本发明涉及食品安全技术领域，尤其是涉及一种用于检测食源性致病菌的引物组、产品、检测方法及应用。
背景技术：
食源性致病菌是能够引起食物中毒等食源性疾病的一类微生物，它们主要通过食物和水传播，在世界范围内广泛流行。食源性致病菌的致病力强，并具有影响范围广、暴发流行等特点，其疾病种类繁多，如：腹泻、痢疾、伤寒、脑膜炎、菌血症，还能导致死亡，严重危害着公众的身体健康。
沙门氏菌是肠杆菌科中重要的常见人畜共患病原菌。该菌以肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌和猪霍乱沙门氏菌最为常见。在世界各地的食物中毒中，沙门氏菌引起的中毒病例占首位或第二位。我国细菌性食物中毒中70％-80％是由沙门氏菌引起的。
肠出血性大肠杆菌o157：h7是一种重要的人畜共患传染病原菌，主要通过污染的水源及食物感染人，从而带来极大的危害，该病原菌于1982年在美国首次被发现以来，在世界各地有多次暴发流行，大肠杆菌o157已成为最重要的食源性致病菌之一。
副溶血弧菌广泛存在于近岸海水、海底沉积物和鱼类、贝类等海洋生物中，是引起食物中毒的主要病原菌之一。
目前，对上述几种食源性致病菌的检测多应用传统生物学方法，如elisa或胶体金试纸等，但上述检测方法耗时较长、成本较高，且步骤繁琐。因此开发一种高效准确，且成本低廉的能够有效检测沙门氏菌、大肠杆菌o157：h7和副溶血弧菌的产品尤为重要。
有鉴于此，特提出本发明。
技术实现要素：
本发明的第一个目的在于提供一种用于检测食源性致病菌的引物组，以至少缓解现有技术中存在的技术问题之一。
本发明的第二个目的在于提供一种用于检测食源性致病菌的产品。
本发明的第三个目的在于提供一种检测食源性致病菌的方法。
本发明的第四个目的在于提供上述引物组、产品或检测方法在检测食品中食源性致病菌的应用。
本发明提供了一种用于检测食源性致病菌的引物组，所述引物组包括用于检测沙门氏菌的引物对、用于检测大肠杆菌o157：h7的引物对和用于检测副溶血弧菌的引物对；
所述用于检测沙门氏菌的引物对包括sa-f和sa-r；
所述sa-f包括如seqidno.1所示的核苷酸序列，或与seqidno.1所示的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列；
所述sa-r包括如seqidno.2所示的核苷酸序列，或与seqidno.2所示的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列；
所述用于检测大肠杆菌o157：h7的引物对包括ec-f和ec-r；
所述ec-f包括如seqidno.4所示的核苷酸序列，或与seqidno.4所示的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列；
所述ec-r包括如seqidno.5所示的核苷酸序列，或与seqidno.5所示的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列；
所述用于检测副溶血弧菌的引物对包括vp-f和vp-r；
所述vp-f包括如seqidno.7所示的核苷酸序列，或与seqidno.7所示的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列；
所述vp-r包括如seqidno.8所示的核苷酸序列，或与seqidno.8所示的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列。
进一步地，所述引物组还包括探针组，所述探针组包括用于检测沙门氏菌的探针、用于检测大肠杆菌o157：h7的探针和用于检测副溶血弧菌的探针。
进一步地，用于检测沙门氏菌的探针sa-probe包括如seqidno.3所示的核苷酸序列，或与seqidno.3所示的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列；
用于检测大肠杆菌o157：h7的探针ec-probe包括如seqidno.6所示的核苷酸序列，或与seqidno.6所示的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列；
用于检测副溶血弧菌的探针vp-probe包括如seqidno.9所示的核苷酸序列，或与seqidno.9所示的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列。
进一步地，用于检测沙门氏菌的探针、用于检测大肠杆菌o157：h7的探针和用于检测副溶血弧菌的探针均独立地含有互不相同的荧光基团；
优选地，所述荧光基团包括fam、hex和rox；
优选地，所述用于检测沙门氏菌的探针含有fam，所述用于检测大肠杆菌o157：h7的探针含有hex，所述用于检测副溶血弧菌的探针含有rox。
本发明还提供了一种用于检测食源性致病菌的产品，包括上述的引物组。
进一步地，所述产品包括试剂或试剂盒；
优选地，所述试剂盒还包括pcr反应试剂；
优选地，所述pcr反应试剂包括10×pcrbuffer、mg2 、dntp、taqdna聚合酶和牛血清白蛋白；
优选地，所述10×pcrbuffer的ph为8.0-8.5，优选为8.3；
优选地，所述mg2 为mgcl2溶液，优选浓度为20-30mm的mgcl2溶液，更优选浓度为25mm的mgcl2溶液；
优选地，所述dntp包括datp、dttp、dgtp和dctp，优选浓度为2-3mm的dntp，更优选浓度为2.5mm的dntp；
所述taqdna聚合酶的浓度为2-8u/μl，优选为5u/μl；
所述牛血清白蛋白的浓度为0.5-1.5mg/ml，优选为1mg/ml；
优选地，所述引物组中各引物对的浓度均独立地为8-12μm，优选为10μm；
优选地，所述探针组中各探针的浓度均独立地为8-12μm，优选为10μm。
本发明还提供了一种检测食源性致病菌的方法，以待测样本的基因组dna为模板，应用上述的引物组或产品进行pcr反应，若扩增产物中含有特异性片段，则待测样本中包含食源性致病菌；或者，根据扩增产物中含有的荧光信号，判断待测样本中包含的食源性致病菌。
进一步地，所述pcr为三重荧光定量pcr，所述三重荧光定量pcr的反应条件为：90-95℃预变性4-6min，90-95℃变性4-6s，58-62℃退火22-28s，反应进行42-48个循环；
优选为95℃预变性5min，95℃变性5s，58-62℃退火25s，反应进行45个循环；
优选地，所述三重荧光定量pcr的反应体系为25μl，包括：10×pcrbuffer2-3μl、3-8mm的mgcl2溶液4-6μl、0.5-1mm的dntp1-3μl、0.05-0.2μl/ml的bsa2-3μl、0.1-0.3nnml的sa-f0.4-0.6μl、0.15-0.2nnml的sa-r0.3-0.5μl、0.05-0.1nnml的sa-probe0.1-0.3μl、0.1-0.3nnml的ec-f0.4-0.6μl、0.1-0.3nnml的ec-r0.4-0.6μl、0.05-0.1nnml的ec-probe0.1-0.3μl、0.1-0.3nnml的vp-f0.4-0.6μl、0.1-0.3nnml的vp-r0.4-0.6μl、0.05-0.1nnml的vp-probe0.1-0.3μl、0.05-0.1u/μl的taqdna聚合酶0.3-0.5μl、模板4-6μl和余量的水；
优选地，所述三重荧光定量pcr的反应体系包括：10×pcrbuffer2.5μl、5mm的mgcl2溶液5μl、0.8mm的dntp2μl、0.1μl/ml的bsa2.5μl、0.2nnml的sa-f0.5μl、0.16nnml的sa-r0.4μl、0.08nnml的sa-probe0.2μl、0.2nnml的ec-f0.5μl、0.2nnml的ec-r0.5μl、0.08nnml的ec-probe0.2μl、0.2nnml的vp-f0.5μl、0.2nnml的vp-r0.5μl、0.08nnml的vp-probe0.2μl、0.08u/μl的taqdna聚合酶0.4μl、模板5μl和水4.1μl。
进一步地，用于检测沙门氏菌的探针含有fam，用于检测大肠杆菌o157：h7的探针含有hex，用于检测副溶血弧菌的探针含有rox；
若待测样本的扩增曲线为s型曲线且fam荧光ct值≤33时，判定为含有沙门氏菌，ct值≥36时，判定为不含沙门氏菌；
若待测样本的扩增曲线为s型曲线且hex荧光ct值≤36时，判定为含有大肠杆菌o157：h7，若不显示ct值，判定为不含大肠杆菌o157：h7；
若待测样本的扩增曲线为s型曲线且rox荧光ct值≤35时，判定为含有副溶血弧菌，若不显示ct值，判定为不含副溶血弧菌。
另外，本发明还提供了上述的引物组、产品或方法在检测食品中食源性致病菌的应用。
本发明提供的用于检测食源性致病菌的引物组，包括用于检测沙门氏菌的引物对、用于检测大肠杆菌o157：h7的引物对和用于检测副溶血弧菌的引物对。在同一检测体系中加入本发明提供的用于检测食源性致病菌的引物组，能够实现同时对三种致病菌的目标序列进行扩增检测，有效节约时间成本。并且，本发明是针对沙门氏菌、大肠杆菌o157、副溶血弧菌三种致病菌的保守序列设计的引物，与其它种类细菌均无交叉反应，特异性强，并且对三种致病菌的检测限都能达到100cfu/ml，灵敏度满足相应国标的要求。
本发明提供的检测食源性致病菌的方法，操作简单，不需要使用复杂仪器，操作人员只需简单培训即可，有效节约经济及人力成本。并且检测所用的试剂配制方便，也可使用配制好的试剂盒。应用本发明提供的方法对食物中的食源性致病菌进行检测，检测时间短，成本低，相比单重pcr节省大量试剂和时间，大约70分钟即可得到三种致病菌的检测结果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例2提供的检测大肠杆菌o157、沙门氏菌、副溶血弧菌三种致病菌的结果图。
具体实施方式
除非本文另有定义，连同本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应当清晰，然而，在任何潜在不明确性的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外来定义。在本申请中，除非另有说明，“或”的使用意味着“和/或”。此外，术语“包括”及其他形式的使用是非限制性的。
一般地，连同本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交使用的命名法和其技术是本领域众所周知和通常使用的那些。除非另有说明，本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行，所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书、如本领域通常实现的或如本文所述来进行。连同本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的命名法、以及其实验室程序和技术是本领域众所周知和通常使用的那些。
根据本发明的一个方面，提供了一种用于检测食源性致病菌的引物组，所述引物组包括用于检测沙门氏菌的引物对、用于检测大肠杆菌o157：h7的引物对和用于检测副溶血弧菌的引物对；
所述用于检测沙门氏菌的引物对包括sa-f和sa-r；
所述sa-f包括如seqidno.1所示的核苷酸序列，或与seqidno.1所示的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列；
所述sa-r包括如seqidno.2所示的核苷酸序列，或与seqidno.2所示的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列；
所述用于检测大肠杆菌o157：h7的引物对包括ec-f和ec-r；
所述ec-f包括如seqidno.4所示的核苷酸序列，或与seqidno.4所示的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列；
所述ec-r包括如seqidno.5所示的核苷酸序列，或与seqidno.5所示的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列；
所述用于检测副溶血弧菌的引物对包括vp-f和vp-r；
所述vp-f包括如seqidno.7所示的核苷酸序列，或与seqidno.7所示的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列；
所述vp-r包括如seqidno.8所示的核苷酸序列，或与seqidno.8所示的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列。
在同一检测体系中加入本发明提供的用于检测食源性致病菌的引物组，能够实现同时对三种致病菌的目标序列进行扩增检测，有效节约时间成本。并且，本发明是针对沙门氏菌、大肠杆菌o157、副溶血弧菌三种致病菌的保守序列设计的引物，与其它种类细菌均无交叉反应，特异性强，并且对三种致病菌的检测限都能达到100cfu/ml，灵敏度满足相应国标的要求。
需要说明的是，术语“同一性”指的是序列之间的相似性。“同一性”包括与本发明所述的seqidno.1、2、4、5、7、8所示的核苷酸序列具有至少80％(例如可以为，但不限于80％、82％、85％、88％、90％、92％、95％、98％、99％或者更高)同一性的核苷酸序列。当选择seqidno.1、2、4、5、7、8所示的核苷酸序列作为本发明提供的引物组中的引物对时，其检测特异性更强、灵敏度更高。
本发明提供的引物组适用于多种类pcr反应。例如当使用常规pcr时，可根据扩增产物的有无及扩增产物的片段大小来判定待测样本中是否含有沙门氏菌、大肠杆菌o157：h7或副溶血弧菌。当使用荧光定量pcr时，可以根据扩增产物中的荧光信号，来判断待测样本中是否含有沙门氏菌、大肠杆菌o157：h7或副溶血弧菌。对荧光定量pcr的具体表征方法不做限定，例如可以为染料法也可以为探针法。为了进一步提高荧光定量pcr反应的特异性，优选使用探针法。基于此，在一些优选的实施方式中，所述引物组还包括探针组，所述探针组包括用于检测沙门氏菌的探针、用于检测大肠杆菌o157：h7的探针和用于检测副溶血弧菌的探针。
在一些具体的实施方式中，用于检测沙门氏菌的探针sa-probe包括如seqidno.3所示的核苷酸序列，或与seqidno.3所示的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列；
用于检测大肠杆菌o157：h7的探针ec-probe包括如seqidno.6所示的核苷酸序列，或与seqidno.6所示的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列；
用于检测副溶血弧菌的探针vp-probe包括如seqidno.9所示的核苷酸序列，或与seqidno.9所示的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列。
本实施方式提高的探针，是针对沙门氏菌、大肠杆菌o157：h7、副溶血弧菌三种致病菌的保守序列设计的，与其它种类细菌均无交叉反应，同样具有特异性强、灵敏度高的优点。“同一性”包括与本实施方式所述的seqidno.3、6和9所示的核苷酸序列具有至少80％(例如可以为，但不限于80％、82％、85％、88％、90％、92％、95％、98％、99％或者更高)同一性的核苷酸序列。当选择seqidno.3、6和9所示的核苷酸序列作为本实施方式提供的探针时，其检测特异性更强、灵敏度更高。
在一些优选的实施方式中，用于检测沙门氏菌的探针、用于检测大肠杆菌o157：h7的探针和用于检测副溶血弧菌的探针均独立地含有互不相同的荧光基团，对其中的荧光基团种类不做具体限定，本领域常规使用的荧光基团均可，优选fam、hex和rox分别作为用于检测沙门氏菌的探针、用于检测大肠杆菌o157：h7的探针和用于检测副溶血弧菌的探针的荧光基团。
基于本发明提供的引物组相同的发明构思，本发明还提供了用于检测食源性致病菌的产品，因此，本发明提供的产品具有与本发明提供的引物组全部的有益效果，在此不再赘述。
在一些优选的实施方式中，所述产品可以为试剂或试剂盒。所述试剂盒中优选还包括pcr反应试剂，例如还包括10×pcrbuffer、mg2 、dntp、taqdna聚合酶和牛血清白蛋白。
优选地，所述10×pcrbuffer的ph为8.0-8.5，例如可以为，但不限于8.0、8.1、8.2或8.3，优选为8.3；
优选地，所述mg2 为mgcl2溶液，优选浓度为20-30mm的mgcl2溶液，例如可以为，但不限于浓度为20mm、22mm、25mm、28mm或30mm的mgcl2溶液，更优选浓度为25mm的mgcl2溶液；
优选地，所述dntp包括datp、dttp、dgtp和dctp，4种组分的浓度比优选为1:1:1:1，优选浓度为2-3mm的dntp，例如可以为，但不限于浓度为2mm、2.2mm、2.5mm、2.8mm或3mm的dntp，更优选浓度为2.5mm的dntp；
所述taqdna聚合酶的浓度为2-8u/μl，例如可以为，但不限于2u/μl、3u/μl、4u/μl、5u/μl、6u/μl、7u/μl或8u/μl，优选为5u/μl；
所述牛血清白蛋白的浓度为0.5-1.5mg/ml，例如可以为，但不限于0.5mg/ml、0.8mg/ml、1mg/ml、1.2mg/ml或1.5mg/ml，优选为1mg/ml；
优选地，所述引物组中各引物对的浓度均独立地为8-12μm，例如可以为，但不限于8μm、9μm、10μm、11μm或2μm，优选为10μm；
优选地，所述探针组中各探针的浓度均独立地为8-12μm，例如可以为，但不限于8μm、9μm、10μm、11μm或2μm，优选为10μm。
根据本发明的第三个方面，还提供了一种检测食源性致病菌的方法，以待测样本的基因组dna为模板，应用上述的引物组或产品进行pcr反应，若扩增产物中含有特异性片段，则待测样本中包含食源性致病菌；或者，根据扩增产物中含有的荧光信号，判断待测样本中包含的食源性致病菌。
本发明提供的检测食源性致病菌的方法，操作简单，不需要使用复杂仪器，操作人员只需简单培训即可，有效节约经济及人力成本。并且检测所用的试剂配制方便，也可使用配制好的试剂盒。应用本发明提供的方法对食物中的食源性致病菌进行检测，检测时间短，成本低，相比单重pcr节省大量试剂和时间，大约70分钟即可得到三种致病菌的检测结果。
由于本发明提供的引物组适用于多种类pcr反应，因此根据不同种类的pcr反应对应有不同的结果判定方法。例如当选择常规pcr时，若扩增产物中含有特异性片段，则待测样本中包含食源性致病菌；当选择荧光定量pcr时，根据扩增产物中含有的荧光信号，判断待测样本中包含的食源性致病菌。
需要说明的是，本发明所保护的检测食源性致病菌的方法，均是以食源性样本等作为待测样本，并不涉及疾病的诊断，因此本发明提供的检测食源性致病菌的方法为非疾病的诊断和/或治疗方法。
在一些优选的实施方式中，所述pcr为三重荧光定量pcr，所述三重荧光定量pcr的反应条件为：90-95℃预变性4-6min，90-95℃变性4-6s，58-62℃退火22-28s，反应进行42-48个循环；优选为95℃预变性5min，95℃变性5s，58-62℃退火25s，反应进行45个循环。
在一些优选的实施方式中，所述三重荧光定量pcr的反应体系为25μl，包括：10×pcrbuffer2-3μl、3-8mm的mgcl2溶液4-6μl、0.5-1mm的dntp1-3μl、0.05-0.2μl/ml的bsa2-3μl、0.1-0.3nnml的sa-f0.4-0.6μl、0.15-0.2nnml的sa-r0.3-0.5μl、0.05-0.1nnml的sa-probe0.1-0.3μl、0.1-0.3nnml的ec-f0.4-0.6μl、0.1-0.3nnml的ec-r0.4-0.6μl、0.05-0.1nnml的ec-probe0.1-0.3μl、0.1-0.3nnml的vp-f0.4-0.6μl、0.1-0.3nnml的vp-r0.4-0.6μl、0.05-0.1nnml的vp-probe0.1-0.3μl、0.05-0.1u/μl的taqdna聚合酶0.3-0.5μl、模板4-6μl和余量的水；优选地，所述三重荧光定量pcr的反应体系包括：10×pcrbuffer2.5μl、5mm的mgcl2溶液5μl、0.8mm的dntp2μl、0.1μl/ml的bsa2.5μl、0.2nnml的sa-f0.5μl、0.16nnml的sa-r0.4μl、0.08nnml的sa-probe0.2μl、0.2nnml的ec-f0.5μl、0.2nnml的ec-r0.5μl、0.08nnml的ec-probe0.2μl、0.2nnml的vp-f0.5μl、0.2nnml的vp-r0.5μl、0.08nnml的vp-probe0.2μl、0.08u/μl的taqdna聚合酶0.4μl、模板5μl和水4.1μl。
pcr反应条件及反应体系均为影响pcr特异性的重要因素，本实施方式通过对三重荧光定量pcr的反应条件和反应体系进行进一步的优化，能够使得应用本发明提供的三重荧光定量pcr方法对食品中的食源性致病菌进行检测时，特异性更强，检测结果更加准确。
在一些优选的实施方式中，用于检测沙门氏菌的探针含有fam，用于检测大肠杆菌o157：h7的探针含有hex，用于检测副溶血弧菌的探针含有rox；
若待测样本的扩增曲线为s型曲线且fam荧光ct值≤33时，判定为含有沙门氏菌，ct值≥36时，判定为不含沙门氏菌；若33<ct值<36，以同一待测样本重做试验，重做结果ct值≥36，则判定为不含沙门氏菌，否则判定待测样本中含有沙门氏菌；
若待测样本的扩增曲线为s型曲线且hex荧光ct值≤36时，判定为含有大肠杆菌o157：h7，若不显示ct值，判定为不含大肠杆菌o157：h7；
若待测样本的扩增曲线为s型曲线且rox荧光ct值≤35时，判定为含有副溶血弧菌，若不显示ct值，判定为不含副溶血弧菌。
通过对结果判读规则进行进一步的限定，能够进一步避免假阳性或假阴性的检测结果，增强检测结果的准确性。
此外，本发明还提供了上述的引物组、产品或方法在检测食品中食源性致病菌的应用。应用本发明提供的引物组、产品或方法对食物中的食源性致病菌进行检测，具有检测时间短，成本低的优点。
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
本发明实施例中用到的主要试剂信息如下：
本发明涉及到的仪器包括均质仪、离心机、恒温金属浴、荧光定量pcr仪，涉及到的试剂包括样本提取液、10×pcrbuffer、mgcl2、dntp、bsa溶液、引物探针、taq酶；上述设备和试剂除离心机来源于thermofisher外，其余均来源于杭州博日科技有限公司。
实施例1引物和探针的设计及合成
引物探针设计：根据genebank数据库中已公布的沙门氏菌属的inva毒素基因、大肠杆菌o157毒素基因rfbe、副溶血弧菌的toxr基因，利用beacondesigner7.0设计软件在上述基因保守区设计引物和探针，设计的探针必须满足种间特异种内保守原则，blast分析比较引物探针同源性和特异性。所合成引物探针均由上海英潍捷基合成。引物与探针序列如下：
sa-f：5’-tggtggtacatcaaatgc-3’，原始浓度为10μm；
sa-r：5’-ccaacatattcaataatttcagca-3’，原始浓度为10μm；
ec-f：5’-ttcgctttactttgctgg-3’，原始浓度为10μm；
ec-r：5’-cgacataatccgtttcca-3’，原始浓度为10μm；
vp-f：5’-gctgcgaccacaattttg-3’，原始浓度为10μm；
vp-r：5’-ccagaaacaggacatacaataaac-3’，原始浓度为10μm；
sa-probe：5’-aactacaccagcatcttcagcatct-3’，原始浓度为10μm；
ec-probe：5’-caatagagcatcgccagccatac-3’，原始浓度为10μm；
vp-probe：5’-acattcgctgagtattgaccaagac-3’，原始浓度为10μm。
实施例2检测应用
(1)蔬菜样本前处理
无菌操作取20g蔬菜样本放入无菌均质袋(内含100ml无菌生理盐水)中，均质仪上拍打混匀，液体滤出备用。
(2)核酸dna的制备
取2ml样液，13000rpm离心5min，吸弃上清；向管中加入100μl样本提取液，漩涡震荡10s，90℃加热10min，13000rpm离心5min，吸取上清备用。
(3)用于三重pcr的引物探针序列如下所示：
(4)三重pcr反应体系
pcr反应总体积为25μl，体系组成如下：
(5)三重pcr的反应程序如下：
(6)三重pcr检测试剂进行基因检测分析
本次检测中三重pcr试剂能同时检出沙门氏菌、大肠杆菌o157、副溶血弧菌。见附图1。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
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<110>杭州博日科技有限公司
<120>用于检测食源性致病菌的引物组、产品、检测方法及应用
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<213>人工序列
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<213>人工序列
<400>9
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1.一种用于检测食源性致病菌的引物组，其特征在于，所述引物组包括用于检测沙门氏菌的引物对、用于检测大肠杆菌o157：h7的引物对和用于检测副溶血弧菌的引物对；
所述用于检测沙门氏菌的引物对包括sa-f和sa-r；
所述sa-f包括如seqidno.1所示的核苷酸序列，或与seqidno.1所示的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列；
所述sa-r包括如seqidno.2所示的核苷酸序列，或与seqidno.2所示的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列；
所述用于检测大肠杆菌o157：h7的引物对包括ec-f和ec-r；
所述ec-f包括如seqidno.4所示的核苷酸序列，或与seqidno.4所示的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列；
所述ec-r包括如seqidno.5所示的核苷酸序列，或与seqidno.5所示的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列；
所述用于检测副溶血弧菌的引物对包括vp-f和vp-r；
所述vp-f包括如seqidno.7所示的核苷酸序列，或与seqidno.7所示的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列；
所述vp-r包括如seqidno.8所示的核苷酸序列，或与seqidno.8所示的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述引物组还包括探针组，所述探针组包括用于检测沙门氏菌的探针、用于检测大肠杆菌o157：h7的探针和用于检测副溶血弧菌的探针。
3.根据权利要求2所述的引物组，其特征在于，用于检测沙门氏菌的探针sa-probe包括如seqidno.3所示的核苷酸序列，或与seqidno.3所示的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列；
用于检测大肠杆菌o157：h7的探针ec-probe包括如seqidno.6所示的核苷酸序列，或与seqidno.6所示的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列；
用于检测副溶血弧菌的探针vp-probe包括如seqidno.9所示的核苷酸序列，或与seqidno.9所示的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列。
4.根据权利要求2或3所述的引物组，其特征在于，用于检测沙门氏菌的探针、用于检测大肠杆菌o157：h7的探针和用于检测副溶血弧菌的探针均独立地含有互不相同的荧光基团；
优选地，所述荧光基团包括fam、hex和rox；
优选地，所述用于检测沙门氏菌的探针含有fam，所述用于检测大肠杆菌o157：h7的探针含有hex，所述用于检测副溶血弧菌的探针含有rox。
5.一种用于检测食源性致病菌的产品，其特征在于，包括权利要求1-4任一项所述的引物组。
6.根据权利要求5所述的产品，其特征在于，所述产品包括试剂或试剂盒；
优选地，所述试剂盒还包括pcr反应试剂；
优选地，所述pcr反应试剂包括10×pcrbuffer、mg2 、dntp、taqdna聚合酶和牛血清白蛋白；
优选地，所述10×pcrbuffer的ph为8.0-8.5，优选为8.3；
优选地，所述mg2 为mgcl2溶液，优选浓度为20-30mm的mgcl2溶液，更优选浓度为25mm的mgcl2溶液；
优选地，所述dntp包括datp、dttp、dgtp和dctp，优选datp、dttp、dgtp和dctp的浓度比为1:1:1:1，优选浓度为2-3mm的dntp，更优选浓度为2.5mm的dntp；
所述taqdna聚合酶的浓度为2-8u/μl，优选为5u/μl；
所述牛血清白蛋白的浓度为0.5-1.5mg/ml，优选为1mg/ml；
优选地，所述引物组中各引物对的浓度均独立地为8-12μm，优选为10μm；
优选地，所述探针组中各探针的浓度均独立地为8-12μm，优选为10μm。
7.一种检测食源性致病菌的方法，其特征在于，以待测样本的基因组dna为模板，应用权利要求1-4任一项所述的引物组或权利要求5或6所述的产品进行pcr反应，若扩增产物中含有特异性片段，则待测样本中包含食源性致病菌；或者，根据扩增产物中含有的荧光信号，判断待测样本中包含的食源性致病菌。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述pcr为三重荧光定量pcr，所述三重荧光定量pcr的反应条件为：90-95℃预变性4-6min，90-95℃变性4-6s，58-62℃退火22-28s，反应进行42-48个循环；
优选为95℃预变性5min，95℃变性5s，58-62℃退火25s，反应进行45个循环；
优选地，所述三重荧光定量pcr的反应体系为25μl，包括：10×pcrbuffer2-3μl、3-8mm的mgcl2溶液4-6μl、0.5-1mm的dntp1-3μl、0.05-0.2μl/ml的bsa2-3μl、0.1-0.3nnml的sa-f0.4-0.6μl、0.15-0.2nnml的sa-r0.3-0.5μl、0.05-0.1nnml的sa-probe0.1-0.3μl、0.1-0.3nnml的ec-f0.4-0.6μl、0.1-0.3nnml的ec-r0.4-0.6μl、0.05-0.1nnml的ec-probe0.1-0.3μl、0.1-0.3nnml的vp-f0.4-0.6μl、0.1-0.3nnml的vp-r0.4-0.6μl、0.05-0.1nnml的vp-probe0.1-0.3μl、0.05-0.1u/μl的taqdna聚合酶0.3-0.5μl、模板4-6μl和余量的水；
优选地，所述三重荧光定量pcr的反应体系包括：10×pcrbuffer2.5μl、5mm的mgcl2溶液5μl、0.8mm的dntp2μl、0.1μl/ml的bsa2.5μl、0.2nnml的sa-f0.5μl、0.16nnml的sa-r0.4μl、0.08nnml的sa-probe0.2μl、0.2nnml的ec-f0.5μl、0.2nnml的ec-r0.5μl、0.08nnml的ec-probe0.2μl、0.2nnml的vp-f0.5μl、0.2nnml的vp-r0.5μl、0.08nnml的vp-probe0.2μl、0.08u/μl的taqdna聚合酶0.4μl、模板5μl和水4.1μl。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，用于检测沙门氏菌的探针含有fam，用于检测大肠杆菌o157：h7的探针含有hex，用于检测副溶血弧菌的探针含有rox；
若待测样本的扩增曲线为s型曲线且fam荧光ct值≤33时，判定为含有沙门氏菌，ct值≥36时，判定为不含沙门氏菌；
若待测样本的扩增曲线为s型曲线且hex荧光ct值≤36时，判定为含有大肠杆菌o157：h7，若不显示ct值，判定为不含大肠杆菌o157：h7；
若待测样本的扩增曲线为s型曲线且rox荧光ct值≤35时，判定为含有副溶血弧菌，若不显示ct值，判定为不含副溶血弧菌。
10.如权利要求1-4任一项所述的引物组、权利要求5或6所述的产品或权利要求7-9任一项所述的方法在检测食品中食源性致病菌的应用。
技术总结