本申请涉及生物检测及微生物技术领域，尤其涉及一种定量检测苍白杆菌的聚合酶链式反应引物、试剂盒和定量检测苍白杆菌的方法。
背景技术：
苍白杆菌是一种具平行边和圆端的杆菌，通常单个出现；细胞染色为革兰氏阴性；通过周生鞭毛运动；是一类专性好氧，严格呼吸代谢，以氧为末端电子受体，能利用各种氨基酸、有机酸和碳水化合物为碳源的菌群；最适生长温度为20～37℃；在营养琼脂上的菌落无色；在低温环境下，生长过程中可产生多种纤维素酶，用于分解玉米秸秆等农作物，从而改善土壤理化性质，提高土壤肥力。苍白杆菌发酵液的乳化指数较高，具有较强的乳化作用，代谢降解饱和烃和芳香烃，降低原油中的饱和烃以及轻质组分，改善原油物性，有效降解石油烃；并为其进一步应用于现场驱油试验以及石油污染土壤等修复领域提供可能。已经有大量研究资料表明苍白杆菌还能够降解一批范围广泛的工农业常见有机污染物或残留物，例如甲苯、对二甲苯、1,2-二氯苯，苯胺，正己烷，十二烷基苯磺酸钠，草甘膦，芘类物质，多环芳烃，某些芳香族化合物(如酚类，苯环化合物)精喹禾灵，多菌灵，强力霉素，萘，菲，阿维菌素，吡虫啉杀虫剂，甲基对硫磷，百菌清，氯嘧磺隆,氟氯氰菊酯,扑草净,硫化氢,硫丹,二苯并噻吩,串珠镰刀菌素等。因此，苍白杆菌的研究对于人类生产生活环境尤其是环境治理具有重要意义。
但是关于苍白杆菌的特异性检测技术尤其是在分子水平上的检测技术鲜有报道。苍白杆菌的基因组测序进展也不大，目前在欧洲基因组网站数据库(ebigenome)中只看到苍白杆菌(ochrobactrumanthropi)的两个染色体基因组序列(ochrobactrumanthropiatcc49188chromosome1，2,887,297碱基，编号cp000758；ochrobactrumanthropiatcc49188chromosome2，1,895,911碱基，编号cp000759)。鉴于苍白杆菌能够降解或参与范围降解如此广泛的各种杀虫剂、农残及工业污废产物，加快研制苍白杆菌的特异性检测技术非常有必要。
目前非常缺乏对苍白杆菌的快速检测方法。目前一般是使用一定的培养基培养样本中的菌属，菌落生长出来以后提取菌落基因组dna进行核糖体rna基因的扩增和测序，继而判断是否属于苍白杆菌。但是基于核糖体rna基因的判断方法有时会出现差错，原因是有些菌种的分类差异很大但是却有高度相似的核糖体rna基因片段；也有使用biolog方法来进行苍白杆菌的检测，但是速度较慢，对应的成本也比较高(jenvironsci(china).2009；21(10):1446-51.isolationofmarinebenzo[a]pyrene-degradingochrobactrumsp.bap5andproteinscharacterization)。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种定量检测苍白杆菌的聚合酶链式反应引物对，能够实现对苍白杆菌的特异性检测。
本发明提供了一种定量检测苍白杆菌的聚合酶链式反应引物对，包括上游引物和下游引物，所述上游引物具有如oa3f所示核苷酸序列，所述下游引物具有如oa3r所示核苷酸序列：
oa3f:5'-caacgggaaccagtcgaagaacgagccgcc-3'
oa3r:5'-tcaaggaaaagatgccggtttcaatctcgc-3'。
对于上述技术方案所述引物对，本领域技术人员可根据上述核苷酸序列进行人工合成，在本发明的实施例中，具体由上海生工生物有限公司合成。在本发明中，上述技术方案所述聚合酶链式反应引物对有针对苍白杆菌的特异性识别。本发明还提供了上述技术方案所述引物对在检测苍白杆菌中的应用，具体的包括定性检测和定量检测。
对于定性检测，本发明提供了一种pcr试剂盒，包括：npk02buffer(2×)、特异性引物、taq酶和ddh2o；所述特异性引物为上述技术方案所述定量检测苍白杆菌的聚合酶链式反应引物对。
具体的，在所述pcr试剂盒中，所述特异性引物中上下游引物的终浓度各自为1～3μm。在本发明的实施例中，所述特异性引物中上下游引物的终浓度优选为2μm在本发明中，引物溶液中的溶剂为5mmtris、ph值为7.0的水溶液。
在本发明中，当所述pcr试剂盒用于检测苍白杆菌时，提供了一种pcr反应体系，包括：npk02buffer(2×)6μl，特异性引物各1.5μl，dna模板1μl，taq酶0.3μl，ddh2o3.2μl；所述特异性引物中上下游引物的终浓度为1～3μm。在本发明中，所述dna模板的浓度为10ng/μl。
本发明还提供了一种采用上述技术方案所述反应体系检测苍白杆菌的方法，包括以下步骤：
以提取得到的待测样品的宏基因组dna为模板，将所述反应体系进行pcr扩增，得到pcr扩增产物，所述pcr扩增的反应程序为：94℃3min；94℃30s，60℃30s，72℃1min，37个循环；72℃1.5min；
将所述pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
本发明对所述提取样本dna的方法没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的dna提取试剂盒即可。在本发明中，所述样品可以污水样本，窖泥土壤样本，被污染的土壤样本、医院下水道污泥样本或海洋生物膜样本，对应的试剂盒可以为污泥基因组提取试剂盒或土壤基因组提取试剂盒。在本发明中的实施例中，所述待测样品为窖泥土壤样本或海洋生物膜样本，采用ezup柱式基因组提取试剂盒。
在本发明中，所述海洋生物膜是由微生物群体、非生物物质和有机聚合物基质组成，其中所述微生物群体包括各种寄居者如固着细菌、原生动物、真菌和藻类，所述有机聚合物基质包括细菌胞外聚合物质和腐殖质等。具体的，所述海洋生物膜来自海洋舰艇表面附着的生物膜或海洋水下设施表面附着的生物膜。
在本发明中，用于琼脂糖凝胶电泳检测的pcr扩增产物的体积优选为8～12μl。所述琼脂糖凝胶的质量浓度优选为1％，所述琼脂糖凝胶电泳的电压优选为100v，所述琼脂糖凝胶电泳的时间优选为30～40min。
本发明根据所述琼脂糖凝胶电泳图谱中扩增产物的长度，实现对苍白杆菌的定性检测。
本发明还提供了一种检测苍白杆菌的qpcr试剂盒，包括2×npk62buffer，特异性引物对和taq酶，所述特异性引物为上述技术方案所述引物对。
在本发明中，当所qpcr试剂盒用于检测苍白杆菌时，提供了一种qpcr反应体系，包括2×npk62buffer6μl，特异性引物各1.5μl，dna模板4.25μl，taq酶0.25μl，所述特异性引物中的上下游引物各自终浓度为1～3μm。
在本发明中，所述dna模板的浓度为10ng/μl。
本发明还提供了一种定量检测苍白杆菌的方法，包括以下步骤：
以提取到的待测样品的宏基因组dna为模板，将所述反应体系进行qpcr扩增，所述qpcr扩增的反应程序为：95℃4min；95℃30s，60℃40s，72℃40s，42个循环；72℃2min；
根据预定的标准原液的浓度与所述qpcr扩增的结果，得到待测样品中苍白杆菌的含量。
本发明采用上述技术方案所述基因提取试剂盒提取得到待测样品的宏基因组dan，在此不再赘述。
在本发明中，所述标准原液的获取方法包括以下步骤：
提取待测样品的宏基因组dna，将所述宏基因组dna稀释后分装，得到稀释宏基因组dna样本；
在所述稀释宏基因组dna样本中抽取多个宏基因组dna样本等量混合，得到混合宏基因组dna；
将所述混合宏基因组dna为模板，采用上述技术方案所述qpcr反应体系进行扩增，得到的qpcr扩增产物经纯度和浓度测定后作为标准原液。
在本发明的实施例中，使用分光光度计测定260和280纳米波长下的光吸收值可以测定pcr产物dna分子的浓度。
在本发明中，所述稀释后的浓度范围一般为1.0×10-1～1.0×10-9ng/μl；上述技术方案所述等量混合的各样本体积优选为1～2μl。
在本发明中，所述苍白杆菌的拷贝量的计算公式如式i所示：
式i中c：为标准原液的浓度，l：为qpcr扩增产物长度。
本发明提供了检测苍白杆菌的一对引物，可以快速对任意可能含有苍白杆菌的菌群样本进行测定，对苍白杆菌实现特异性识别。本发明提供的方法将待测样本的宏基因组提取出来并稀释分装以后,各自取出少量稀释的宏基因组样本等量混合后使用一对引物进行扩增，扩增产物经过浓度测定作为qpcr定量标准原液，之后对全部样本进行苍白杆菌的定量测定。采用本发明提供的引物对对苍白杆菌进行检测，能够避免其他具有高度相似核糖体rna基因片段菌种的干扰，实现对苍白杆菌的准确测定。本发明通过扩增靶序列对微生物进行定量时，测定的是靶序列在单位体积中的分子拷贝数，在qpcr的精度范围内可以对样本内苍白杆菌的相对含量进行精确的定量。
而且与biolog方法相比，本发明提供的检测方法成本低，检测速度快。
附图说明
图1为本发明实施例1得到的凝胶用图；m:markerb；a:以海洋生物膜宏基因组dna为模板的扩增产物；b:以窖泥土壤宏基因组dna为模板的扩增产物；
图2为本发明实施例3得到的qpcr扩增曲线；
图3为本发明实施例3得到的熔解曲线；
图4为本发明实施例3得到的qpcr定量计算结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的定量检测苍白杆菌的聚合酶链式反应引物、试剂盒和定量检测苍白杆菌的方法进行详细说明，但不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
在本发明的实施例中，pcr试剂盒npk02(普通pcr试剂盒)和npk62(qpcr试剂盒)购自威海晓东生物技术有限公司；markerb或markerd购自上海生工生物有限公司；特异性引物由上海生工生物有限公司合成；其他生化试剂均购自上海生工。
实施例1:苍白杆菌属微生物特异性引物对的验证
将设计好的引物对oa3f-oa3r进行pcr扩增实验，pcr反应体系(12μl)为：npk02buffer(2×)(威海晓东生物)6μl，物种特异性引物1.5μl(同时包含上下游引物，浓度均为2μm)，模板1μl(窖泥土壤样本和海洋生物膜样本提取的宏基因组dna作为模板dna)，taq酶0.25μl，ddh2o3.25μl。
pcr反应循环参数：94℃3min；94℃30s，60℃30s，72℃1min，37个循环；72℃2min。
琼脂糖凝胶电泳：1％的琼脂糖凝胶，markerb上样4μl，扩增产物12μl 上样缓冲液3μl，缓冲液中加入适量溴乙啶(10％eb)。电压在110v，电流在40ma以上，每隔20min观察一次，约40min停止电泳。
通过凝胶成像仪观察引物的特异性，其电泳结果如图1所示，其中m：markerb；1为采用窖泥土壤样本时的pcr产物；2为采用海洋生物膜样本，图1中显示pcr产物电泳条带基本与预测大小一致，表明所本发明提供的特异性引物具有对苍白杆菌的特异性。
将该序列在ncbi中进行blast验证，输出结果均为目标菌种苍白杆菌(ochrobactrumanthropi)。
使用oa3f-oa3r引物检测窖泥土壤样本和海洋生物膜样本中的苍白杆菌，扩增产物利用0a3r引物进行单向测序，结果如下：
>3(待测样本是窖泥基因组dna混合物)[测序得到的序列含有oa3f位置序列信息]
clustalformatalignmentbymafftfft-ns-i(v7.429)
>4(待测样本是海洋生物膜混合dna)[测序得到的序列含有oa3f位置序列信息]
clustalformatalignmentbymafftfft-ns-i(v7.429)
上述两条序列3-4的正向序列比对结果：
clustalformatalignmentbymafftfft-ns-i(v7.429)
上述比对结果显示，海洋生物膜样本中的苍白杆菌与窖泥土壤样本中的苍白杆菌在扩增靶序列上有一些序列差异，但是都属于苍白杆菌。
实施例2所检测的dna片段在其他苍白杆菌中的特异性
使用oa3f-oa3r引物扩增稻田污泥宏基因组中的苍白杆菌序列,pcr产物使用oa3r单向测序，测序结果再转成反向互补序列(正向序列)，结果如下:
>1
aacgggaacccgtcgaagaacgagccgccggcgaacagcacgatcagcaggatggcgaacaggaagctcggaatggcgtagccgacgatgatgacggcgctggtccaggtgtcgaagcgcgagccgtccttgatcgccttgcggatgccgagcgggatcgagatcaggtaagggacagcaaggtcgaaccaaggcccgaac201碱基
预期序列：
>2
caacgggaaccagtcgaagaacgagccgcccgcaaacagtacgatcagcaggattgcaaacaggaagcttggaatggcgtagccgacgatgatgacggcgctggtccaggtgtcgaagcgcgaaccgtccttgattgccttgcgaatgccgagtggaatcgagatcatgtaggacagaaaagtcagccacaggccgagcgagattgaaaccggcatc217碱基(ochrobactrumanthropistrainoabchromosome1,range:263890to264106)(ochrobactrumanthropiatcc49188chromosome1,range:12790to13006)
本实施例中测序所得序列与预期序列有一定的差异，表明所扩增的样本中可能并不包含ochrobactrumanthropi这个物种，而是包含了苍白杆菌的其他物种，但是到底是哪种苍白杆菌的亚种需要进一步确定。将本实施例中两条序列进行mafft(https://www.ebi.ac.uk/tools/msa/mafft/)比对，结果如下，两条序列的差异略大于10％，表明所扩样本中包含的苍白杆菌可能是其他亚种类。mafft比对结果如下：
clustalformatalignmentbymafftfft-ns-i(v7.429)
实施例3利用oa3f-oa3r引物定量测定稻田土壤样本中苍白杆菌的含量
在本实施例中，复合菌制剂含有乳酸片球菌pediococcusacidilactici、植物乳杆菌(胚芽乳杆菌)lactobacillusplantarum、戊糖乳杆菌lactobacilluspentosus、副干酪乳杆菌lactobacillusparacasei、根癌农杆菌agrobacteriumtumefaciens、沙雷氏菌属serratiasp.jl、发酵乳杆菌lactobacillusfermentum、土壤杆菌rhizobiumlarrymoorei、铁基自养硝化菌microbacteriumtestaceum、黄瓜藤黄单胞菌luteimonascucumeris、苍白杆菌ochrobactrumsp.jl、干酪乳杆菌lactobacilluscasei、旱金莲果糖杆菌fructobacillustropaeoli、醋酸杆菌acetobactersetunensis。
系列稻田土壤样本中苍白杆菌的qpcr测定：采用常规方法提取添加复合菌制剂及未添加复合菌制剂的两种土壤样本。利用ezup柱式基因组提取试剂盒(b518251,上海生工)提取32个样本(包含16个一般稻田土壤样本和16个添加菌制剂的稻田土壤样本。稻田土壤中添加了威海以琳生物制品有限公司生产的复合菌制剂，编号yl0803)中的宏基因组。每个样本200mg，提取的宏基因组dna体积为100μl。从宏基因组dna样本中随机取出10个样本，各取2μl等量混合得到一个混合宏基因组dna，以此为模板使用oa3引物对(oa3f/oa3r)扩增制备qpcr的标准dna，跑胶检测纯度并对扩增产物进行定量作为标准原液。使用oa3f/oa3r引物对对提取的稻田土壤样本进行qpcr测定，使用的仪器是abistepone,测定的结果是每个样本宏基因组dna中苍白杆菌dna片段的拷贝数浓度(copies/μl)。qpcr总反应体系(12μl)为：2×npk62buffer(威海晓东生物)6μl，引物(上下游各自终浓度为2μm)1.5μl，生物膜宏基因组dna模板(浓度为10ng/μl)4.25μl，taq酶0.25μl。qpcr反应条件为：qpcr反应程序是95℃4min；95℃30s，60℃40s，72℃40s，42个循环；72℃2min。
qpcr扩增曲线见图2，熔解曲线见图3。qpcr的熔解曲线是衡量引物特异性的一个重要指标。本实施例的熔解曲线是一个主峰下有很多熔点非常接近的次峰。这是因为扩增出来的是一组大小和熔点都非常接近的dna片段。图3显示了质量尚可的熔解曲线。
qpcr定量计算结果见图4，由图4可以看出，添加复合菌制剂稻田土壤样本中苍白杆菌含量明显高于未添加复合菌制剂的稻田土壤样本。添加复合菌制剂稻田土壤样本中苍白杆菌含量为45315copies/μl；未添加复合菌制剂的稻田土壤样本中苍白杆菌含量为28463copies/μl。
由此可以得出，采用本发明提供的引物对再结合检测方法能够实现对苍白杆菌进行定量检测。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
1.定量检测苍白杆菌的聚合酶链式反应引物对，包括上游引物和下游引物，所述上游引物具有如oa3f所示核苷酸序列，所述下游引物具有如oa3r所示核苷酸序列：
oa3f:5'-caacgggaaccagtcgaagaacgagccgcc-3'
oa3r:5'-tcaaggaaaagatgccggtttcaatctcgc-3'。
2.权利要求1所述聚合酶链式反应引物对在检测苍白杆菌中的应用。
3.检测苍白杆菌的pcr试剂盒，包括：npk02buffer(2×)、特异性引物对、taq酶和ddh2o；所述特异性引物对为权利要求1所述定量检测苍白杆菌的聚合酶链式反应引物对。
4.根据权利要求3所述的pcr试剂盒，其特征在于，所述特异性引物的终浓度为1～3μm。
5.采用权利要求3或4所述pcr试剂盒检测苍白杆菌的反应体系：包括npk02buffer(2×)6μl，特异性引物各1.5μl，dna模板1μl，taq酶0.3μl，ddh2o3.2μl；所述特异性引物的终浓度为1～3μm，所述dna模板的浓度为10ng/μl。
6.采用权利要求5所述反应体系检测苍白杆菌的方法：包括以下步骤：
以提取得到的待测样品的宏基因组dna为模板，将所述反应体系进行pcr扩增，得到pcr扩增产物，所述pcr扩增的反应程序为：94℃3min；94℃30s，60℃30s，72℃1min，37个循环；72℃1.5min；
将所述pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
7.检测苍白杆菌的qpcr试剂盒，包括2×npk62buffer，特异性引物对和taq酶，所述特异性引物为权利要求1所述引物对。
8.根据权利要求7所述的qpcr试剂盒，其特征在于，所述特异性引物中的上下游引物各自终浓度为1～3μm。
9.采用权利要求7或8所述qpcr试剂盒检测苍白杆菌的反应体系，包括2×npk62buffer6μl，特异性引物各1.5μl，dna模板4.25μl，taq酶0.25μl，所述特异性引物中的上下游引物各自终浓度为1～3μm，所述dna模板的浓度为10ng/μl。
10.采用权利要求9所述反应体系定量检测苍白杆菌的方法，包括以下步骤：
以提取到的待测样品的宏基因组dna为模板，将所述反应体系进行qpcr扩增，所述qpcr扩增的反应程序为：95℃4min；95℃30s，60℃40s，72℃40s，42个循环；72℃2min；
根据预定的标准原液的浓度与所述qpcr扩增的结果，得到待测样品中苍白杆菌的含量。
技术总结