本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及一种鉴定黄瓜杂交种纯度的方法及其使用的snp引物组合；杂交种指杂交一代种，可能有亲本混杂。
背景技术：
：黄瓜是我国重要的蔬菜作物之一，可四季栽培，周年供应，栽培面积已达139.6万公顷，占全国蔬菜栽培面积的6.2％。随着育种进程的加快，黄瓜新品种数量也在不断增加。由于我国黄瓜育种企业较小且分散，黄瓜种子的质量管理未能有效跟进，存在很多假冒伪劣、纯度不合格的种子，因此导致的种子质量事故时有发生。2017年4月，《非主要农作物品种登记办法》实施以来，全国申请登记的黄瓜品种已达1607个，且93％以上为杂交一代种(以下简称杂交种)。杂交种进入市场前，均需要进行纯度鉴定。依据农作物种子检验规程(gb/t3543.1-3543.7-1995)的规定，黄瓜杂交种的纯度不低于98％。与传统的田间纯度鉴定相比，基于dna的分子检测技术成本低、省时高效。因此，筛选获得基于dna检测技术的鉴定黄瓜杂交种纯度的分子标记组合显得尤为重要。近年来，第三代分子标记snp，以其数量多、分布广、遗传稳定等优点受到广泛重视。随着高通量测序技术的发展和测序成本的不断降低，大规模黄瓜重测序成为可能。基于分析黄瓜变异组信息，可以挖掘更加稳定高效的snp位点。采用等位基因竞争性特异pcr法，开发其特异性引物，最终获得样本在snp位点的基因型。目前，我国黄瓜杂交种纯度鉴定的dna分子检测主要采用ssr分子标记法，但是ssr引物的研发没有参考黄瓜基因组变异组信息，存在不真实变异情况；ssr引物筛选所用的品种数量较少，且不能代表我国当前市场的销售品种；另外受限于ssr检测方式极易导致不真实、假阳性、假阴性结果；不能适应自动化、高通量、大规模的要求。与ssr标记相比，snp具有多个方面的优势：变异清晰稳定容易检测，真实性准确性高；每个作物均有数以百万计snp可供选择；适宜于高通量、低成本、自动化快速检测，可减少人为误差；snp分型无需对照品种，以准确的碱基呈现结果。技术实现要素：本发明的目的是鉴定黄瓜杂交种纯度。本发明首先保护snp位点组合，可包括黄瓜基因组的8个snp位点；所述8个snp位点如下：hgsnp01位点为4号染色体上的第16975775位核苷酸；hgsnp02位点为5号染色体上的第9582207位核苷酸；hgsnp03位点为1号染色体上的第17508118位核苷酸；hgsnp04位点为1号染色体上的第1976800位核苷酸；hgsnp05位点为5号染色体上的第4054461位核苷酸；hgsnp06位点为6号染色体上的第20929474位核苷酸；hgsnp07位点为3号染色体上的第8333363位核苷酸；hgsnp08位点为5号染色体上的第2133319位核苷酸。所述snp位点组合具体可由上述8个snp位点组成。本发明还保护snp引物组合，可包括用于扩增所述cusnp01的引物组1、用于扩增所述cusnp02的引物组2、用于扩增所述cusnp03的引物组3、用于扩增所述cusnp04的引物组4、用于扩增所述cusnp05的引物组5、用于扩增所述cusnp06的引物组6、用于扩增所述cusnp07的引物组7、用于扩增所述cusnp08的引物组8。所述snp引物组合中，所述引物组1由seqidno：1所示的正向引物1f1、seqidno：2所示的正向引物1f2和seqidno：3所示的反向引物1r组成。所述引物组2由seqidno：4所示的正向引物2f1、seqidno：5所示的正向引物2f2和seqidno：6所示的反向引物2r组成。所述引物组3由seqidno：7所示的正向引物3f1、seqidno：8所示的正向引物3f2和seqidno：9所示的反向引物3r组成。所述引物组4由seqidno：10所示的正向引物4f1、seqidno：11所示的正向引物4f2和seqidno：12所示的反向引物4r组成。所述引物组5由seqidno：13所示的正向引物5f1、seqidno：14所示的正向引物5f2和seqidno：15所示的反向引物5r组成。所述引物组6由seqidno：16所示的正向引物6f1、seqidno：17所示的正向引物6f2和seqidno：18所示的反向引物6r组成。所述引物组7由seqidno：19所示的正向引物7f1、seqidno：20所示的正向引物7f2和seqidno：21所示的反向引物7r组成。所述引物组8由seqidno：22所示的正向引物8f1、seqidno：23所示的正向引物8f2和seqidno：24所示的反向引物8r组成。所述snp引物组合中，所述引物组1由seqidno：1自5’末端起第22至51位所示的正向引物1f1、seqidno：2自5’末端起第22至52位所示的正向引物1f2和seqidno：3所示的反向引物1r组成。所述引物组2由seqidno：4自5’末端起第22至47位所示的正向引物2f1、seqidno：5自5’末端起第22至46位所示的正向引物2f2和seqidno：6所示的反向引物2r组成。所述引物组3由seqidno：7自5’末端起第22至52位所示的正向引物3f1、seqidno：8自5’末端起第22至51位所示的正向引物3f2和seqidno：9所示的反向引物3r组成。所述引物组4由seqidno：10自5’末端起第22至46位所示的正向引物4f1、seqidno：11自5’末端起第22至46位所示的正向引物4f2和seqidno：12所示的反向引物4r组成。所述引物组5由seqidno：13自5’末端起第22至48位所示的正向引物5f1、seqidno：14自5’末端起第22至47位所示的正向引物5f2和seqidno：15所示的反向引物5r组成。所述引物组6由seqidno：16自5’末端起第22至49位所示的正向引物6f1、seqidno：17自5’末端起第22至48位所示的正向引物6f2和seqidno：18所示的反向引物6r组成。所述引物组7由seqidno：19自5’末端起第22至50位所示的正向引物7f1、seqidno：20自5’末端起第22至48位所示的正向引物7f2和seqidno：21所示的反向引物7r组成。所述引物组8由seqidno：22自5’末端起第22至48位所示的正向引物8f1、seqidno：23自5’末端起第22至49位所示的正向引物8f2和seqidno：24所示的反向引物8r组成。上述任一所述引物组中，名称中含有“f1”的引物、名称中含有“f2”的引物和名称中含有“r”的引物的摩尔比具体可为2:2:5。上述任一所述snp引物组合具体可由所述引物组1、所述引物组2、所述引物组3、所述引物组4、所述引物组5、所述引物组6、所述引物组7和所述引物组8组成。上文中，序列表中序列1自5′末端起第1至21位所示的核苷酸序列为荧光标签序列(即fam荧光标签序列)，荧光信号具体为蓝色。序列表中序列2自5′末端起第1至21位所示的核苷酸序列也为荧光标签序列(即hex荧光标签序列)，荧光信号具体为红色。含有上述任一所述snp引物组合的试剂盒也属于本发明的保护范围。所述试剂盒的用途为鉴定黄瓜杂交种纯度。所述试剂盒的制备方法也属于本发明的保护范围。所述试剂盒的制备方法包括将上述任一所述引物组中的各条引物分别单独包装的步骤。本发明还保护上述任一所述snp位点组合或上述任一所述snp引物组合的应用，可为x1)或x2)：x1)制备用于鉴定黄瓜杂交种纯度的试剂盒；x2)鉴定黄瓜杂交种纯度。本发明还保护鉴定待测黄瓜杂交种纯度的方法。本发明所保护的鉴定待测黄瓜杂交种纯度的方法，具体可为方法一，可包括如下步骤：(a1)获得n株待测黄瓜杂交种的基因组dna；n为大于95的自然数；(a2)分别以步骤(a1)获得的8-12株(如8-10株、10-12株、8株、10株或12株)待测黄瓜杂交种的基因组dna为模板，分别采用所述snp引物组合中8个引物组(各个引物均含有荧光标签序列)进行pcr扩增，得到相应的pcr扩增产物；(a3)完成步骤(a2)后，采用仪器检测各个pcr扩增产物的荧光信号，统计8个引物组显示绿色荧光信号的株数；显示绿色荧光株数最多的引物组即为目的引物组；(a4)分别以步骤(a1)获得的n株待测黄瓜杂交种的基因组dna为模板，分别采用目的引物组进行pcr扩增，得到相应的pcr扩增产物；(a5)完成步骤(a4)后，采用仪器检测各个pcr扩增产物的荧光信号，根据荧光信号的颜色获得待测黄瓜杂交种的纯度。上述方法一中，所述“根据荧光信号的颜色获得待测黄瓜杂交种的纯度”的方法可为：统计各个目的引物组显示绿色荧光的株数和无荧光的株数，分别计算纯度，之后求平均值；无荧光的株数＝n-显示绿色荧光的株数-显示红色荧光的株数-显示蓝色荧光的株数；纯度＝目的引物组显示绿色荧光的株数/(n-目的引物组无荧光的株数)×100％。上述方法一中，所述进行pcr扩增的反应程序具体可为：94℃预变性，15min；94℃变性20s，61℃-55℃(选用touchdown程序，每循环降低0.6℃)，1min，扩增10个循环；94℃变性20s，55℃复性&延伸1min，继续扩增26个循环。若pcr扩增结束后荧光信号弱，影响数据分析，可以加循环(94℃变性20s，55℃复性及延伸1min，5个循环)，直至结果满意为止。本发明所保护的鉴定待测黄瓜杂交种纯度的方法，具体可为方法二，可包括如下步骤：(b1)获得n株待测黄瓜杂交种的基因组dna；n为大于95的自然数；(b2)分别以步骤(1)获得的8-12株(如8-10株、10-12株、8株、10株或12株)待测黄瓜杂交种的基因组dna为模板，分别采用上述任一所述snp引物组合中8个引物组进行pcr扩增，得到相应的pcr扩增产物；(b3)取步骤(b2)得到的各个pcr扩增产物，测序；根据测序结果，获得基于8个snp位点的基因型为杂合型的株数，株数最多的引物组即为目的引物组；(b4)分别以步骤(b1)获得的n株待测黄瓜杂交种的基因组dna为模板，分别采用目的引物组进行pcr扩增，得到相应的pcr扩增产物；(b5)取步骤(b4)得到的各个pcr扩增产物，测序；根据测序结果获得待测黄瓜杂交种的纯度。上述方法二中，snp引物组合中8个引物组的引物可以含有荧光标签序列，也可以不含有荧光标签序列。上述方法二中，所述“根据测序结果获得待测黄瓜杂交种的纯度”的方法可为：统计各个目的引物组基于snp位点的基因型为杂合型的株数和没有获得pcr扩增产物的株数，分别计算纯度，之后求平均值；纯度＝目的引物组基于snp位点的基因型为杂合型的株数/(n-目的引物组没有获得pcr扩增产物的株数)×100％。上述任一所述的方法中，所述待测黄瓜杂交种可为mc2065、碧玉、博美5032、绿衣天使、美雌09、南雌1号、南雌2号、宁丰09、优加全雌09、83-ms702、本地王黄瓜、春秋王3号、春喜f1、翠冠亮星、戴安娜、德瑞特723、德瑞特727、德瑞特7876、德瑞特黄瓜、东农804、花青大吊瓜、金胚98f1、金胚98-1f1、金胚99-1f1、金胚99-2f1、津优108号、津优36号、京研迷你1号、京研迷你3号、京研迷你5号、京研迷你9号、京研秋美、京研夏美、绿翠、绿翠宝、绿精灵2号、绿精灵3号、绿精灵5号、玛莎黄瓜腌渍型、南雌3号、全能春秋f1(短重)、宁运3号、奇剑2号、强旱节结、瑞光二号、新津春四号、中农19号、中农50号、中农9号、中研17f1、壮瓜、128一代杂种、13ac230、amata765、vlaspik、白马王子、北京204、北京白玉三、碧绿节成、碧玉2号、博美6913、博美8号、超越黄瓜f1、川翠3号、春华1号、春王9801、翠美水果黄瓜、戴多星(deltastar)、德瑞特、德瑞特15-10、德瑞特4号、德瑞特d19、德瑞特黄瓜gz1601、德瑞特黄瓜l14-2、德瑞特黄瓜l14-5、鼎好油亮重茬王、东农806、冬丽、谷雨美利新星、海诺一号、吉杂九号、吉杂迷你、宝杂2号、博美10号、德瑞特79、金胚99-3f1、津春3号、津春三号、津冬科润99、津旺615-4、津研四号、津优1号、津优303号、津优308、津优315号、津优35号、津优48号、津优一号、津正a207、京ak18、京白玉超白叶三、京研107、京研春美、京研迷你2号、京研优胜、精品白叶三、军科十八号、龙泉王-龙泉绿冠、鲁黄瓜三号、绿宝珠8号、绿优188、满冠、密刺王黄瓜、宁星全能春秋f1、青美、青爽、青甜、盛丰908、寿菜hg1号、硕丰八号、四季丰、田一、万农三号、无刺水果短黄瓜3966、选四、亚美特(泰国)、优亮王中王、油亮107、摘不败露地王、中农26号、p01、贝莎、博美11号、博美28号、翠龙、德尔ld-3、德瑞特f16、德瑞特y8、德瑞特黄瓜136-7、谷雨佳丽、吉杂16号、津优20-11、津杂2号、京a008、京丰298、京研106、京研118、京研旱宝5号、京研绿玲珑2号、绿博十一号、美丰瓜王、欧洲一号、奇剑1号、强果节结80、申绿64、申绿72、绥陵老来少、唐春100、唐山翠宝f1、特选吉杂四号、田骄八号、兴研二号、兴研四号、义王水果型黄瓜、中农16号、中研19f1、p02、北农佳秀、伯仲绿优黄瓜、博美517、博美74号、春美、翠绿、汇赢15、金胚99f1、津春4号、津绿3号、津旺203、津优11号、津优35、津优38、津优38号、津优409、京ak42、硕九、春秋王2号、银胚88f1、油绿王子、长春密刺、中农15号、中研迷8f1、c05-016、hh1-8-1-2、韩国黄瓜2-06-97-164、何旱、黑油亮999、沪杂6号、华耐h1104、吉杂16、津优12号、津优2号、津优401号、津优4号、宁佳3号、乾德117、田骄7号华南型、园丰元6号、翠莉、吉杂9、津优10号、津优31号和亮靓中的任一种。上述任一所述的方法中，n的数值越大，鉴定待测黄瓜杂交种纯度的准确性越高。需要说明的是，本发明所说的黄瓜杂交种指杂交一代种，只可能有亲本混杂；不是机械混杂，即若干种黄瓜杂交种混合而成。本发明提供的snp引物组合可在黄瓜杂交种的种子或幼苗期进行早期鉴定，保证杂交种的纯度，切实保护生产者和育种家的权益，并为黄瓜品种的种子质量管理提供技术支持。本发明提供的方法具有高通量、准确、低成本、操作简单、节约人力、物力等有点，具有十分广阔的应用前景。附图说明图1为8个引物组在部分供试黄瓜杂交种中的snp分型效果。图2为8个引物组在部分供试黄瓜杂交种中的杂合位点数分布。图3为引物组1和引物组6在96份京研优胜杂交种中的snp分型效果。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例1、用于鉴定黄瓜杂交种纯度的snp引物组合的获得一、8个snp位点的发现本发明基于49份黄瓜代表资源的重测序数据，获得8个snp位点。这49份黄瓜资源类型丰富，涵盖华北型(7份)、印度型(18份)、日本型(3份)、华南型(2份)、欧洲水果型(5份)、美洲加工型(4份)、西双版纳型(5份)以及中间型(5份)，基本包括了黄瓜主要的生态类型与农艺性状，尽可能多地体现了种质代表性，具有较高的遗传多样性。具体的，snp位点的筛选标准如下：在全基因组范围内选择位置均匀、多态性好、杂合度小、maf>0.3、pca聚类效果好、区分度高且两翼50bp序列保守(无indel，无ssr，无其它snp)的snp位点。8个snp位点的基本信息详见表1中第1至4列。其中snp位点在染色体上的位置是基于黄瓜9930参考基因组序列比对确定的，所述黄瓜9930参考基因组序列的版本号为v2(下载地址为：http://cucurbitgenomics.org/organism/2)。表1.8个snp位点的基本信息snp位点的名称所在染色体在染色体上的位置碱基类型(alt)碱基类型(ref)hgsnp01chr416975775cthgsnp02chr59582207aghgsnp03chr117508118gthgsnp04chr11976800athgsnp05chr54054461aghgsnp06chr620929474tchgsnp07chr38333363achgsnp08chr52133319ag二、用于鉴定黄瓜杂交种纯度的snp引物组合的获得基于步骤一发现的8个snp位点，本发明的发明人开发了具有较高多态性的用于鉴定黄瓜杂交种纯度的snp引物组合。snp引物组合由8个引物组组成，每个引物组的名称见表2中第2列。每个引物组由3条引物序列组成，用于扩增一个snp位点。8个引物组中各个引物的核苷酸序列如表2中第4列所示。表2注：单下划线为fam荧光标签序列，双下划线为hex荧光标签序列。实施例2、实施例1开发的snp引物组合的有效性检验本实施例中的212个供试黄瓜杂交种的基本信息见表3。212个供试黄瓜杂交种均为常见的优良杂交种或国外引进杂交种。表3.212个供试黄瓜杂交种的基本信息1、供试黄瓜杂交种的基因组dna的获得采用ctab法分别提取212个供试黄瓜杂交种的叶片(混取30粒种子的真叶)的基因组dna，得到供试黄瓜杂交种的基因组dna。供试黄瓜杂交种的基因组dna的质量和浓度均须满足pcr要求，达标标准为：琼脂糖电泳显示dna条带单一，没有明显弥散；紫外分光光度计nanodrop2000(thermo)检测a260/a280比值在1.8左右，a260/a230比值大于1.8；供试黄瓜杂交种的基因组dna的浓度在10-30ng/μl。2、分别以212个供试黄瓜杂交种的基因组dna为模板，分别采用8个引物组进行pcr扩增，得到相应的pcr扩增产物。各个pcr反应体系中，名称中含有“f1”的引物、名称中含有“f2”的引物和名称中含有“r”的引物的浓度比为2:2:5。反应程序为：94℃预变性，15min；94℃变性20s，61℃-55℃(选用touchdown程序，每循环降低0.6℃)，1min，扩增10个循环；94℃变性20s，55℃复性&延伸1min，继续扩增26个循环。3、完成步骤2后，待各个pcr扩增产物温度降至40℃以下时通过酶标仪的fam、hex光束扫描读取荧光值(fam荧光标签序列在激发光485nm，发射光520nm波长下观察读值，hex荧光标签序列在激发光528nm，发射光560nm波长下观察读值)，根据荧光信号颜色判断212个供试黄瓜杂交种基于每个snp位点的基因型。具体的判断原则如下：如果某供试黄瓜杂交种基于某snp位点显示蓝色荧光信号，则该供试黄瓜杂交种基于该snp位点的基因型为“扩增该snp位点且名称中含有“f1”的引物的3’末端第1个碱基的互补碱基”纯合型；如果某供试黄瓜杂交种基于某snp位点显示红色荧光信号，则该供试黄瓜杂交种基于该snp位点的基因型为“扩增该snp位点且名称中含有“f2”的引物的3’末端第1个碱基的互补碱基”纯合型；如果某供试黄瓜杂交种基于某snp位点显示绿色荧光信号，则该供试黄瓜杂交种基于该snp位点的基因型为杂合型，一个碱基为“扩增该snp位点且名称中含有“f1”的引物的3’末端第1个碱基的互补碱基”，另一个碱基“扩增该snp位点且名称中含有“f2”的引物的3’末端第1个碱基的互补碱基”。需要说明的是，若pcr扩增结束后荧光信号弱，影响数据分析，可以加循环(94℃变性20s，55℃复性及延伸1min，5个循环)，直至结果满意为止。部分结果见图1。结果表明，各个引物组在供试黄瓜杂交种中可以得到很好的分型效果。4、杂合位点数分布和效率评价(1)根据212个供试黄瓜杂交种基于8个snp位点的基因型，统计每个供试黄瓜杂交种的杂合位点数。建立在8个引物组上的212个供试黄瓜杂交种的杂合位点数分布结果见图2。结果表明，8个引物组能使每个供试黄瓜杂交种都有至少一个杂合位点。(2)杂交种纯度鉴定可以采用序贯分析方式减少工作量。结果表明，8个引物组在212个供试黄瓜杂交种中的杂合位点覆盖率达到100％。由此可见，实施例1开发的snp引物组合可以应用于黄瓜杂交种纯度鉴定。实施例3、采用实施例1开发的snp引物组合检测京研优胜杂交种的纯度一、采用实施例1开发的snp引物组合检测京研优胜杂交种的纯度1、京研优胜杂交种的基因组dna的获得(1)种植200粒市售京研优胜杂交种种子，得到京研优胜杂交种幼苗。(2)随机取96株京研优胜杂交种幼苗的叶片或根，采用ctab法分别提取基因组dna，依次得到96份京研优胜杂交种的基因组dna。2、引物组的筛选(1)分别以8份京研优胜杂交种的基因组dna为模板，分别采用实施例1开发的snp引物组合中的8个引物组进行pcr扩增，得到相应的pcr扩增产物。各个pcr反应体系中，名称中含有“f1”的引物、名称中含有“f2”的引物和名称中含有“r”的引物的浓度比为2:2:5。反应程序为：94℃预变性，15min；94℃变性20s，61℃-55℃(选用touchdown程序，每循环降低0.6℃)，1min，扩增10个循环；94℃变性20s，55℃复性&延伸1min，继续扩增26个循环。(2)完成步骤(1)后，待各个pcr扩增产物温度降至40℃以下时通过酶标仪的fam、hex光束扫描读取荧光值(fam荧光标签序列在激发光485nm，发射光520nm波长下观察读值，hex荧光标签序列在激发光528nm，发射光560nm波长下观察读值)，得到荧光信号颜色。比较8个引物组显示绿色荧光信号的株数，显示绿色荧光株数最多的引物组即为筛选出的引物组。结果表明，引物组1和引物组6显示绿色荧光信号的株数最多、均为8株。因此，引物组1和引物组6即为筛选出的引物组，进行后续实验。3、获得京研优胜杂交种的纯度(1)以96份京研优胜杂交种的基因组dna为模板，分别采用引物组1和引物组6进行pcr扩增，得到相应的pcr扩增产物。各个pcr反应体系中，名称中含有“f1”的引物、名称中含有“f2”的引物和名称中含有“r”的引物的浓度比为2:2:5。反应程序为：94℃预变性，15min；94℃变性20s，61℃-55℃(选用touchdown程序，每循环降低0.6℃)，1min，扩增10个循环；94℃变性20s，55℃复性&延伸1min，继续扩增26个循环。(2)完成步骤(1)后，待各个pcr扩增产物温度降至40℃以下时通过酶标仪的fam、hex光束扫描读取荧光值(fam荧光标签序列在激发光485nm，发射光520nm波长下观察读值，hex荧光标签序列在激发光528nm，发射光560nm波长下观察读值)，得到荧光信号颜色。snp分型结果见图3(左图为引物组1，右图为引物组6)。(3)完成步骤(2)后，分别统计引物组1和引物组6显示绿色荧光的株数和无荧光的株数(无荧光的株数＝96-显示绿色荧光的株数-显示红色荧光的株数-显示蓝色荧光的株数)；按照下述公式计算京研优胜杂交种的纯度；进一步计算平均值，得到平均纯度。纯度＝引物组显示绿色荧光的株数/(96-引物组无荧光的株数)×100％。结果表明，引物组1显示绿色荧光的株数为93株，无荧光的株数为2株，纯度为93/(96-2)＝98.94％；引物组6显示绿色荧光的株数为95株，无荧光的株数为0株，纯度为95/96＝98.96％；京研优胜杂交种的平均纯度为(98.94％ 98.96％)/2＝98.95％。<110>北京市农林科学院<120>一种鉴定黄瓜杂交种纯度的方法及其使用的snp引物组合<160>24<170>patentinversion3.5<210>1<211>51<212>dna<213>artificialsequence<400>1gaaggtgaccaagttcatgctataaatataaggctagactagtagcaaaag51<210>2<211>52<212>dna<213>artificialsequence<400>2gaaggtcggagtcaacggattgataaatataaggctagactagtagcaaaaa52<210>3<211>31<212>dna<213>artificialsequence<400>3gaagaagtctatgttttccctctatctaaaa31<210>4<211>47<212>dna<213>artificialsequence<400>4gaaggtgaccaagttcatgctcaacgagttgttaatgctttggagct47<210>5<211>46<212>dna<213>artificialsequence<400>5gaaggtcggagtcaacggattaacgagttgttaatgctttggagcc46<210>6<211>25<212>dna<213>artificialsequence<400>6actgacactccaggagcaatctcaa25<210>7<211>52<212>dna<213>artificialsequence<400>7gaaggtgaccaagttcatgctgaatgaaagtttaatcaaggatgcaactatt52<210>8<211>51<212>dna<213>artificialsequence<400>8gaaggtcggagtcaacggattaatgaaagtttaatcaaggatgcaactatg51<210>9<211>31<212>dna<213>artificialsequence<400>9agattttgtgccaatagagcaaagtcatata31<210>10<211>46<212>dna<213>artificialsequence<400>10gaaggtgaccaagttcatgctttatcaaacaactcgacggcttcga46<210>11<211>46<212>dna<213>artificialsequence<400>11gaaggtcggagtcaacggattttatcaaacaactcgacggcttcgt46<210>12<211>30<212>dna<213>artificialsequence<400>12gattgcactttatgggaaatgtgggttttt30<210>13<211>48<212>dna<213>artificialsequence<400>13gaaggtgaccaagttcatgctcggcataatatgaatcaacctggtaaa48<210>14<211>47<212>dna<213>artificialsequence<400>14gaaggtcggagtcaacggattggcataatatgaatcaacctggtaag47<210>15<211>24<212>dna<213>artificialsequence<400>15gaccaccaaggcctatcactccaa24<210>16<211>49<212>dna<213>artificialsequence<400>16gaaggtgaccaagttcatgctcatatacacacaatacatagctgttgga49<210>17<211>48<212>dna<213>artificialsequence<400>17gaaggtcggagtcaacggattatatacacacaatacatagctgttggg48<210>18<211>31<212>dna<213>artificialsequence<400>18ctctgccagaaacaaacaataacttttgtaa31<210>19<211>50<212>dna<213>artificialsequence<400>19gaaggtgaccaagttcatgcttacaataattagaggccttaaacagagta50<210>20<211>48<212>dna<213>artificialsequence<400>20gaaggtcggagtcaacggattcaataattagaggccttaaacagagtc48<210>21<211>35<212>dna<213>artificialsequence<400>21aaatctttaatcctatattttcttaagcattgcaa35<210>22<211>48<212>dna<213>artificialsequence<400>22gaaggtgaccaagttcatgctagactagcaaagagtaatatggttgac48<210>23<211>49<212>dna<213>artificialsequence<400>23gaaggtcggagtcaacggattgagactagcaaagagtaatatggttgat49<210>24<211>31<212>dna<213>artificialsequence<400>24tacatccgttatggaattttgagttacacta31当前第1页1 2 3
技术特征：1.snp位点组合，包括黄瓜基因组的8个snp位点；所述8个snp位点如下：hgsnp01位点为4号染色体上的第16975775位核苷酸；hgsnp02位点为5号染色体上的第9582207位核苷酸；hgsnp03位点为1号染色体上的第17508118位核苷酸；hgsnp04位点为1号染色体上的第1976800位核苷酸；hgsnp05位点为5号染色体上的第4054461位核苷酸；hgsnp06位点为6号染色体上的第20929474位核苷酸；hgsnp07位点为3号染色体上的第8333363位核苷酸；hgsnp08位点为5号染色体上的第2133319位核苷酸。
2.snp引物组合，包括用于扩增权利要求1所述cusnp01的引物组1、用于扩增权利要求1所述cusnp02的引物组2、用于扩增权利要求1所述cusnp03的引物组3、用于扩增权利要求1所述cusnp04的引物组4、用于扩增权利要求1所述cusnp05的引物组5、用于扩增权利要求1所述cusnp06的引物组6、用于扩增权利要求1所述cusnp07的引物组7、用于扩增权利要求1所述cusnp08的引物组8。
3.如权利要求2所述的snp引物组合，其特征在于：
所述引物组1由seqidno：1所示的正向引物1f1、seqidno：2所示的正向引物1f2和seqidno：3所示的反向引物1r组成；
所述引物组2由seqidno：4所示的正向引物2f1、seqidno：5所示的正向引物2f2和seqidno：6所示的反向引物2r组成；
所述引物组3由seqidno：7所示的正向引物3f1、seqidno：8所示的正向引物3f2和seqidno：9所示的反向引物3r组成；
所述引物组4由seqidno：10所示的正向引物4f1、seqidno：11所示的正向引物4f2和seqidno：12所示的反向引物4r组成；
所述引物组5由seqidno：13所示的正向引物5f1、seqidno：14所示的正向引物5f2和seqidno：15所示的反向引物5r组成；
所述引物组6由seqidno：16所示的正向引物6f1、seqidno：17所示的正向引物6f2和seqidno：18所示的反向引物6r组成；
所述引物组7由seqidno：19所示的正向引物7f1、seqidno：20所示的正向引物7f2和seqidno：21所示的反向引物7r组成；
所述引物组8由seqidno：22所示的正向引物8f1、seqidno：23所示的正向引物8f2和seqidno：24所示的反向引物8r组成。
4.如权利要求2所述的snp引物组合，其特征在于：
所述引物组1由seqidno：1自5’末端起第22至51位所示的正向引物1f1、seqidno：2自5’末端起第22至52位所示的正向引物1f2和seqidno：3所示的反向引物1r组成；
所述引物组2由seqidno：4自5’末端起第22至47位所示的正向引物2f1、seqidno：5自5’末端起第22至46位所示的正向引物2f2和seqidno：6所示的反向引物2r组成；
所述引物组3由seqidno：7自5’末端起第22至52位所示的正向引物3f1、seqidno：8自5’末端起第22至51位所示的正向引物3f2和seqidno：9所示的反向引物3r组成；
所述引物组4由seqidno：10自5’末端起第22至46位所示的正向引物4f1、seqidno：11自5’末端起第22至46位所示的正向引物4f2和seqidno：12所示的反向引物4r组成；
所述引物组5由seqidno：13自5’末端起第22至48位所示的正向引物5f1、seqidno：14自5’末端起第22至47位所示的正向引物5f2和seqidno：15所示的反向引物5r组成；
所述引物组6由seqidno：16自5’末端起第22至49位所示的正向引物6f1、seqidno：17自5’末端起第22至48位所示的正向引物6f2和seqidno：18所示的反向引物6r组成；
所述引物组7由seqidno：19自5’末端起第22至50位所示的正向引物7f1、seqidno：20自5’末端起第22至48位所示的正向引物7f2和seqidno：21所示的反向引物7r组成；
所述引物组8由seqidno：22自5’末端起第22至48位所示的正向引物8f1、seqidno：23自5’末端起第22至49位所示的正向引物8f2和seqidno：24所示的反向引物8r组成。
5.权利要求1所述snp位点组合或权利要求2至4任一所述snp引物组合的应用，为x1)或x2)：
x1)制备用于鉴定黄瓜杂交种纯度的试剂盒；
x2)鉴定黄瓜杂交种纯度。
6.一种鉴定待测黄瓜杂交种纯度的方法，包括如下步骤：
(a1)获得n株待测黄瓜杂交种的基因组dna；n为大于95的自然数；
(a2)分别以步骤(a1)获得的8-12株待测黄瓜杂交种的基因组dna为模板，分别采用权利要求3所述snp引物组合中8个引物组进行pcr扩增，得到相应的pcr扩增产物；
(a3)完成步骤(a2)后，采用仪器检测各个pcr扩增产物的荧光信号，统计8个引物组显示绿色荧光信号的株数；显示绿色荧光株数最多的引物组即为目的引物组；
(a4)分别以步骤(a1)获得的n株待测黄瓜杂交种的基因组dna为模板，分别采用目的引物组进行pcr扩增，得到相应的pcr扩增产物；
(a5)完成步骤(a4)后，采用仪器检测各个pcr扩增产物的荧光信号，根据荧光信号的颜色获得待测黄瓜杂交种的纯度。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述“根据荧光信号的颜色获得待测黄瓜杂交种的纯度”的方法为：统计各个目的引物组显示绿色荧光的株数和无荧光的株数，分别计算纯度，之后求平均值；
无荧光的株数＝n-显示绿色荧光的株数-显示红色荧光的株数-显示蓝色荧光的株数；
纯度＝目的引物组显示绿色荧光的株数/(n-目的引物组无荧光的株数)×100％。
8.一种鉴定待测黄瓜杂交种纯度的方法，包括如下步骤：
(b1)获得n株待测黄瓜杂交种的基因组dna；n为大于95的自然数；
(b2)分别以步骤(1)获得的8-12株待测黄瓜杂交种的基因组dna为模板，分别采用权利要求4或3所述snp引物组合中8个引物组进行pcr扩增，得到相应的pcr扩增产物；
(b3)取步骤(b2)得到的各个pcr扩增产物，测序；根据测序结果，获得基于8个snp位点的基因型为杂合型的株数，株数最多的引物组即为目的引物组；
(b4)分别以步骤(b1)获得的n株待测黄瓜杂交种的基因组dna为模板，分别采用目的引物组进行pcr扩增，得到相应的pcr扩增产物；
(b5)取步骤(b4)得到的各个pcr扩增产物，测序；根据测序结果获得待测黄瓜杂交种的纯度。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于：所述“根据测序结果获得待测黄瓜杂交种的纯度”的方法为：统计各个目的引物组基于snp位点的基因型为杂合型的株数和没有获得pcr扩增产物的株数，分别计算纯度，之后求平均值；
纯度＝目的引物组基于snp位点的基因型为杂合型的株数/(n-目的引物组没有获得pcr扩增产物的株数)×100％。
10.如权利要求6至9任一所述的方法，其特征在于：所述待测黄瓜杂交种为mc2065、碧玉、博美5032、绿衣天使、美雌09、南雌1号、南雌2号、宁丰09、优加全雌09、83-ms702、本地王黄瓜、春秋王3号、春喜f1、翠冠亮星、戴安娜、德瑞特723、德瑞特727、德瑞特7876、德瑞特黄瓜、东农804、花青大吊瓜、金胚98f1、金胚98-1f1、金胚99-1f1、金胚99-2f1、津优108号、津优36号、京研迷你1号、京研迷你3号、京研迷你5号、京研迷你9号、京研秋美、京研夏美、绿翠、绿翠宝、绿精灵2号、绿精灵3号、绿精灵5号、玛莎黄瓜腌渍型、南雌3号、全能春秋f1(短重)、宁运3号、奇剑2号、强旱节结、瑞光二号、新津春四号、中农19号、中农50号、中农9号、中研17f1、壮瓜、128一代杂种、13ac230、amata765、vlaspik、白马王子、北京204、北京白玉三、碧绿节成、碧玉2号、博美6913、博美8号、超越黄瓜f1、川翠3号、春华1号、春王9801、翠美水果黄瓜、戴多星(deltastar)、德瑞特、德瑞特15-10、德瑞特4号、德瑞特d19、德瑞特黄瓜gz1601、德瑞特黄瓜l14-2、德瑞特黄瓜l14-5、鼎好油亮重茬王、东农806、冬丽、谷雨美利新星、海诺一号、吉杂九号、吉杂迷你、宝杂2号、博美10号、德瑞特79、金胚99-3f1、津春3号、津春三号、津冬科润99、津旺615-4、津研四号、津优1号、津优303号、津优308、津优315号、津优35号、津优48号、津优一号、津正a207、京ak18、京白玉超白叶三、京研107、京研春美、京研迷你2号、京研优胜、精品白叶三、军科十八号、龙泉王-龙泉绿冠、鲁黄瓜三号、绿宝珠8号、绿优188、满冠、密刺王黄瓜、宁星全能春秋f1、青美、青爽、青甜、盛丰908、寿菜hg1号、硕丰八号、四季丰、田一、万农三号、无刺水果短黄瓜3966、选四、亚美特(泰国)、优亮王中王、油亮107、摘不败露地王、中农26号、p01、贝莎、博美11号、博美28号、翠龙、德尔ld-3、德瑞特f16、德瑞特y8、德瑞特黄瓜136-7、谷雨佳丽、吉杂16号、津优20-11、津杂2号、京a008、京丰298、京研106、京研118、京研旱宝5号、京研绿玲珑2号、绿博十一号、美丰瓜王、欧洲一号、奇剑1号、强果节结80、申绿64、申绿72、绥陵老来少、唐春100、唐山翠宝f1、特选吉杂四号、田骄八号、兴研二号、兴研四号、义王水果型黄瓜、中农16号、中研19f1、p02、北农佳秀、伯仲绿优黄瓜、博美517、博美74号、春美、翠绿、汇赢15、金胚99f1、津春4号、津绿3号、津旺203、津优11号、津优35、津优38、津优38号、津优409、京ak42、硕九、春秋王2号、银胚88f1、油绿王子、长春密刺、中农15号、中研迷8f1、c05-016、hh1-8-1-2、韩国黄瓜2-06-97-164、何旱、黑油亮999、沪杂6号、华耐h1104、吉杂16、津优12号、津优2号、津优401号、津优4号、宁佳3号、乾德117、田骄7号华南型、园丰元6号、翠莉、吉杂9、津优10号、津优31号和亮靓中的任一种。
技术总结本发明公开了一种鉴定黄瓜杂交种纯度的方法及其使用的SNP引物组合。本发明所提供的SNP引物组合由8个引物组组成；每个引物组由3条引物序列组成，用于扩增一个SNP位点；各个引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：24所示。该SNP引物组合可在黄瓜杂交种的种子或幼苗期进行早期鉴定，保证杂交种的纯度，切实保护生产者和育种家的权益，并为黄瓜品种的种子质量管理提供技术支持。本发明提供的方法具有高通量、准确、低成本、操作简单、节约人力、物力等有点，具有十分广阔的应用前景。
技术研发人员：温常龙;张建;杨静静;罗江;毛爱军
受保护的技术使用者：北京市农林科学院
技术研发日：2020.04.07
技术公布日：2020.06.09
