本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种区别自身免疫性肝炎和健康人群的肠道微生物标志物及其应用。
背景技术：
自身免疫性肝炎(autoimmunehepatitis，aih)是由免疫系统介导的一种慢性、非特异性的肝脏炎症。流行病学统计显示，中国自免肝发病率高达20/100000，北欧白人年平均发病率为1.07～1.9/100000。其病因与多种遗传和环境因素有关，但尚未完全阐明。长期未经治疗的自身免疫性肝炎会增加肝硬化和/或肝细胞癌(hcc)的风险，且肝硬化失代偿期常见的顽固性腹水、上消化道出血等多种并发症的死亡率很高，对我国人民健康构成严重威胁，因此快速、及时的诊断自身免疫性肝炎是非常重要的。尽管自身免疫性肝炎的诊断标准已经基本确定且得到验证，但仍然有一部分非典型自身免疫性肝炎难以达到明确诊断，包括自身抗体变异所致的自身抗体阴性的aih、药物诱导的aih、重叠综合征(os)以及移植后aih。此外，自身免疫性肝炎诊断的金标准是肝组织活检，这种有创的诊断方法目前尚未被广大患者及其家属完全接受。因此，建立区别自身免疫性肝炎和健康人群的无创诊断模型，实现自身免疫性肝炎的早期、无创诊断，对于自身免疫性肝炎的早期发现、早期诊断和早期治疗具有重大意义。
人体肠道微生态系统与健康和疾病密切相关。人体肠道内定植着数目庞大(1014)、结构复杂(超过1000种细菌)的微生物群落(约1.5公斤)。其细胞总量几乎是人体自身细胞数量的10倍，基因总量是人类自身基因的150倍。肠道菌群和宿主共生并共进化过程中，在调节宿主的消化吸收、免疫反应、代谢等方面发挥重要作用。肠道微生态失调促进慢性疾病的发生发展，包括肝硬化、肝细胞肝癌、胰腺癌和结直肠癌等。
肠道微生物中关健功能菌可成为人类疾病的新型生物标志物。肠道微生态的特征或者基于肠道微生物建立的区别模型作为特定疾病或肿瘤的区分工具正越来越多被广泛报道和认可。肠道菌群的“肠型(enterotypes)”可反映人对疾病的易感性，提示肠道菌群具有潜在的预警和诊断作用。qinj等率先使用宏基因组学报道了肠道微生态与2型糖尿病的相关性，指出23个菌种可能成为区分2型糖尿病的肠道微生物标志物。qinn,lia等(2014年nature杂志)通过宏基因组测序技术解析了中国人群肝硬化患者肠道微生态结构，在微生物基因和功能水平上，鉴定了肝硬化特异性的15个标记物，创建了一个高准确度的肝硬化患者区分指数。renz等指出，肠道微生态对肝移植急性排斥反应更为敏感，肠道微生态变化可用来预测肝移植后早期急性排斥反应，也可成为肝移植后改善急性排斥损伤的辅助性靶标。wangz等(nature,2011)指出依赖于肠道微生态的卵磷脂代谢促进了心血管疾病的进展，这一发现为心血管疾病新型的诊断方法和治疗策略提供了理论基础。ohpl等(ajt,2012)发现肠道微生态的变化与小肠移植排斥紧密相关，可成为一个潜在的移植排斥的诊断标记物。更重要的是，2019年，renz等首次建立了由30种微生物标志物组成的针对原发性肝癌的无创诊断模型，并实现了跨区域验证。yuj等在不同民族患者中揭示并验证了结直肠癌的微生物标志物，指出微生物标志物作为一种可支付的、无创的结直肠癌的早期诊断标志物。因而，肠道微生物可能是不同疾病诊断的有力工具。然而，用于区别自身免疫性肝炎和健康人群的肠道微生物模型还未曾报道过。
技术实现要素：
本发明提供了一种用于区别自身免疫性肝炎和健康人群的肠道微生物标志物，由seqidno:1-5中至少一种基因所示的微生物组成，所述微生物基因在人体肠道中明显富集或减少。
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另外本发明还提供了一种用于检测试剂，包括用于检测seqidno:1-5所示的5种微生物基因的引物。
优选的，所述引物序列为seqidno:6-7，引物序列如下：
引物primers
测序区域v3 v4：338f-806r
上游引物：338factcctacgggaggcagca
下游引物：806rggactachvgggtwtctaat
本发明还提供了检测试剂在制备自身免疫性肝炎和健康人群的区分检测试剂盒中的应用，及检测试剂在建立一种区别自身免疫性肝炎和健康人群的肠道微生物模型中的应用，所述检测试剂适用于检测seqidno:1-5所示的5种微生物基因的一种或多种。
所述微生物区别模型适用于区别自身免疫性肝炎患者和健康人群。
对所述对象的粪便进行检测，以便确定该样本是否包含所述的微生物基因，是否可以建立区别自身免疫性肝炎和健康人群的微生物基因模型。
通过收集入组对象的粪便样本，抽提微生物总dna，完成微生物dna的16srdnamiseq测序，检测是否存在seqidno:1-5基因的5种微生物基因。
进一步的，通过收集入组对象的粪便样本，抽提微生物总dna，进行肠道菌群的16srdnamiseq测序。基于高通量测序数据，建立自身免疫性肝炎和健康人群的微生物区别模型，建立自身免疫性肝炎患病率(probabilityofdisease，pod)指数；pod指数可用于计算其区别能力，进行验证。
具体包括：
(1)收集入组对象(自身免疫性肝炎患者和健康人群)的粪便样本，按照dna的标准抽提方法完成粪便样本中微生物总dna的抽提，在illuminamiseq平台完成肠道菌群的16srdna高通量测序工作；
(2)基于高通量测序数据，在微生物区别模型的队列中，在37例自身免疫性肝炎和78例健康人之间，基于一个随机森林模型，通过一个十倍交叉验证的算法，鉴定了用于该模型的最佳的5个微生物基因标志物。
(3)基于5个微生物基因标志物，通过使用随机生成的决策树的比率来计算自身免疫性肝炎的患病率(probabilityofdisease,pod)指数。
(4)该微生物区别模型在37例自身免疫性肝炎和78例健康人之间的区别能力达到83.25％，pod指数在自身免疫性肝炎患者中明显升高，两组之间有显著性差异(p＜0.001)。
因此，本发明的微生物基因区别模型在自身免疫性肝炎和健康人群中实现了良好的区别能力。
另外，还提供了一种用于区别自身免疫性肝炎和健康人群的肠道微生物模型的试剂盒，包括用于检测权利要求1所述的seqidno:1-5所示的5种微生物基因的引物。
还提供了一种用于区别自身免疫性肝炎和健康人群的肠道微生物模型，所述模型基于高通量测序数据在队列中建立，所述模型建立有自身免疫性肝炎患病率(probabilityofdisease，pod)指数；pod指数可用于计算其区别能力，进行验证。
本发明的具体操作步骤如下：
(1)按照前瞻性临床试验的设计原则，本发明的研究设计如图1所示。该研究方案得到了郑州大学第一附属医院伦理委员会的批准。所有入组的患者签署研究方案知情同意书和临床样本收集知情同意书。
(2)每一个入组的自身免疫性肝炎患者和健康人提供一份新鲜的粪便样本，研究实验人员将样本按照每份200mg的重量分装成10份，并立即冻存于-80℃冰箱。粪便细菌总dna的抽提方法按照试剂盒的说明书进行。
(3)完成粪便细菌总dna样本的扩增和dna文库构建，在illuminamiseq测序平台完成16srdna测序。所有的输出序列完成基本的预处理和基本的生物信息学分析。
(4)从所有样本中随机抽选等量的序列数，按照uparse传递途径拼接成对应的16srdna基因序列分类单元(operationaltaxonomyunits,otus)，将产生的所有样本的otus基因序列收集整理。基于微生物基因序列，使用rdp分类器2.6版本注释。
(5)基于高通量测序数据产生的代表性序列，计算出微生物基因标志物的otus频率文件。这些otus用于一个相关性研究来鉴定在自身免疫性肝炎患者和健康人群之间的otus丰度。使用wilcoxon检验方法统计分析自身免疫性肝炎患者和健康人群之间差异的微生物基因标志物。
(6)在微生物区别模型的训练集中，包括37例自身免疫性肝炎患者和78例健康人，使用筛选出的otus丰度文件，在一个随机森林模型(r软件3.4.1和随机森林软件包4.6–12)中采用十倍交叉验证的算法(除了设置“importance＝true”之外，软件参数默认)进行微生物基因标志物的筛选。采用十倍交叉验证的10次试验，获得了交叉验证错误曲线，其中最小的交叉验证错误点作为cut-off值使用。最小的交叉验证错误值加上对应值的标准差为cut-off值。筛选出小于cut-off值的错误率的5个以下的otus标志物的集合，选择最小数目otus的集合作为最佳的微生物基因标志物的集合，最终鉴定了用于该模型的最佳的5个微生物基因标志物(图2)。选择出的5个微生物otus标志物的基因序列见seqidno:1-5。
(7)通过使用随机生成的决策树的比率来计算患病率(probabilityofdisease,pod)指数。决策树预测样本为“aih”，设置的参数预测为：proximity＝t,norm.votes＝t,predict.all＝true。在loo模式中构建的随机森林模型用于预测队列中每一个样本的pod指数，最终计算每一个样本的平均预测的pod指数。
(8)使用r3.3.0程序包中的proc工具计算受试者工作曲线(roc)，用来评估微生物区别模型，曲线下面积(auc)用于指定roc的效应值。
(9)该微生物区别模型在37例自身免疫性肝炎和78例健康人群之间的区别能力达到83.25％(图3)，pod指数在肝癌患者中明显升高，两组之间有显著性差异(p＜0.001)(图4)。
因此，本发明的微生物基因区别模型在自身免疫性肝炎和健康人群中实现了良好的区别能力。
附图说明
图1.一种用于区别自身免疫性肝炎和健康人群的肠道微生物模型的研究设计和应用。
图2.基于随机森林模型采用十倍交叉验证法鉴定的最佳的肠道微生物基因标志物。
图3.在37例自身免疫性肝炎和78例健康人群的队列中，微生物基因区别模型实现的区别效能；
图4.在37例自身免疫性肝炎和78例健康人群的队列中，患病率(pod)指数在两组之间的表达差异；
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的阐述，但本发明的保护内容不仅限于这些实施例。
下列实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。下列实施例中所需要的材料或试剂，如无特殊说明均为公开商业途径获得。
本发明通过收集入组对象的粪便样本，抽提微生物总dna，进行肠道菌群的16srdnamiseq测序。基于高通量测序数据，在训练集中建立自身免疫性肝炎和健康人群的微生物区别模型，建立自身免疫性肝炎患病率(probabilityofdisease，pod)指数；pod指数可用于计算其区别能力，进行验证。
其操作步骤如下：
(1)按照前瞻性临床试验的设计原则，本发明的研究设计如图1所示。该研究方案得到了郑州大学第一附属医院伦理委员会的批准。所有入组的患者签署研究方案知情同意书和临床样本收集知情同意书。
(2)每一个入组的自身免疫性肝炎患者和健康人提供一份新鲜的粪便样本，研究实验人员将样本按照每份200mg的重量分装成10份，并立即冻存于-80℃冰箱。粪便细菌总dna的抽提方法按照试剂盒的说明书进行。
(3)完成粪便细菌总dna样本的扩增和dna文库构建，在illuminamiseq测序平台完成16srdna测序。所有的输出序列完成基本的预处理和基本的生物信息学分析。
(4)从所有样本中随机抽选等量的序列数，按照uparse传递途径拼接成对应的16srdna基因序列分类单元(operationaltaxonomyunits,otus)，将产生的所有样本的otus基因序列收集整理。基于微生物基因序列，使用rdp分类器2.6版本注释。
(5)基于高通量测序数据产生的代表性序列，计算出微生物基因标志物的otus频率文件。根据分组情况，鉴定自身免疫性肝炎患者和健康人群的otus丰度。使用wilcoxon检验方法统计分析自身免疫性肝炎患者和健康人群之间差异的微生物基因标志物。
(6)在微生物区别模型的队列中，包括37例自身免疫性肝炎患者和78例健康人，使用筛选出的otus丰度文件，在一个随机森林模型(r软件3.4.1和随机森林软件包4.6–12)中采用十倍交叉验证的算法(除了设置“importance＝true”之外，软件参数默认)进行微生物基因标志物的筛选。采用十倍交叉验证的10次试验，获得了交叉验证错误曲线，其中最小的交叉验证错误点作为cut-off值使用。最小的交叉验证错误值加上对应值的标准差为cut-off值。筛选出小于cut-off值的错误率的5个以下的otus标志物的集合，选择最小数目otus的集合作为最佳的微生物基因标志物的集合，最终鉴定了用于该模型的最佳的5个微生物基因标志物(图2)。选择出的5个微生物otus标志物的基因序列见seqidno:1-5。
(7)通过使用随机生成的决策树的比率来计算患病率(probabilityofdisease,pod)指数。决策树预测样本为“aih”，设置的参数预测为：proximity＝t,norm.votes＝t,predict.all＝true。在loo模式中构建的随机森林模型用于预测每一个样本的pod指数，最终计算每一个样本的平均预测的pod指数。
(8)使用r3.3.0程序包中的proc工具计算受试者工作曲线(roc)，用来评估微生物区别模型，曲线下面积(auc)用于指定roc的效应值。
(9)该微生物区别模型在37例自身免疫性肝炎和78例健康人群之间的区别能力达到83.25％(图3)，pod指数在自身免疫性肝炎患者中明显升高，两组之间有显著性差异(p＜0.001)(图4)。
因此，本发明的微生物基因区别模型在自身免疫性肝炎和健康人群中实现了良好的区别能力。
序列表
<110>郑州大学第一附属医院
<120>用于区别自身免疫性肝炎和健康人群的肠道微生物标志物及其应用
<130>20-212069-00015465
<160>7
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>440
<212>dna
<213>肠道微生物(microorganism)
<400>1
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<211>19
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<213>人工序列(artificialsequence)
<400>6
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<210>7
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>7
ggactachvgggtwtctaat20
1.一种用于区别自身免疫性肝炎和健康人群的肠道微生物基因标志物，其特征在于：包括seqidno:1-5中至少一种基因所示的微生物，所述微生物在肠道中明显富集或减少。
2.一种用于检测权利要求1所述肠道微生物基因标志物的检测试剂，包括用于检测权利要求1所述的seqidno:1-5中至少一种基因的引物。
3.根据权利要求2所述的检测试剂，其特征在于：所述引物序列为seqidno:6-7。
4.权利要求2所述检测试剂在制备自身免疫性肝炎和健康人群的区分检测试剂盒中的应用，所述检测试剂适用于检测权利要求1所述的肠道微生物的基因。
5.权利要求2所述检测试剂在建立一种区别自身免疫性肝炎和健康人群的肠道微生物模型中的应用，所述检测试剂适用于检测权利要求1所述的肠道微生物的基因。
6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于：对所述对象的粪便进行检测，以便确定该样本是否包含所述的微生物基因，是否可以建立区别自身免疫性肝炎和健康人群的微生物基因模型。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：通过收集入组对象的粪便样本，抽提微生物总dna，进行肠道菌群的16srdnamiseq测序；基于高通量测序数据，在队列中建立自身免疫性肝炎和健康人群患者的微生物区别模型，建立自身免疫性肝炎患病率(probabilityofdisease，pod)指数；pod指数可用于计算其区别能力，进行验证。
8.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于，具体包括：
(1)收集入组对象的粪便样本，入组对象包括37例自身免疫性肝炎患者和78例健康人，按照dna的标准抽提方法完成粪便样本中微生物总dna的抽提，在illuminamiseq平台完成肠道菌群的16srdna高通量测序工作；
(2)基于高通量测序数据，在微生物区别模型的队列中，在37例自身免疫性肝炎和78例健康人之间，基于一个随机森林模型，通过一个十倍交叉验证的算法，鉴定了用于该模型的最佳的5个微生物基因标志物；
(3)基于5个微生物基因标志物，通过使用随机生成的决策树的比率来计算自身免疫性肝炎患病率(probabilityofdisease,pod)指数；
(4)该微生物区别模型在37例自身免疫性肝炎和78例健康人之间的区别能力达到83.25％，pod指数在自身免疫性肝炎患者中明显升高，两组之间有显著性差异(p＜0.001)。
9.一种用于区别自身免疫性肝炎和健康人群的试剂盒，包括用于检测权利要求1所述的seqidno:1-5所示的5种微生物基因的引物。
10.一种用于区别自身免疫性肝炎和健康人群的肠道微生物模型，所述模型基于高通量测序数据在队列中建立，所述模型建立有自身免疫性肝炎患病率(probabilityofdisease，pod)指数；pod指数可用于计算其区别能力，进行验证。
技术总结