重的方法就显得迫在眉睫。
根据国内外的研究报道，猪的平均日增重性状属于中等遗传力性状，这也表明该性状的选择改良空间较大，通过合适的选择方法即能够获得较大的遗传进展。传统的选择方法仅依靠表型进行选择而未能充分利用遗传的作用，造成了选择准确性的降低，因此利用分子标记进行辅助选择的方法就应运而生。早期的分子标记辅助选择虽然在对性状的遗传改良方面起到了积极作用，但是受限于标记的数量，因此很难找到真正的致因基因。而随着测序技术的飞速发展及基因组注释越来越丰富，使得利用全基因组范围内的海量标记来寻找真正的致因基因成为了可能。自2005年公开报道的第一篇gwas研究以来，gwas已经广泛应用在畜禽遗传育种领域，并且通过该技术找到了许多控制重要经济性状的重要snps。通过gwas分析，becker等在2号和14号染色体上发现与ph和胴体长相关的数量性状基因座；verardo等发现了与乳头数相关的19个显著的snps。目前，关于猪平均日增重性状的研究仍处在探索阶段，且由于其具有较大的经济价值，因此对其开展gwas研究是非常必要且有意义的。
技术实现要素：
本发明为了克服现有技术中存在的不足，提供了一种影响加系大白猪平均日增重的分子标记及筛选方法和应用。
本发明的目的在于完善加系大白猪平均日增重性状相关的育种分子标记，利用50k的基因芯片对snp进行分型，并使用gwas筛选与加系大白猪平均日增重相关的snp（asga0005017），为猪的遗传育种提供了新的分子标记资源和标记辅助选择应用基础。
本发明是通过以下技术方案实现的：本发明公开了一种影响加系大白猪平均日增重的分子标记，该分子标记的核苷酸序列如下所示：
tttccctactggattctgagcgatgatcacaggggaattgagtgcctttccttgaatctttcagggaactgtaagtcttaaaggaagaccgtttatctggr(a/g)aggcactggatgtccaggaatcttgtagctcacagacctgcaaggttgtccttacctaaggattttcatactaagtaaggggatcctaaggcattgaggg；
上述核苷酸序列中的第101位碱基处的r是a或g，当上述序列的第101位核苷酸为g时，则加系大白猪具有更高的平均日增重。
本发明还公开了一种筛选加系大白猪平均日增重性状相关snp分子标记的方法，筛选该分子标记的方法具体包括如下步骤：（1）提取加系大白猪组织样总dna；（2）对dna进行浓度测定及质量鉴定；（3）利用基因芯片技术进行基因分型；（4）利用gwas技术，获得加系大白猪平均日增重相关的snp。
步骤（4）中，加系大白猪平均日增重性状需要利用传统的最佳线性无偏估计方法，采用群体均值作固定效应，个体效应和批次效应作随机效应，结测日龄作为协变量，计算个体估计育种值，作为构建新表型用于后续gwas分析。
基于多标记关联模型的方法，采用结测日龄作为协变量，利用r统计环境下mvp软件包中的mlm模型进行gwas分析；对mlm模型筛选出来的显著snp位点与加系大白猪平均日增重进行关联分析。
本发明还公开了一种影响加系大白猪平均日增重的分子标记的应用，该分子标记用于加系大白猪平均日增重性状的标记辅助选择。
申请人通过基因分型技术并参阅ensembl，得到asga0005017上下游100bp的核苷酸序列，其序列具体如下所述：
tttccctactggattctgagcgatgatcacaggggaattgagtgcctttccttgaatctttcagggaactgtaagtcttaaaggaagaccgtttatctggr(a/g)aggcactggatgtccaggaatcttgtagctcacagacctgcaaggttgtccttacctaaggattttcatactaagtaaggggatcctaaggcattgaggg。
上述序列的第101碱基处的r为一个等位基因突变，该突变使上述序列产生了核苷酸多态性。该分子标记可以作为检测与加系大白猪平均日增重性状相关的分子标记，且当上述序列中的第101位核苷酸为g时，则加系大白猪具有更高的平均日增重。上述序列可以作为检测与加系大白猪平均日增重性状相关的分子标记。
基因序列表seqidno:1是本发明筛选的与加系大白猪平均日增重相关的分子标记的核苷酸序列，长度为201bp，在该序列的第101bp处存在一个等位基因突变(a/g)，该突变导致seqidno:1所示的序列产生多态性。本发明中的序列信息和全基因组关联分析结果，基于猪基因组10.2版本。
本发明的有益效果是：本发明筛选的分子标记可用于非诊断目的对加系大白猪相关基因或基因型与加系大白猪平均日增重的关联分析中，提供了一个新的分子标记，该分子标记用于加系大白猪平均日增重性状的分子标记辅助选择。本发明可通过在体外采用基因芯片技术检测加系大白猪的基因型，作为非诊断目的的评价加系大白猪的平均日增重，与目前现有技术中的pcr-rflp等方法相比，本发明中的分子标记具有简单、快捷、灵敏度高和特异性好等突出优点。
本发明分子标记克隆自登陆号为asga0005017，通过基因芯片技术对该基因进行分型筛选得到一种与加系大白猪平均日增重相关的分子标记，该标记的核苷酸序列如说明书附图2所示，在该序列的第101位的碱基处存在一个a/g的等位基因突变，且当上述序列的第101位核苷酸为g时，则加系大白猪具有更高的平均日增重。本发明还公开了一种筛选与加系大白猪平均日增重性状相关的分子标记方法及其关联分析方法的应用，本发明加系大白猪平均日增重性状的标记辅助选择提供了一个新的snp分子标记。本发明使用mvp软件包中的混合线性模型进行gwas分析，筛选出与平均日增重显著相关的snp位点，为加系大白猪平均日增重性状dna标记的辅助选择和全基因组选择的开展提供了新的遗传基础。
附图说明
图1是本发明的总体技术流程示意图。
图2是本发明克隆的asga0005017上下游100bp核苷酸序列和本发明分子标记的核苷酸序列。
图2中显示的核苷酸序列长度为201bp，在该序列的第101位碱基处存在一个a/g等位基因突变，101bp处的英文字母r为突变位点。
图3是本发明的曼哈顿图，该图研究的是加系大白猪平均日增重性状，黑色圆圈及箭头指向标记的为本发明筛选的分子标记，该标记位于加系大白猪的第1号染色体上。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施方式对本发明作详细描述。
本发明公开了一种影响加系大白猪平均日增重的分子标记，该分子标记的核苷酸序列如下所示：
tttccctactggattctgagcgatgatcacaggggaattgagtgcctttccttgaatctttcagggaactgtaagtcttaaaggaagaccgtttatctggr(a/g)aggcactggatgtccaggaatcttgtagctcacagacctgcaaggttgtccttacctaaggattttcatactaagtaaggggatcctaaggcattgaggg；
上述核苷酸序列中的第101位碱基处的r是a或g，当上述序列的第101位核苷酸为g时，则加系大白猪具有更高的平均日增重。
如图1所示，本发明还公开了一种筛选加系大白猪平均日增重性状相关snp分子标记的方法，筛选该分子标记的方法具体包括如下步骤：（1）提取加系大白猪组织样总dna；（2）对dna进行浓度测定及质量鉴定；（3）利用基因芯片技术进行基因分型；（4）利用gwas技术，获得加系大白猪平均日增重相关的snp。
步骤（4）中，加系大白猪平均日增重性状需要利用传统的最佳线性无偏估计方法，采用群体均值作固定效应，个体效应和批次效应作随机效应，结测日龄作为协变量，计算个体估计育种值，作为构建新表型用于后续gwas分析。
基于多标记关联模型的方法，采用结测日龄作为协变量，利用r统计环境下mvp软件包中的mlm模型进行gwas分析；对mlm模型筛选出来的显著snp位点与加系大白猪平均日增重进行关联分析。
本发明还公开了一种影响加系大白猪平均日增重的分子标记的应用，该分子标记用于加系大白猪平均日增重性状的标记辅助选择。
实施例1：基因分型检测。
（1）利用磁珠法基因组提取试剂盒自动提取加系大白猪组织样总dna。
1、取适量组织样至1.5ml离心管中；
2、向离心管中加入500μl裂解液和5μl蛋白酶k（20mg/ml），振荡混匀30s后，置于65℃烘箱或金属浴中，裂解30min～60min；
3、裂解完成后，取全部上清转移至深孔板（标记为①号），并向每个样孔中加入350μl异丙醇；
4、将①号深孔板，置于核酸提取仪工位1上，将装有磁珠、洗涤液①、洗涤液②和洗涤液③以及洗脱液的深孔板分别置于工位2～6上，打开仪器电源，待仪器完成自检后，按如下表所示设置仪器参数；
5、运行程序，程序结束后，仪器会自动停止，并且工位6会进入4℃保存程序，暂时保存样品；
6、dna样品可以直接用于下游实验，或封装后4℃短暂保存数日，若要长时间保存，可以封装或转移至新的容器中，置于-20℃冰箱中长期保存。
snp基因型的判定及质量控制：使用geneseekporcine50ksnp芯片进行分型，用plinkv1.9对获得的基因型数据进行质量控制，剔除检出率<90％、次等位基因频率（maf）<0.05、偏离哈代温伯格（hwe）<10-7的snp标记和检出率<90％的个体，最终有2269个个体，和35666个snp用于gwas研究。
实施例2：asga0005017分子标记分型方法在加系大白猪平均日增重性状关联分析中的应用。
（1）加系大白猪平均日增重性状表型预处理。
加系大白猪平均日增重性状需要利用混合线性模型mlm，采用群体均值作固定效应，个体效应和批次效应作随机效应，结测日龄作为协变量，计算个体估计育种值作为新构建表型用于后续gwas分析。利用dmu统计环境下dmuai模块进行约束最大似然估计reml和blup分析，数据包含31333个个体。
具体模型如下：yklbm=μ idl agek zb εklbm。
其中：yklbm是第l个个体平均日增重性状原始表型值；μ是群体均值（固定效应）；agek是结测日龄（协变量）；idl是个体加性效应（随机效应）；zb是批次效应（随机效应），假定服从正态分布：id～n（0，aσ2id）,σ2id表示个体效应方差,a表示个体间亲缘关系矩阵；εklbm是模型残差效应，假定服从正态分布：ε～n（0，iσ2ε），iσ2ε表示残差方差，i为相应的单位关联矩阵。将模型估计出的有表型记录个体的估计育种值ebv作为新表型。
（2）加系大白猪平均日增重全基因组关联分析。
用于基因型与平均日增重性状关联分析所用的试验猪群是加系大白猪。基因分型所用的dna由纯种加系大白猪组织样中提取。基于多标记关联模型的方法，利用r统计环境下mvp软件包中的mlm模型进行gwas分析。
具体的模型如下：yijk=mi sj εijk。
其中：yijk是根据混合线性模型计算出的有基因型个体的的估计育种值；mi是i个pseudoqtns的基因型效应；sj是第j个标记效应；εijk是残差效应，假定服从正态分布：ε～n（0，iσ2ε），σ2ε表示残差方差，i为单位关联矩阵。
（3）asga0005017分子标记分型结果与平均日增重关联分析。
使用混合线性模型mlm进行asga0014571分子标记与猪平均日增重的关联分析。
具体模型如下：yiklbm=μ idl gi agek zb εiklbm。
其中：yiklbm是第m个个体平均日增重性状原始表型值；μ是群体均值；gi是基因型效应；agek是结测日龄（协变量）；idl是个体加性效应（随机效应）；zb是批次效应（随机效应），假定服从正态分布：id～n（0，aσ2id），σ2id表示个体效应方差，a表示个体间亲缘关系矩阵；εiklbm是模型残差效应，服从正态分布：ε～n（0，iσ2ε），σ2ε表示残差方差，i为相应的单位关联矩阵。
使用f检验对平均日增重性状在三种基因型个体间的差异进行显著性分析，分析结果如下表所示。
asga0005017的多态性以及不同基因型对加系大白平均日增重的影响
其中，p<0.05为差异显著，p<0.01为差异极显著。由上表可知，对于加系大白猪平均日增重性状，基因型为gg的个体平均日增重显著高于ag个体，基因型为gg的个体平均日增重显著高于aa个体，基因型为ag的个体平均日增重显著高于aa个体。综上所述，g是有利于平均日增重增加的等位基因。
最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。
序列表
<110>赤峰家育种猪生态科技集团有限公司
华中农业大学
<120>影响加系大白猪平均日增重的分子标记及筛选方法和应用
<160>1
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>201
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
tttccctactggattctgaccgatgatcacaggggaattgagtgcctttccttgaatctt60
tcagggaactgtaagtcttaaaggaagaccgtttatctggraggcactggatgtccagga120
atcttgtaggtcacagacctgcaaggttgtccttacctaaggattttcatactaagtaac180
gggatcctaaggcattgaggg201
1.一种影响加系大白猪平均日增重的分子标记，其特征在于：该分子标记的核苷酸序列如下所示：
tttccctactggattctgagcgatgatcacaggggaattgagtgcctttccttgaatctttcagggaactgtaagtcttaaaggaagaccgtttatctggr(a/g)aggcactggatgtccaggaatcttgtagctcacagacctgcaaggttgtccttacctaaggattttcatactaagtaaggggatcctaaggcattgaggg；
上述核苷酸序列中的第101位碱基处的r是a或g，当上述序列的第101位核苷酸为g时，则加系大白猪具有更高的平均日增重。
2.一种筛选权利要求1所述的影响加系大白猪平均日增重的分子标记的方法，其特征在于：所述筛选分子标记的方法具体包括如下步骤：
（1）提取加系大白猪组织样总dna；
（2）对dna进行浓度测定及质量鉴定；
（3）利用基因芯片技术进行基因分型；
（4）利用gwas技术，获得加系大白猪平均日增重相关的snp。
3.根据权利要求2所述的筛选影响加系大白猪平均日增重的分子标记的方法，其特征在于：步骤（4）中，加系大白猪平均日增重性状需要利用传统的最佳线性无偏估计方法，采用群体均值作固定效应，个体效应和批次效应作随机效应，结测日龄作为协变量，计算个体估计育种值，作为构建新表型用于后续gwas分析。
4.根据权利要求3所述的筛选影响加系大白猪平均日增重的分子标记的方法，其特征在于：基于多标记关联模型的方法，采用结测日龄作为协变量，利用r统计环境下mvp软件包中的mlm模型进行gwas分析。
5.根据权利要求4所述的筛选影响加系大白猪平均日增重的分子标记的方法，其特征在于：对mlm模型筛选出来的显著snp位点与加系大白猪平均日增重进行关联分析。
6.一种权利要求1所述的影响加系大白猪平均日增重的分子标记的应用，其特征在于：所述分子标记用于加系大白猪平均日增重性状的标记辅助选择。
技术总结