本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种芝麻ssr分子标记的扩增方法及其应用。
背景技术：
ssr(simplesequencerepeats)标记，也称为微卫星dna(microsatellitedna)标记，是近年来植物研究中应用最为广泛的常用分子标记之一，该标记因具有稳定性高、信息量丰富及易于操作等优点，已经在遗传多样性、指纹图谱鉴定、关联分析、遗传图谱构建及qtl定位等方面得到广泛应用。传统的ssr分子标记技术，包括dna提取、pcr扩增和凝胶电泳检测等步骤。dna提取过程中需要样品的液氮研磨、水浴、离心、吸取上清液、沉淀、漂洗、干燥、溶解等多个步骤，操作繁琐，且需要大量的化学试剂和相关的仪器设备，一定程度上影响了大规模样品的实验进程。此外，芝麻含有大量的多聚糖、油脂类等黏性生物物质尤其是成株期叶片的dna提取过程中，黏性类物质严重影响了dna提取过程中样品研磨、吸取上清液、沉淀、晾干、溶解等操作，常出现提取失败或dna质量不佳的状况。
随着分子标记检测、分子标记辅助选择育种研究的不断深入，大规模开展ssr分子标记操作的需求也将越来越大。因此，急需建立一种芝麻ssr分子标记的简易扩增方法。
技术实现要素：
因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中dna提取过程中操作繁琐、成本高和dna质量不佳的缺陷，从而提供一种芝麻ssr分子标记的扩增方法及其应用。
一种芝麻ssr分子标记的扩增方法，包括：提取芝麻的dna；以所述芝麻的dna为模板，对ssr分子标记进行pcr扩增；
所述芝麻的dna提取方法为：采取0.3μg芝麻新鲜叶片置于40μl的0.5mol/l的naoh溶液中静置10-15min，然后向其中加入100mmol/lph8.0的tris-hcl溶液400μl，混匀，所得溶液即为所述芝麻的dna溶液；
所述芝麻叶片选自芽期的子叶、幼苗期的全展叶片、苗期的四对真叶期叶片或成株期的上部幼嫩叶片；
所述采取的芝麻新鲜叶片的直径为0.6-0.8mm。
所述pcr扩增的反应体系为：模板2μl，10×taqbufferwith(nh4)2so41μl，25mmolmgcl20.8μl，10mmoldntp0.2μl，50ng/μl正向引物0.3μl，50ng/μl反向引物0.3μl，5u/μltaqdna聚合酶0.2μl，ddh2o补充至10μl。
所述pcr扩增的程序为：94-95℃变性3min；10个循环：94℃变性1min，60℃-55℃退火30s且每个循环递减0.5℃，72℃延伸45s；30个循环：94℃变性1min，55℃退火30s，72℃延伸45s；最后72℃10min，4℃保存。
聚丙烯酰胺凝胶电泳采用150-180v恒压电泳1.0-1.5h；
所述聚丙烯酰胺凝胶的质量百分比浓度为6％；
所述电泳的缓冲液为1×tbe溶液。
所述芝麻ssr分子标记的扩增方法在芝麻的杂交种鉴定或品种纯度鉴定中的应用。
一种利用ssr分子标记鉴定芝麻杂交种的方法，包括如下步骤：
采用所述简易扩增方法对芝麻f1杂交种及其亲本进行ssr分子标记的扩增；
在f1杂交种的扩增产物中，若同时具有父本和母本特异性条带，则为真杂交种，反之，则为假杂交种。
一种利用ssr分子标记鉴定芝麻品种纯度的方法，包括如下步骤：
采用所述扩增方法对待测芝麻进行ssr分子标记的扩增；
若某一待测芝麻个体中存在至少1个不同于其他待测个体的ssr分子标记位点，则判定所述待测芝麻个体为杂株。
本发明技术方案，具有如下优点：
1、本发明提供的芝麻ssr分子标记的扩增和检测方法，包括：获取芝麻的dna；以所述芝麻的dna为模板，对ssr分子标记进行pcr扩增；所述芝麻的dna获取方法为：采取芝麻新鲜叶片0.3μg置于40μl0.5mol/l的naoh溶液中静置10-15min，然后向其中加入100mmol/lph8.0的tris-hcl溶液400μl，混匀，获得的溶液即为所述芝麻的dna溶液；本发明dna获取方法克服了芝麻中黏性物质对dna提取过程的影响，可以满足后续ssr分子标记的扩增。本发明dna模板的获取步骤操作简便，采集极少量组织样品后加入相关试剂即可，单个样品只需要10-15分钟，相对传统方法需要研磨、水浴、离心、沉淀、漂洗、干燥、溶解等过程耗时一天以上，极大的提高了效率；所需化学药品少，只需要naoh和tris-hcl，较传统的ctab法减少了ctab、氯仿、异戊醇、乙醇、丙酮、edtad、液氮等化学试剂的使用，且基本无毒无害；无需恒温水浴锅、高速离心机、低温冰箱、通风柜等专业实验设备，成本低；选择叶片作为样品材料，且采集量十分微小，对所检测植株基本没有伤害，不会影响分子检测后植株的正常生长。
2、本发明pcr扩增程序为：94-95℃变性3min；10个循环：94℃变性1min，60℃-55℃退火30s且每个循环递减0.5℃，72℃延伸45s；30个循环：94℃变性1min，55℃退火30s，72℃延伸45s；最后72℃10min，4℃保存，可以适用于较低含量dna模板的pcr扩增。选择增加10个循环：94℃变性1min，60℃-55℃退火30s且每个循环递减0.5℃，72℃延伸45s，可以更好地适应不同的引物，保证ssr分子标记扩增的稳定性。
3、本发明通过简化组织样品的采集，快速获得ssr分子标记扩增的dna模板，优化pcr体系和pcr扩增程序，并建立配套的凝胶检测技术，进而提供一种适合芝麻的ssr分子标记的扩增和检测方法，该方法操作简单方便、成本低、准确度高，在芝麻分子标记鉴定、分子标记辅助选择育种等领域具有很强的实用性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式中的技术方案，下面将对具体实施方式描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1和对比例1的扩增结果；其中，a为缅甸黑芝麻，b为芝麻品系z11，c为缅甸黑芝麻与z11的杂交植株f1；1为实施例1的扩增结果，2为对比例1的扩增结果；(1)、(2)、(3)表示3对不同引物；
图2为本发明实施例2的扩增结果；其中，a为利用子叶全展期子叶取样进行的扩增结果，b为利用四对真叶期幼嫩叶片取样进行的扩增结果，m为maker；1、2和3分别为3个单株，即3次重复；(1)、(2)和(3)表示3对不同引物；
图3为本发明实施例3的扩增结果；其中，1～14为芝麻品系z11中随机14个植株编号，(1)～(5)表示5对不同引物。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
实施例1
本实施例的所用材料为处于四对真叶期的缅甸黑芝麻、品系z11、缅甸黑芝麻与品系z11杂交的f1。ssr分子标记的扩增和检测步骤如下：
(1)获取芝麻的dna
利用200μl黄色枪头对四对真叶期的幼嫩叶片进行打孔取样，样品直径约0.6-0.8mm，质量约0.3μg，置于1.5ml离心管中，缅甸黑芝麻、品系z11和f1植株上的样品编号分别记为a1、b1和c1。分别在编号为a1、b1和c1的离心管中加入0.5mol/l的naoh溶液40μl，静置10min；然后分别向编号为a1、b1和c1的离心管中加入100mmol/l的tris-hcl(ph8.0)溶液400μl，混匀，所获溶液即为芝麻的dna溶液，4℃保存，备用。
(2)pcr扩增
以上述dna为模板，进行ssr分子标记的扩增。
pcr反应体系(10μl)为：dna模板2μl，10×taqbufferwith(nh4)2so41μl，25mmolmgcl20.8μl，10mmoldntp0.2μl，50ng/μl正向引物0.3μl，50ng/μl反向引物0.3μl，5u/μltaqdna聚合酶0.2μl，ddh2o5.2μl。
利用pcr仪进行ssr分子标记的pcr扩增，扩增程序为：94℃变性3min；10个循环：94℃变性1min，60℃-55℃退火30s且每个循环递减0.5℃，72℃延伸45s；30个循环：94℃变性1min，55℃退火30s，72℃延伸45s；最后72℃10min，4℃保存。
所用引物为经过大量筛选的3对ssr引物，如表1。
表1实施例1中使用的3对代表性ssr引物序列
(3)电泳检测
pcr扩增产物用质量百分比浓度为6％的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，电泳缓冲液为1×tbe溶液，电泳采用150v恒压电泳1.5h，电泳结束后，用10％(体积百分比)醋酸溶液固定凝胶10min后，0.2％(质量百分比)的硝酸银水溶液渗透银染20min；蒸馏水漂洗两次，每次2分钟；然后在1.5％(质量百分比)氢氧化钠和0.4％(体积百分比)甲醛混合溶液中显色，最后清水漂洗凝胶，在凝胶成像系统中照相并保存数据。其电泳结果如图1所示。
对比例1
采用传统ssr分子标记操作方法对处于四对真叶期的缅甸黑芝麻、品系z11、缅甸黑芝麻与品系z11杂交的f1进行ssr分子标记的扩增和检测，步骤如下：
(1)ctab法提取芝麻的dna
在芝麻四对真叶期分别采集缅甸黑芝麻、品系z11和f1植株上的幼嫩叶片2-3片，质量大约2g，采集样品编号分别记为a2、b2和c2；利用液氮进行样品研磨成粉后转移至2.0ml离心管中，并相对应进行编号；加入800μl的2×ctab提取液，65℃水浴45min后，取出冷却至室温(25℃)；加入氯仿/异戊醇(v/v＝24/1)的混合液800μl，缓慢摇晃5min；于12000rpm离心15min，取上清；加入-20℃预冷的异丙醇0.6μl，混匀，静置15min；3000rpm离心3min，去除上清液，留下絮状沉淀，加入70％乙醇溶液1ml漂洗15min；去掉上层溶液，留下絮状沉淀，晾干；加30μlte缓冲液溶解后，-20℃冰箱保存备用。
其中，2×ctab提取液的制备方法如下：
称取十六烷基三甲基溴化铵(ctab)4g，nacl16.364g，1mtris-hcl20ml(ph为8.0)，0.5medta(ph为8.0)8ml，先用70ml无菌超纯水溶解,再定容至200ml，灭菌，冷却后加入2-巯基乙醇(分析纯)200μl，摇匀即得。
te缓冲液的制备方法如下：
1)1mtris-hcl(ph8.0)的配制：称取三(羟甲基)氨基甲烷6.06g，加超纯水40ml溶解，滴加浓hcl调ph至8.0，定容至50ml；
2)0.5medta(ph8.0)的配制：称取乙二胺四乙酸二钠9.306g，加超纯水35ml，剧烈搅拌，用naoh调ph至8.0，定容至50ml；
3)te缓冲液的配制：取上述1mtris-hcl(ph8.0)溶液1ml，0.5medta(ph8.0)溶液0.2ml，超纯水定容至100ml，即得。
(2)pcr扩增
以上述dna为模板，进行ssr分子标记的扩增。
pcr反应体系(15μl)为：50ng/μl模板dna2μl、50ng/μl正向引物1μl、50ng/μl反向引物1μl、10×taqbuffer1.5μl、10mmoldntps0.3μl、25mmolmgcl21.2μl和5u/μltaqdna聚合酶0.2μl；所用引物为表1中的3对ssr引物。
利用pcr仪进行ssr分子标记的pcr扩增，扩增程序为：94℃变性3min；40个循环：94℃变性60s，57℃退火30s，72℃延伸45s；然后72℃延伸10min，4℃保存。
(3)电泳检测
pcr扩增产物用质量百分比浓度为6％的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，电泳缓冲液为1×tbe溶液，电泳采用150v恒压电泳1.5h，电泳结束后，用10％(体积百分比)醋酸溶液固定凝胶10min后，0.2％(质量百分比)的硝酸银水溶液渗透银染20min；蒸馏水漂洗两次，每次2分钟；然后在1.5％(质量百分比)氢氧化钠和0.4％(体积百分比)甲醛混合溶液中显色，最后清水漂洗凝胶，在凝胶成像系统中照相并保存数据。其电泳结果如图1所示。
图1中，a为缅甸黑芝麻，b为芝麻品系z11，c为缅甸黑芝麻与z11的杂交植株f1；1为实施例1的扩增结果，2为对比例1的扩增结果；(1)、(2)(3)表示3对不同引物。由图1结果可知，3对引物利用本发明方法的扩增结果和传统方法的扩增结果均表现为一致，可见本发明方法与传统方法的ssr分子标记扩增结果一样准确。
实施例1中ssr分子标记的扩增方法可用于芝麻杂交种的鉴定，采用实施例1的扩增方法对缅甸黑芝麻、品系z11、缅甸黑芝麻与品系z11杂交的f1进行ssr分子标记的扩增和；在f1杂交种的扩增产物中，若同时具有父本和母本特异性条带，则为真杂交种，反之，则为假杂交种。由图1可知，在f1植株中均出现双亲的dna条带，表明f1为真实杂交种。
实施例2
本实施例所用材料为芝麻品系z11，于子叶全展期和四对真叶期进行取样。ssr分子标记的扩增和检测步骤如下：
(1)获取芝麻的dna
利用200μl黄色枪头对子叶全展期子叶和四对真叶期的幼嫩叶片进行打孔取样，样品直径约0.6-0.8mm，质量约0.3μg，置于1.5ml离心管中，每个材料取样3次，视为3次重复，其中子叶全展期子叶取样编号为a1、a2和a3，四对真叶期幼嫩叶片取样编号为b1、b2和b3。分别在编号为a1、b1、c1、b1、b2和b3的离心管中加入0.5mol/l的naoh溶液40μl，静置10min；然后分别向上述离心管中加入100mmol/l的tris-hcl(ph8.0)溶液400μl，混匀，所得溶液即为芝麻的dna溶液，4℃保存，备用。
(2)pcr扩增
以上述dna为模板，进行ssr分子标记的扩增。
pcr反应体系(10μl)为：dna模板2μl，10×taqbufferwith(nh4)2so41μl，25mmolmgcl20.8μl，10mmoldntp0.2μl，50ng/μl正向引物0.3μl，50ng/μl反向引物0.3μl，5u/μltaqdna聚合酶0.2μl，ddh2o5.2μl。
利用pcr仪进行ssr分子标记的pcr扩增，扩增程序为：94℃变性3min；10个循环：94℃变性1min，60℃-55℃退火30s且每个循环递减0.5℃，72℃延伸45s；30个循环：94℃变性1min，55℃退火30s，72℃延伸45s；最后72℃10min，4℃保存。
所用引物为经过大量筛选的3对ssr引物，如表2。
表2实施例2中使用的3对代表性ssr引物
(3)电泳检测
pcr扩增产物用质量百分比浓度为6％的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，电泳缓冲液为1×tbe溶液，电泳采用180v恒压电泳1.0h，电泳结束后，用10％(体积百分比)醋酸溶液固定凝胶10min后，0.2％(质量百分比)的硝酸银水溶液渗透银染20min；蒸馏水漂洗两次，每次2分钟；然后在1.5％(质量百分比)氢氧化钠和0.4％(体积百分比)甲醛混合溶液中显色，最后清水漂洗凝胶，在凝胶成像系统中照相并保存数据。其电泳结果如图2所示。
图2中，a为利用子叶全展期幼嫩叶片(芽期子叶)取样进行的扩增结果，b为利用四对真叶期幼嫩叶片(苗期叶片)取样进行的扩增结果，m为maker；1、2和3分别为3个单株，即3次重复；(1)、(2)和(3)表示3对不同引物。由图2结果可知，3对引物的扩增结果完全一致，可见本发明方法的样品采集适用于芝麻芽期子叶和苗期幼嫩叶片。
实施例3
本实施例所用材料为混杂了其他芝麻品种的芝麻品系z11，于子叶全展期对群体进行取样。利用ssr分子标记鉴定品种纯度，具体操作步骤如下：
(1)提取芝麻的dna
利用200μl黄色枪头对子叶全展期子叶进行打孔取样，样品直径约0.6-0.8mm，质量约0.3μg，置于1.5ml离心管中，随机采集14个单株子叶样品，编号为1、2……13和14。分别在放入样品的14个离心管中加入0.5mol/l的naoh溶液40μl，静置10min；然后分别向14个离心管中加入100mmol/l的tris-hcl(ph8.0)溶液400μl，混匀，所得溶液即为芝麻的dna溶液，4℃保存，备用。
(2)pcr扩增
以上述dna为模板，进行ssr分子标记的扩增。
pcr反应体系(10μl)为：dna模板2μl，10×taqbufferwith(nh4)2so41μl，25mmolmgcl20.8μl，10mmoldntp0.2μl，50ng/μl正向引物0.3μl，50ng/μl反向引物0.3μl，5u/μltaqdna聚合酶0.2μl，ddh2o5.2μl。
利用pcr仪进行ssr分子标记的pcr扩增，扩增程序为：95℃变性3min；10个循环：94℃变性1min，60℃-55℃退火30s且每个循环递减0.5℃，72℃延伸45s；30个循环：94℃变性1min，55℃退火30s，72℃延伸45s；最后72℃10min，4℃保存。
所用引物为经过大量筛选的5对ssr引物，如表3。
表3实施例3中使用的5对代表性ssr引物
(3)电泳检测
pcr扩增产物用质量百分比浓度为6％的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，电泳缓冲液为1×tbe溶液，电泳采用150v恒压电泳1.5h，电泳结束后，用10％(体积百分比)醋酸溶液固定凝胶10min后，0.2％(质量百分比)的硝酸银水溶液渗透银染20min；蒸馏水漂洗两次，每次2分钟；然后在1.5％(质量百分比)氢氧化钠和0.4％(体积百分比)甲醛混合溶液中显色，最后清水漂洗凝胶，在凝胶成像系统中照相并保存数据。其电泳结果如图3所示。
图3中，1～14为芝麻品系z11中随机14个植株编号，(1)～(5)表示5对不同引物。由图3结果可知，5对引物的扩增结果均表明编号为2的植株为混杂植株，非品系z11植株，可见本发明方法适用于芝麻品种纯度的鉴定。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
1.一种芝麻ssr分子标记的扩增方法，其特征在于，包括：获取芝麻的dna；以所述芝麻的dna为模板，对ssr分子标记进行pcr扩增；
所述芝麻的dna获取方法为：取0.3μg新鲜叶片置于40μl的0.5mol/lnaoh溶液中静置10-15min，然后向其中加入100mmol/lph8.0的tris-hcl溶液400μl，混匀，所得溶液即为所述芝麻的dna溶液。
2.根据权利要求1所述的扩增方法，其特征在于，所述芝麻新鲜叶片选自芽期的子叶、幼苗期的全展叶片、苗期的四对真叶期叶片或成株期的上部幼嫩叶片；
所述取样的芝麻叶片直径为0.6-0.8mm。
3.根据权利要求1或2所述的扩增方法，其特征在于，所述pcr扩增的反应体系为：模板2μl，10×taqbufferwith(nh4)2so41μl，25mmolmgcl20.8μl，10mmoldntp0.2μl，50ng/μl正向引物0.3μl，50ng/μl反向引物0.3μl，5u/μltaqdna聚合酶0.2μl，ddh2o补充至10μl。
4.根据权利要求1-3任一项所述的扩增方法，其特征在于，所述pcr扩增的程序为：94-95℃变性3min；10个循环：94℃变性1min，60℃-55℃退火30s且每个循环递减0.5℃，72℃延伸45s；30个循环：94℃变性1min，55℃退火30s，72℃延伸45s；最后72℃10min，4℃保存。
5.根据权利要求1-4任一项所述的扩增方法，其特征在于，还包括检测pcr扩增产物步骤中，聚丙烯酰胺凝胶电泳采用150-180v恒压电泳1.0-1.5h；
所述聚丙烯酰胺凝胶的质量百分比浓度为6％；
所述电泳的缓冲液为1×tbe溶液。
6.权利要求1-5任一项所述芝麻ssr分子标记的扩增方法在芝麻的杂交种鉴定或品种纯度鉴定中的应用。
7.一种利用ssr分子标记鉴定芝麻杂交种的方法，其特征在于，包括如下步骤：
采用权利要求1-5任一项所述扩增方法对芝麻f1杂交种及其亲本进行ssr分子标记的扩增；
在f1杂交种的扩增产物中，若同时具有父本和母本特异性条带，则为真杂交种，反之，则为假杂交种。
8.一种利用ssr分子标记鉴定芝麻品种纯度的方法，其特征在于，包括如下步骤：
采用权利要求1-5任一项所述扩增方法对待测芝麻进行ssr分子标记的扩增；
若某一待测芝麻个体中存在至少1个不同于其他待测个体的ssr分子标记位点，则判定所述待测芝麻个体为杂株。
技术总结