本发明属于水稻育种领域，涉及一种创制高粒重、低垩白、中等直链淀粉含量和低糊化温度水稻种质的方法。
背景技术：
稻米品质优劣直接影响稻米的商品流通与消费。稻米品质可分为外观品质和食味品质，随着现代生活水平的提高，消费者对高档优质稻米的需求日益加剧，高端稻米外观要求米粒细长、晶莹剔透、颗粒分明，在口感上要求柔软丝滑、香味浓郁。但是，目前市场上大多数主推品种主要存在两个主要问题：(1)稻米外观不够细长、垩白度以及垩白率偏高；(2)高端优质品种产量普遍偏低。因此，针对以上问题，开发影响稻米外观和食味品质的关键基因kasp标记对改良、选育优质高产品种具有重要意义。
粒型与稻米外观紧密相关。高档优质品种“稻花香”、“泰国香米”均为长粒型品种，相关研究表明，适当增加稻米的长宽比有助于降低垩白率和垩白度。目前已经克隆的粒型相关基因多达30个以上(songetal.2007；wangetal.2008；lietal.2011；sunetal.2013；ishimaruetal.2013；wangetal.2012；xuetal.2015；songetal.2015；cheetal.2016；maoetal.2010；zhangetal.2012；wangetal.2015；qianetal.2018)，但是仅gs3、gs9、gw5、gl3、gl7、qlgy3报道显著影响稻谷的粒长和垩白度等。但是，米粒细长会对水稻产量会产生负向效应，造成“优质不高产”的现象。因此，如何利用粒型基因以及基因组合实现外观品质与产量的平衡是品种选育需要解决的关键问题。
水稻品种的直链淀粉含量和糊化温度是影响稻米食味品质的两个最主要因素。直链淀粉含量主要受基因wx控制，不同复等位基因型(wxa、wxb、wxin、wxmp、wxhp、wxmq)控制不同的直链淀粉含量，其中wxa的稻米直链淀粉含量在24％以上，米饭口感偏硬。而wxb直链淀粉含量则在15％～18％之间，米饭口感较软(wangetal.1995)。wxin直链淀粉含量一般在18％～22％(mikamietal.,2008)，wxmp、wxhp、wxmq虽然具有较低直链淀粉含量(8％～10％)和偏软口感，但是低直链淀粉含量导致的稻米“云雾状”外观并不能被米加工企业和广大消费者青睐。因此，从晶莹剔透外观和软硬适中口感要求出发，利用中等直链淀粉含量(15％～18％)的wx等位基因型(wxb、wxin)改良现有品种是一种有效途径。此外，影响稻米食味品质的另外一个主效基因为控制糊化温度的alk基因，低糊化温度的品种碱消值高，冷饭口感偏软(zhangetal.,2011)。
综上所述，稻米外观品质和食味品质是由多基因控制的复杂性状，只有多基因聚合才能实现稻米外观和食味品质的同步改良。因此，开发一套能鉴别不同粒型、直链淀粉含量和糊化温度的kasp标记，并对现有种质中的粒型、直链淀粉含量、糊化温度基因进行分型，利用kasp标记高通量的优点，实现多个有利基因聚合，创制优质、高产的种质资源。
参考文献：
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技术实现要素：
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种改良水稻稻米外观和食味品质的方法。
本发明的另一目的是提供在创制高粒重、低垩白、中等直链淀粉淀粉含量和低糊化温度的种质材料中应用的kasp标记引物组合物。
本发明的目的可通过以下技术方案实现：
一组基因组合作为靶点在创制高粒重、低垩白、中等直链淀粉淀粉含量和低糊化温度的种质材料中的应用；所述的基因组合包括以下三组中的任意一组或多组：(1)粒重、粒型主效基因；(2)直链淀粉含量主效基因；(3)糊化温度主效基因。
所述的基因组合优选包括以下三组中的任意一组或多组；(1)粒重、粒型和垩白率的主效基因：选自gs3、gw5、gl7以及lgy3基因中的两种及两种以上；其中选择gs3在第3染色体的16,733,441位存在特异性变异，c：短粒/t：长粒；gw5在第5染色体的第5,365,520位碱基存在特异性变异，t：短粒/c：长粒，gl7在第7染色体的第24,666,092位碱基存在特异性变异，a：短粒/c：长粒，lgy3在第3染色体的第6,053,302位碱基存在特异性变异，g：短粒/t：长粒；(2)直链淀粉含量主效基因：选自中等直链淀粉含量的wx等位基因型wxb或wxin，其中wxb的第6染色体的第1,765,415位碱基为“t”，wxin第6染色体的第1,768,006位碱基为“t”；(3)糊化温度主效基因：alk基因在第6染色体的第6,748,824位碱基存在特异性变异，c：低糊化温度/g：高糊化温度，在第6染色体的第67,523,57位碱基存在特异性变异a：低糊化温度/g：高糊化温度。
在创制高粒重、低垩白、中等直链淀粉淀粉含量和低糊化温度的种质材料中应用的kasp标记引物组合物，所述的kasp标记引物组合物选自如下表所示的多个鉴别基因对应的kasp标记引物组合物:
所述的组合物优选由seqidno.1～seqidno.3、seqidno.7～seqidno.9及seqidno.25～seqidno.30所示的引物组成。
一种创制高粒重、低垩白、中等直链淀粉淀粉含量和低糊化温度的水稻种质的方法，包含：
(1)以“扬籼9b”为轮回亲本，以“象牙香占”占为母本杂交获得f1；
(2)种植20株f1单株，以扬籼9b为轮回亲本，回较获得bc1f1种子，田间种植40株bc1f1植株，并利用所述的粒型、糊化温度基因的kasp标记引物检测每个单株的基因型，从中选择同时携带gs3、gl7、alkl基因型的5个单株与轮回亲本扬籼9b进行回交，获得bc2f1种子；
(3)田间种植100株bc2f1植株，并利用所述的粒型、糊化温度基因的kasp标记引物检测每个bc2f1单株的基因型，从中选择同时携带gs3、gl7、alkl基因型的单株与轮回亲本扬籼9b进行回交获得bc3f1种子；
(4)田间种植200株bc3f1植株，利用所述的粒型、糊化温度基因的kasp标记引物检测每个单株基因型，从中获得同时携带gs3、gl7、alkl基因型的121个单株，收获每个单株的种子用于测定千粒重、粒长、粒宽。
根据权利要求5所述的方法，其特征在于用seqidno.1～seqidno.3所示引物检测单株的gs3基因，用seqidno.7～seqidno.9所示引物检测单株的gl7基因，用seqidno.25～seqidno.27所示引物和seqidno.28～seqidno.30所示引物分别扩增alk基因，同时满足gs3基因第3染色体的16,733,441位碱基为“t”，gl7第7染色体的第24,666,092位碱基为“c”，alk基因第3染色体的6,748,824以及67,523,57位碱基分别为“c”和“a”的单株为携带gs3/gl7、alkl基因型的单株。本发明的发明点：
1、控制千粒重、粒型关键基因/基因组合的鉴定。通过全基因组关联分析的方法对控制粒长、粒宽以及粒重的基因进行定位，明确了gs3(os03g0407400)、gw5(os05g0187500)、gl7(os07g0603300)以及lgy3(os03g0215400)四个基因同时对粒重和粒长具有主效作用。
2、鉴定出gs3、gw5、gl7以及lgy3基因编码框内影响粒型和粒重的关键snp变异，其中gs3在第3染色体的16,733,441位碱基存在特异性变异(c：短粒/t：长粒)，gw5在第5染色体的第5,365,520位碱基存在特异性变异(t：短粒/c：长粒)，gl7在第7染色体的第24,666,092位碱基存在特异性变异(a：短粒/c：长粒)，lgy3在第3染色体的第6,053,302位碱基存在特异性变异(g：短粒/t：长粒)。利用这些特异性标记位点的开发了一套鉴别粒型基因的kasp标记(表2)。
3、利用以上影响粒型的特异性变异位点对测序品种进行分型，鉴定出gs3、gw5、gl7以及lgy3多基因聚合可以在不影响粒重的前提下，显著增加品种的粒长和降低稻米垩白度、垩白率，其中携带gs3/gl7、gs3/gw5/gl7基因组合的品种具有长粒、高粒重以及低垩白的特性。
4、针对影响食味品质的两个关键基因wx(os06g0133000)和alk(os06g0229800)存在多种复等位形式，对wx和alk编码框进行测序，获得wx不同复等位基因(wxa、wxb、wxin、wxmp、wxop)间特异性snp位点，其中wxa和wxb在第6染色体的第1,765,415位碱基上存在特异性差异(wxa：g/wxb：t)；wxmp在第6染色体的第1,767,613位碱基存在特异性差异(wxmp：a)，wxop在第6染色体的第1,767,637位碱基存在特异性差异(wxop：g)，wxin在第6染色体的第1,768,006位碱基存在特异性差异(wxin：t)，根据以上snp变异位点设计kasp标记，引物序列见表2。
5、针对糊化温度基因alk分别在第6染色体的6,748,824以及67,523,57位碱基存在特异性变异(c：低糊化温度/g：高糊化温度；a：低糊化温度/g：高糊化温度)，根据以上特性变异位点开发了2个kasp标记(表2)，根据kasp标记分型，本发明公布的标记可以有效地将高、低糊化温度两种品种类型分开(图3d)。
6、利用以上开发的粒型(gs3、gw5、gl7以及lgy3)、wx以及alk基因的kasp标记对现有品种进行基因型进行鉴定，在基因型分型的基础上，选择具有长粒、高粒重、中等直链淀粉含量以及低糊化温度的有利基因型品种进行杂交和回交，定向选择创制高粒重、低垩白率和低糊化温度温度的种质资源。
有益效果：
本发明利用以上粒型、直链淀粉含量和糊化温度基因的kasp标记开发了一种基于扬籼9b背景选育高粒重、低垩白、中等直链淀粉淀粉含量和低糊化温度种质材料的方法。本发明对影响稻米外观和食味品质主效基因的kasp标记开发，将为改良和选育优质高产品种提供技术支撑。
附图说明
图1gs3、gw5、gl7和lgy3基因关键snp变异位点以及基因组合方式对长宽比、千粒重和垩白率的影响。
a：gs3、gw5、gl7和lgy3基因组合方式对长宽比、千粒重和垩白率的影响，不同字母代表存在显著性差异(p<0.001)；b：基于gs3、gw5、gl7和lgy3基因kasp标记的分型效果；c：籼稻、粳稻品种中gs3、gw5、gl7和lgy3基因组合方式对粒型的效果。
图2wx复等位基因关键变异snp位点以及kasp标记的分型结果
a：wx复等位基因关键snp变异位点；b：关键snp变异位点开发的kasp标记分型效果
图3alk基因等基因类型的kasp标记的开发
a：alk等位复等位基因变异位点信息以及kasp标记(alk-1和alk-2)分型效果；b：alk-1和alk-2在籼稻、粳稻品种的检测分型；c：低糊化温度、高糊化温度品种的基因型；d：低糊化温度、高糊化温度品种碱消值鉴定。
图4扬籼9b粒型和外观品质
a：bc3f1单株千粒重变化；b：bc3f1单株稻谷长宽比变化；c：bc3f1单株稻米垩白率的变化；d：bc3f1单株稻米垩白率与长宽比之间的相关性；e：携带gs3/gl7长粒基因组合单珠195-1、195-2在粒型、垩白率方面显著优于轮回亲本扬籼稻9b。
具体实现步骤：
实施例1
1、影响粒型、千粒重的基因鉴定
(1)利用国内外搜集的426份籼稻、粳稻品种进行简易基因组测序，参考基因组为日本晴参考基因组(irgsp-1.0，https://rapdb.dna.affrc.go.jp)，序列比对分析软件为bwa(http://bio-bwa.sourceforge.net)，为了提高后续snp信息提取的可靠性，质量控制参数设置为:每个位点的mapping质量值大于20、变异质量值大于50，而且每个碱基至少有2个以上reads数据的支持，maf值>0.001，snp提取软件为gatkv4.1.4.1(https://software.broadinstitute.org/gatk/download/)。
(2)以上测序的426份品质在江苏扬州万福基地(119°42'e,32°39'n)种植，每个小区种植40株规模，栽插规格为(行距为29.9cm，株距为13.32cm)，每个品种均随机排列三个重复。田间管理11kg/亩氮肥，记载每个小区的抽穗期基本农艺性状，成熟后每小区收获稻谷。
(3)稻谷外观参照国家优质稻谷测定标准(gb/t17891-2017)标准测定稻谷千粒重、长度、宽度以及稻米直链淀粉含量，碱消值测定方法和标准参照农业行业标准“食用稻品种品质”(ny/t593-2013)。
(4)以上品种的千粒重、粒长、粒宽以及长宽比表型数据结合基因型数据，利用tassel5.0(https://www.maizegenetics.net/tassel)进行全基因组关联分析。以-log(p)>9为阀值，确定对粒型、千粒重均有影响的基因为gs3、gw5、gl7以及lgy3，关键snp变异位点见表1。
2、粒型基因组合方式对粒重、粒型以及垩白率的影响
(1)根据以上gs3、gw5、gl7以及lgy3基因的关键snp变异类型，可将以上品种分为10种类型(图1a)，粒型基因的累加数目与长宽比成正相关，累加的粒型基因越多，稻谷长宽比越大。
(2)在以上鉴定的10种粒型基因组中，除了携带gs3、gw5、lgy3单基因的品种在千粒重上与携带单基因gs3的品种存在差异外(p<0.01)，其余粒型基因组合方式(gl7、gl7/lgy3、gs3/gl7、gs3/gw5/gl7、gw5/gl7/lgy3以及gs3/gw5/gl7/lgy3)在粒重上并无显著差异。但是，在垩白率方面随着长粒型基因的累加，垩白率呈现显著下降的趋势，聚合gl7/lgy3、gs3/gl7、gs3/gw5/gl7、gw5/gl7/lgy3以及gs3/gw5/gl7/lgy3的品种在垩白率上显著低于携带gs3、lgy3、gw5单基因的品种(p<0.001)。因此，通过gs3、gw5、gl7、lgy3型基因的累加可以在不降低粒重的情况下实现稻谷粒型增长和垩白率降低。
(3)根据以上gs3、gw5、gl7以及lgy3基因的关键snp变异信息设计kasp标记(表2)，pcr扩增反应使用的体系为96孔板，10μl体系，反应体系的parmsmix购于武汉景泰生物科技有限公司，具体反应体系如下：
pcr扩增反应的条件为：
pcr反应结束后，利用bio-radcfx荧光定量pcr仪对kasp反应产物进行荧光数据读取，荧光扫描的结果对目前籼稻、粳稻的主推优质品种进行粒型基因型分型(图1b)。
根据分型结果选择部分粒型基因组合观测外观表型，可见，在籼稻、粳稻背景下，以上开发粒型kasp标记可以将长、短粒品种区别开，并且长粒基因聚合越多，品种稻谷和长宽比越大，米粒更加细长(图1c)。
3、食味品质关键基因(wx和alk)的kasp标记开发
(1)控制直链淀粉淀粉含量的主效基因“wx”基因(os06g0133000)位于第6号染色体1.67mb附近，该基因以多种复等位变异类型控制不同直链淀粉含量，其中wxa在1,765,415位点上为“g”，而wxb为“t”；wxmp在第6染色体的第1,767,613位碱基(即该基因的第3外显子的第53位碱基)为“a”；wxop在第6染色体的第1,767,637位碱基(即该基因第3外显子的第77位碱基)为“g”；wxin在第6染色体的第1,768,006位碱基(即该基因第5外显子的第64位碱基)为“t”(图2a)。根据以上关键snp变异位点设计kasp标记，分型效果见图2b。
(2)控制糊化温度的主效基因“alk”(os06g0229800)位于第6染色体6.74mb附近，目前已知主要存在两种等位基因型，即高糊化温度(alkh)和低糊化温度(alkl)两种类型，alkh在该基因的第1外显子的第264位碱基为“g”，并且第8外显子的第934位碱基为“g”，而alkl在以上两个位点的碱基分别为“c”和“a”。
(3)根据以上两个特异性snp位点设计kasp标记(alk-1和alk-2)，标记信息见表2，两个标记的分型效果见图3b，在自然品种中检测到“象牙香占”、“红光粳1号”等具有高糊化温度基因型，而“美香占2号”、“金香玉1号”具有低糊化温度基因型(图3c)。碱消值鉴定表明，高糊化温度品种具有低碱消值(1-2级)，低糊化温度品种具有高碱消值(6-7级)(图3d)。因此，以上开发的alk基因的kasp标记可以有效的区别高、低糊化温度特性的品种。
实施例2、创制长粒、低垩白、高粒重种质材料
(1)“扬籼9a”具有抗高温、高抗稻瘟病、配合力好等优点，以扬籼9a为母本配置了一批高产的杂交籼稻组合，包括“扬籼优919”、“扬籼优918”等。但是，该不育系的粒型长宽比为3.1，限制其在生产上的进一步应用。因此，利用以上开发的kasp标记对目前的保持系亲本进行粒型、直链淀粉含量以及糊化基因型进行分型，结果显示扬籼9b在wx位点上为wxb基因型，具有中等直链淀粉含量，粒型基因仅含有gs3，稻谷长宽比为3.1，米粒垩白率为31.8％，alk基因型为低糊化温度类型。长粒型的“象牙香占”具有gs3/gl7基因组合，稻谷长宽比为4.5，直链淀粉含量中等，wx基因型为wxb，但是alk基因型为高糊化温度类型。因此，以扬籼9b为轮回亲本，以象牙香占为母本杂交获得f1。
(2)种植20株f1单株，以扬籼9b为轮回亲本，回较获得80粒bc1f1种子。田间种植40株bc1f1单株，并利用粒型和糊化温度基因的kasp标记检测每个单株的基因分型情况，从中选择携带gs3、gl7、alkl基因型的5个单株与轮回亲本扬籼9b进行回交，获得120粒bc2f1种子。
(3)田间种植100株bc2f1单株，并利用粒型和糊化温度基因的kasp标记检测每个bc2f1单株的基因型，从中选择携带gs3、gl7、alkl基因型的10个单株与轮回亲本扬籼9b进行回交获得300粒bc3f1种子。
(4)田间种植200株bc3f1单株，每个单株检测粒型和糊化温度的基因型，从中获得携带gs3、gl7、alkl基因型的121个单株，收获种子用于测定千粒重、粒长、粒宽。从图3a可以看出，通过gl7基因的定向导入，bc3f1单株的长宽比较轮回亲本显著改良，变异范围为(3.46～4.76)，而轮回亲本的长宽比为3.12。在千粒重方面，大部分改良单株的千粒重与轮回亲本类似，表型变异范围为(23.12g～29.1g)，并无显著差异。但是，携带gl7的单株在垩白率上显著低于轮回亲本，轮回亲本的垩白率为34.5％，而改良单株的垩白率变异范围为1.2％～27.8％，长宽比和垩白率之间存在显著相关性(r2＝0.5367)(图4d)。其中195-1、195-2单株在粒重与轮回亲本类似，但是在垩白率方面显著优于轮回亲本(图4e)。
表1千粒重、粒长、粒宽gwas定位结果
表2千粒重、粒长、粒宽主效基因的kasp标记序列
序列表
<110>江苏里下河地区农业科学研究所
<120>一种改良稻米外观和食味品质的方法
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<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
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caccttctccaggaatgacgg21
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<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>20
gaaggtcggagtcaacggatttccaggaatgacggatggc40
<210>21
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<213>人工序列(artificialsequence)
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gaaggtgaccaagttcatgcttctccaggaatgacggatggt42
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<211>23
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<213>人工序列(artificialsequence)
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<213>人工序列(artificialsequence)
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<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
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<210>25
<211>23
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
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cacctgttgtcagtaacaaaccg23
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<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>26
gaaggtcggagtcaacggattgcgggtgaggacgacgag39
<210>27
<211>39
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>27
gaaggtgaccaagttcatgctgcgggtgaggacgacgac39
<210>27
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<213>人工序列(artificialsequence)
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ccaacccaccttgccgac18
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gaaggtcggagtcaacggattggcctcgctggactccg38
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<211>38
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>29
gaaggtgaccaagttcatgctggcctcgctggactcca38
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<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>30
atgaacccgatcagcggc18
1.一组基因组合作为靶点在创制高粒重、低垩白、中等直链淀粉淀粉含量和低糊化温度的种质材料中的应用；所述的基因组合包括以下三组中的任意一组或多组：(1)粒重、粒型和垩白率的主效基因；(2)直链淀粉含量主效基因；(3)糊化温度主效基因。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的基因组合包括以下三组中的任意一组或多组；(1)粒重、粒型和垩白率的主效基因：选自gs3、gw5、gl7以及lgy3基因中的两种及两种以上；其中gs3在第3染色体的16,733,441位存在特异性变异，c：短粒/t：长粒；gw5在第5染色体的第5,365,520位碱基存在特异性变异，t：短粒/c：长粒，gl7在第7染色体的第24,666,092位碱基存在特异性变异，a：短粒/c：长粒，lgy3在第3染色体的第6,053,302位碱基存在特异性变异，g：短粒/t：长粒；(2)直链淀粉含量主效基因：选自中等直链淀粉含量的wx等位基因型wxb或wxin，其中wxb的第6染色体的第1,765,415位碱基为“t”，wxin第6染色体的第1,768,006位碱基为“t”；(3)糊化温度主效基因：alk基因在第6染色体的第6,748,824位碱基存在特异性变异，c：低糊化温度/g：高糊化温度，在第6染色体的第67,523,57位碱基存在特异性变异，a：低糊化温度/g：高糊化温度。
3.在创制高粒重、低垩白、中等直链淀粉淀粉含量和低糊化温度的种质材料中应用的kasp标记引物组合物，其特征在于所述的kasp标记引物组合物选自如下表所示的多个鉴别基因对应的kasp标记引物组合物:
4.根据权利要求3所述的kasp标记引物组合物，其特征在于所述的组合物由seqidno.1～seqidno.3、seqidno.7～seqidno.9及seqidno.25～seqidno.30所示的引物组成。
5.一种创制高粒重、低垩白、中等直链淀粉淀粉含量和低糊化温度的水稻种质的方法，其特征在于包含：
(1)以“扬籼9b”为轮回亲本，以“象牙香占”占为母本杂交获得f1；
(2)种植f1单株，以扬籼9b为轮回亲本，回较获得bc1f1种子，田间种植40株bc1f1植株，并利用所述的粒型、糊化温度基因的kasp标记引物检测每个单株的基因型，从中选择同时携带gs3、gl7、alkl基因型的5个单株与轮回亲本扬籼9b进行回交，获得bc2f1种子；
(3)田间种植40株bc2f1植株，并利用所述的粒型、糊化温度基因的kasp标记引物检测每个bc2f1单株的基因型，从中选择同时携带gs3、gl7和alkl基因型的单株与轮回亲本扬籼9b进行回交获得bc3f1种子；
(4)田间种植200株bc3f1植株，利用所述的粒型、糊化温度基因的kasp标记引物检测每个单株基因型，从中获得同时携带gs3、gl7和alkl基因型的121个单株，收获每个单株的种子用于测定千粒重、粒长和粒宽。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于用seqidno.1～seqidno.3所示引物检测单株的gs3基因，用seqidno.7～seqidno.9所示引物检测单株的gl7基因，用seqidno.25～seqidno.27所示引物和seqidno.28～seqidno.30所示引物分别扩增alk基因，同时满足gs3基因第3染色体的16,733,441位碱基为“t”，gl7第7染色体的第24,666,092位碱基为“c”，alk基因第3染色体的6,748,824以及67,523,57位碱基分别为“c”和“a”的的单株为携带gs3、gl7、alkl基因型的单株。
技术总结