本发明涉及一种沉香属物种的鉴定方法，更具体地，设计一种its序列和机器学习鉴定土沉香、云南沉香、毛沉香、卡明沉香、小果沉香、具喙沉香的方法。
背景技术：
瑞香科(thymelaeaceae)沉香属(aquilaria)植物是热带及亚热带常绿乔木，大多分布于印度尼西亚、马来西亚、越南等东南亚国家。沉香，即沉香属植物受伤后分泌的树脂与木质结合在一起形成的融合物。沉香是我国及其他东南亚国家沿用历史悠久的珍贵传统药材，其价值极高，被誉为“药中黄金”。沉香其味辛苦，性微温，具行气止痛、文中止呕、纳气平喘等功效，可用于胸腹胀闷疼痛、胃寒呕吐呃逆、肾虚气逆喘息。除了具有极高的药用价值，沉香也是制作高级香料的必备材料，同时，沉香还可以制作雕刻品、家具等产品，倍受国内外消费者的欢迎。但由于需索无度，长期无节制的毁灭性采香，使得野生沉香植物濒临灭绝。目前已发现有多种沉香属物种可形成沉香，而不同沉香物种、不同结香方法产生的沉香在沉香品质、化学成分含量、药用价值及市场价格方面具有较大差异，单靠形态、化学组分分析等方法不能全面、科学地鉴定与评估沉香植物。因此，为了从沉香物种水平上对沉香质量进行把控，需要一种更精确、更快速的鉴定方法来实现对沉香物种进行鉴定。
已有利用snp分子标记对土沉香、云南沉香和马来沉香序列进行鉴别的报道，报道中需同时满足核苷酸序列中连续4个碱基方可鉴定成功，一旦连续的4个碱基中某1个碱基发生突变，就可能导致鉴定失败。因此，有必要改进鉴别方法，为沉香的基源植物资源保护和贸易提供理论基础和技术支持。
随着人工智能的发展，机器学习作为当前计算机科学最热门的研究方向之一，在各种各样的领域得到了迅速的发展。为了充分且有效地利用生物学数据，机器学习技术也被广泛应用于生物信息学研究中。目前，国内外尚未有将its序列和机器学习相结合用于沉香属物种鉴定的报道。
技术实现要素：
为了克服已有技术的不足，本发明的目的在于提供一种结合its序列与机器学习的方法来准确、快速、特异地鉴定种土沉香、云南沉香、毛沉香、卡明沉香、小果沉香、具喙沉香6个沉香属物种。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
一种基于its序列和机器学习的沉香属物种鉴定方法，包括如下步骤：
s1：数据的获取和数据集的建立
获取土沉香、云南沉香、毛沉香、卡明沉香、小果沉香、具喙沉香的its区序列，并进行比对，切除引物端后，去除存在高度缺失的序列，得到用于机器学习的数据集。
具体地，上述s1中，its区序列一部分来自于实验获取，物种是土沉香、云南沉香和毛沉香，通过分子生物学实验及测序获得该3个沉香属物种的its区序列，具体包括如下步骤：
s11.以改良的ctab法，对3个待测物种样品的总dna进行提取；
优选地，取新鲜采集的瑞香科沉香属植物的叶片，待测叶片先经过预处理后才进行dna的提取，所述预处理是将叶片浸泡于75％乙醇溶液中5min，取出后放置于无菌环境中风干。将风干的叶片放置在已预冷的研钵中，加液氮进行研磨至粉末，该粉末即为待测样品。
s12.以3个待测物种样品的总dna为模板，利用引物its5和its4进行pcr扩增得到沉香属植物的its区序列；上述引物its5和its4是针对沉香属植物而设计的专用引物，其中，引物its4的核苷酸序列如seqidno:1所示，its5的核苷酸序列如seqidno:2所示。
seqno.1:tcctccgcttattgatatgc20
seqno.2:ggaagtaaaagtcgtaacaagg22
优选地，pcr扩增反应体系总体积为20μl，该反应体系包含10×pcrbuffer(2.5mmol/l，含mgcl2)2μl，dntps(2.5mmol/l)1.6μl，引物its4、its5(10μmol/l)各0.8μl，hifidna聚合酶(5u/μl)0.1μl，加入dna模板2μl，其余体积用无菌水补足。
优选地，所述pcr扩增参数为：95℃预变性3min，95℃变性1min，56℃退火50s，72℃延伸50s，共循环30次，最后在72℃延伸10min。
具体地，上述s1中，its区序列一部分来自于genbank，物种是土沉香、云南沉香、毛沉香、卡明沉香、小果沉香、具喙沉香。
进一步地，将实验获得的与从genbank下载的its区序列合为一个文件并导入mega(版本7.0)软件中进行比对。
s2：利用机器学习提取鉴定6个沉香属物种的核苷酸特征
将步骤s1得到的数据集以barcodingwithlogic作为机器学习进行100次-1000次迭代计算，得到鉴定该沉香属植物的核苷酸特征。
进一步地，以barcodingwithlogic作为机器学习方法，是将s1得到的数据集按比例随机分成训练集(80％)和测试集(20％)，进行1000次迭代计算。
s3：6个沉香属物种的鉴定
鉴定6个沉香属物种的特异核苷酸位点，具体标准是：
若第619为碱基为g，则鉴定为土沉香aquilariasinensis；
若第105位碱基为t，则鉴定为云南沉香a.yunanensis；
若第570位碱基为c，则鉴定为毛沉香a.hirta；
若第569位碱基为a，则鉴定为卡明沉香a.cumingiana；
若第622位碱基为t，则鉴定为小果沉香a.microcarpa；
若第634位碱基为a，则鉴定为具喙沉香a.rostrata。
上述核苷酸位点为鉴定土沉香、云南沉香、毛沉香、卡明沉香、小果沉香、具喙沉香的特异位点(species-specificpositions)。第618位碱基g是土沉香区别于另外5个物种的特异碱基，所有土沉香序列在该位点未发生种内变异；第105位碱基t是云南沉香区别于另外5个物种的特异碱基，所有云南沉香序列在该位点未发生变异；第570位碱基c是毛沉香区别于另外5个物种的特异碱基，所有毛沉香序列在该位点未发生变异；第569位碱基a是卡明沉香区别于另外5个物种的特异碱基，所有卡明沉香序列在该位点未发生变异；第621位碱基t是小果沉香区别于另外5个物种的特异碱基，所有小果沉香序列在该位点未发生变异；第634位碱基a是具喙沉香区别于另外5个物种的特异碱基，所有具喙沉香序列在该位点未发生变异。
与现有技术相比，本发明有如下有益效果：
本发明首次将its序列与机器学习相结合的方法用于沉香属植物的鉴定，得到了鉴定6个沉香属植物的特异核苷酸位点，6个沉香属物种分别仅需一个位点即可准确鉴定。该方法通过机器筛选变异位点，可以快速、准确、特异性地从众多位点中筛选出鉴定6个沉香属物种的特异位点，说明its序列与机器学习结合的方法用于鉴定该6个沉香属物种的结果是可靠的。本发明弥补了基于形态学等传统鉴定方法以及基于dna条形码序列的snp分子标记的局限性，填补了将生物学信息与机器学习结合用于鉴定沉香属植物的空白，为沉香物种鉴定、分类和物种检测提供了重要的核苷酸信息，也为沉香的质量把控、基源植物资源保护和贸易提供理论基础和技术支持。
具体实施方式
以下结合说明书和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例16个沉香属植物的鉴定
1、样品dna的提取
(1)待测样品：从不同地区采集多份沉香属植物共26份样品，如表1所示。
表13个沉香属物种样品采集地点
(2)按照下述方法分别对表1的沉香属植物样品进行dna的提取
1)取2g待测样品，将待测样品浸泡在75％乙醇中5min，取出，放置在无菌环境中风干；
2)将风干的材料放置在预冷的研钵中，加液氮研磨至粉末状，转移至50ml离心管中，然后加入5ml65℃预热的3×ctab提取液，65℃水浴2h，期间每隔15-20min轻轻震荡摇匀；所述3×ctab提取液配方为：4％ctab，1.4mol/lnacl，100mmol/ltris-hcl，1％pvpp，25mmol/ledta，2％β-巯基乙醇，ph8.0；体系中的“％”代表体积分数；
3)水浴结束后，12000rpm离心5min，取上清分装在1.5ml离心管中，用等体积氯仿-异戊醇(24:1)，tris饱和酚-氯仿-异戊醇(25:24:1)和氯仿-异戊醇先后各抽提一次，10000rpm离心5min；
4)取上清液至新1.5ml离心管中，加0.8倍体积异丙醇和0.2倍体积3mol/l醋酸钠，-20℃沉淀1h，12000rpm离心10min；
5)弃上清液，用1ml预冷的70％乙醇洗涤沉淀，12000rpm离心5min，重复洗涤2-3次；
6)洗涤结束后，将沉淀自然风干，加100μl无菌水或1×te溶液进行溶解，置于-20℃保存，得到待测样品的dna。
2、its区序列片段的扩增
(1)引物its5和its4的序列如下所示
引物its5(如seqidno.1所示)：5’ggaagtaaaagtcgtaacaagg3’
引物its4(如seqidno.2所示)：5’tcctccgcttattgaataatgc3’
引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
(2)pcr反应体系
10×pcrbuffer(2.5mmol/l，含mgcl2)2μl，dntps(2.5mmol/l)1.6μl，引物its4、its5(10μmol/l)各0.8μl，hifidna聚合酶(5u/μl)0.1μl，加入dna模板2μl，其余体积用无菌水补足。
(3)pcr扩增参数
95℃预变性3min，95℃变性1min，56℃退火50s，72℃延伸50s，共循环30次，最后在72℃延伸10min。
3、pcr产物纯化、链接及转化
采用dna凝胶回收试剂盒(takaraminibestagarosegeldnaextractionkit)对pcr扩增产物进行割胶回收。沉香its序列的pcr扩增产物从1％的琼脂凝胶中割胶纯化。纯化产物连接到pmd18-t-vecter(takara)，连接产物转化到escherichiacolijm109感受态细胞，进行氨苄青霉素选择。
4、its区序列测定
挑取单克隆菌落送至睿博兴科生物技术有限公司进行测序，测序引物与上述pcr引物一致。
5、its区序列分析
(1)选取土沉香aquilariasinensis、云南沉香a.yunnanensis、毛沉香a.hirta、卡明沉香a.cumingiana、小果沉香a.microcarpa和具喙沉香a.rostrata共6种沉香属植物，并在ncbi数据库上查询和下载其its区序列的fasta格式文件，共47条序列，见表2。
表2从genbank下载的沉香属植物its序列
(2)根据测序结果可知，17条土沉香序列存在6个位点的差异，8条云南沉香序列存在3个位点的差异(经过研究验证显示，下述鉴别6个沉香属植物的位点均不存在种内差异)。实验获取的序列已上传至ncbi，genbank登录号为ky817952、ky817960、ky817966、ky817974-ky817978、ky817980、ky817981、ky817983-ky817985、mh594310、mh594312、mh594317、mh594319-mh594328。
(3)将实验获得的its区序列和从genbank下载的its区序列，一起导入mega(版本7.0)软件进行比对，切除引物端后，去除中间存在高变的插入或缺失的序列，得到用于机器学习的数据集。
(4)以barcodingwithlogic作为机器学习方法，将数据集随机分成训练集和测试集，其中训练集占总集合的80％，测试集占总集合的20％，进行1000次迭代计算，获得鉴定沉香属植物的特异核苷酸位点。
6、6个沉香属植物的鉴定
根据机器学习结果可知，训练集和测试集对6个沉香属物种的鉴定成功率均为100％。鉴定6种沉香属植物的特异核苷酸位点，具体标准是：
若第619为碱基为g，则鉴定为土沉香aquilariasinensis；
若第105位碱基为t，则鉴定为云南沉香a.yunanensis；
若第570位碱基为c，则鉴定为毛沉香a.hirta；
若第569位碱基为a，则鉴定为卡明沉香a.cumingiana；
若第622位碱基为t，则鉴定为小果沉香a.microcarpa；
若第634位碱基为a，则鉴定为具喙沉香a.rostrata。
实施例2：土沉香、云南沉香的鉴定试验
1、基因组dna的提取
从不同产地收集多份根据形态分别鉴定为土沉香和云南沉香的样品，如表3所示：
表32个沉香属物种样品采集地点
分别按照下述方法进行鉴定：
步骤1：
取2g待测样品，将待测样品浸泡在75％乙醇中5min，取出，放置在无菌环境中风干；将风干的材料放置在预冷的研钵中，加液氮研磨至粉末状，转移至50ml离心管中，然后加入5ml65℃预热的3×ctab提取液，65℃水浴2h，期间每隔15-20min轻轻震荡摇匀；所述3×ctab提取液配方为：4％ctab，1.4mol/lnacl，100mmol/ltris-hcl，1％pvpp，25mmol/ledta，2％β-巯基乙醇，ph8.0；体系中的“％”代表体积分数。
水浴结束后，12000rpm离心5min，取上清分装在1.5ml离心管中，用等体积氯仿-异戊醇(24:1)，tris饱和酚-氯仿-异戊醇(25:24:1)和氯仿-异戊醇先后各抽提一次，10000rpm离心5min。
取上清液至新1.5ml离心管中，加0.8倍体积异丙醇和0.2倍体积3mol/l醋酸钠，-20℃沉淀1h；12000rpm离心10min，弃上清液，用1ml预冷的70％乙醇洗涤沉淀，12000rpm离心5min，重复洗涤2-3次；洗涤结束后，将沉淀自然风干，加100μl无菌水或1×te溶液进行溶解，置于-20℃保存，得到待测样品的dna。
步骤2：
以步骤1提取的dna为模板，用引物its4和its5进行pcr扩增。
pcr反应体系(20μl)：10×pcrbuffer(2.5mmol/l，含mgcl2)2μl，dntps(2.5mmol/l)1.6μl，引物its4、its5(10μmol/l)各0.8μl，hifidna聚合酶(5u/μl)0.1μl，加入dna模板2μl，其余体积用无菌水补足。
pcr扩增参数：95℃预变性3min，95℃变性1min，56℃退火50s，72℃延伸50s，共循环30次，最后在72℃延伸10min。
采用takara的pcr产物回收试剂盒纯化回收扩增产物并送交测序。
步骤3：
将步骤2获得的和从genbank下载的6个沉香属物种的its序列一起导入mega(版本7.0)软件进行比对，切除引物端后，去除中间存在高度缺失的序列。其中，将步骤2获得的序列作为测试集，将从genbank下载的序列作为训练集，以barcodingwithlogic作为机器学习方法，进行1000次迭代计算，获得鉴定6个沉香属物种的特异核苷酸位点。
根据机器学习结果可知，训练集的鉴定成功率为100％，从训练集中获取的鉴别沉香属植物的核苷酸规则如下：
若第619为碱基为g，则鉴定为土沉香aquilariasinensis；
若第105位碱基为t，则鉴定为云南沉香a.yunanensis；
若第570位碱基为c，则鉴定为毛沉香a.hirta；
若第569位碱基为a，则鉴定为卡明沉香a.cumingiana；
若第622位碱基为t，则鉴定为小果沉香a.microcarpa；
若第634位碱基为a，则鉴定为具喙沉香a.rostrata。
根据机器学习结果可知，测试集的鉴定成功率为100％，说明训练集生成的核苷酸规则适用于测试集，2个沉香属待测物种得到了准确的鉴定。
本发明上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的范围内。
1.一种基于its序列和机器学习的沉香属物种鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
s1.数据的获取和数据集的建立
获取6个沉香属物种的its区序列，并进行比对，切除引物端后，去除存在高度缺失的序列，得到用于机器学习的数据集；
s2.利用机器学习提取鉴定6个沉香属物种的核苷酸特征
以barcodingwithlogic作为机器学习方法，将s1得到的数据集进行100次-1000次迭代计算，得到鉴定6个沉香属物种的核苷酸特征；
s3.6个沉香属物种的鉴定
鉴定6个沉香属物种的特异核苷酸位点，具体标准是：
若第619为碱基为g，则鉴定为土沉香aquilariasinensis；
若第105位碱基为t，则鉴定为云南沉香a.yunanensis；
若第570位碱基为c，则鉴定为毛沉香a.hirta；
若第569位碱基为a，则鉴定为卡明沉香a.cumingiana；
若第622位碱基为t，则鉴定为小果沉香a.microcarpa；
若第634位碱基为a，则鉴定为具喙沉香a.rostrata。
2.根据权利要求1所述的基于its序列和机器学习的6个沉香属物种鉴定方法，其特征在于，在步骤s1中，its区序列一部分来自于实验获取，物种是土沉香、云南沉香和毛沉香，通过分子生物学实验及测序获得该3个沉香属物种的its区序列，具体包括如下步骤：
s11.采用改良ctab法，对3个待测物种样品的总dna进行提取；
s12.以3个待测物种样品的总dna为模板，利用引物its5和its4进行pcr扩增；
s13.扩增产物纯化后连接到载体pmd18-t，连接产物转化到e.colijm109感受态细胞，进行氨苄青霉素选择，对阳性菌落进行测序，测序引物与pcr扩增引物一致，得到its区序列。
3.根据权利要求1所述的基于its序列和机器学习的沉香属物种鉴定方法，其特征在于，在步骤s1中，its区序列一部分来自于genbank，物种是土沉香、云南沉香、毛沉香、卡明沉香、小果沉香、具喙沉香。
4.根据权利要求3所述的基于its序列和机器学习的沉香属物种鉴定方法，其特征在于，在步骤s1中，将实验获得的与从genbank下载的its区序列合为一个文件并导入mega7.0软件进行比对。
5.根据权利要求2所述的基于its序列和机器学习的沉香属物种鉴定方法，其特征在于，在步骤s11中，取新鲜采集的瑞香科沉香属植物的叶片，待测叶片先经过预处理后才进行dna的提取，所述预处理是将叶片浸泡于75％乙醇溶液中5min，取出后放置于无菌环境中风干，将风干的叶片放置在已预冷的研钵中，加液氮进行研磨至粉末，该粉末即为待测样品。
6.根据权利要求5所述的基于its序列和机器学习的沉香属物种鉴定方法，其特征在于，在步骤s12中，所述引物its4的核苷酸序列如seqidno:1所示，its5的核苷酸序列如seqidno:2所示，
seqno.1:tcctccgcttattgatatgc20
seqno.2:ggaagtaaaagtcgtaacaagg22。
7.根据权利要求6所述的基于its序列和机器学习的沉香属物种鉴定方法，其特征在于，在步骤s12中，pcr扩增反应体系总体积为20μl，该反应体系包含2.5mmol/l10×pcrbuffer(含mgcl2)2μl，2.5mmol/ldntp1.6μl，10μmol/l引物its40.8μl，10μmol/l引物its50.8μl，5u/μlhifidna聚合酶0.1μl，加入dna模板50ng，其余体积用无菌水补足。
8.根据权利要求7所述的基于its序列和机器学习的沉香属物种鉴定方法，其特征在于，在步骤s12中，pcr扩增参数为：95℃预变性3min，95℃变性1min，56℃退火50s，72℃延伸50s，共循环30次，最后在72℃延伸10min。
9.根据权利要求1所述的基于its序列和机器学习的个沉香属物种鉴定方法，其特征在于，在步骤s2中，以barcodingwithlogic作为机器学习方法，将s1得到的数据集按比例随机分成训练集和测试集，其中训练集占总集合的80％，测试集占总集合的20％，进行1000次迭代计算。
10.根据权利要求1所述的基于its序列和机器学习的沉香属物种鉴定方法，其特征在于，在步骤s3中，鉴别土沉香、云南沉香、毛沉香、卡明沉香、小果沉香、具喙沉香的核苷酸特征为鉴别这6个沉香属物种的物种特异位点，各沉香属物种在其特异位点未发生变异。
技术总结