本发明涉及利用逆转录-聚合酶链式反应(reversetranscription-polymerasechainreaction、rt-pcr)检测rna病毒的方法、以及用于实施该方法的试剂盒。更具体而言，涉及将待检体与包含表面活性剂的待检体处理液混合，进而添加rt-pcr反应液，从而检测rna病毒的方法、以及用于实施该方法的试剂盒。
背景技术：
rna病毒为具有rna作为基因组的病毒，被分类为具有由脂质双分子层形成的膜即包膜的冠状病毒、人类免疫缺陷病毒、丙型肝炎病毒、日本脑炎病毒、登革病毒等、以及不具有包膜的诺如病毒、轮状病毒、鼻病毒等，致病性的rna病毒也较多。
诺如病毒是属于人杯状病毒(humancalicivirus)科的病毒，基因组中具有约7000个碱基的单链rna。该病毒是按照用电子显微镜观察到的形态学分类也被称为小圆形结构病毒(smallroundstructuredvirus,srsv)、且以诺沃克样病毒(norwalk-likevirus)这样的属名所称呼的病毒。属于诺如病毒的病毒被分类为基因组(genogroup)(gi)和基因组ii(gii)这2种基因组，进而分别被分类为14和17或更多的基因型(genotype)。
人感染诺如病毒时会引起呕吐、痢疾等急性胃肠炎症状。日本国内每年的食物中毒患者的约半数起因于诺如病毒，其中的约7成发生在11月～2月，诺如病毒作为冬季型的胃肠炎和食物中毒的原因病毒而已知。由诺如病毒导致的食物中毒主要由通过烹饪者的食品污染而产生。诺如病毒的感染性强、容易产生大规模的食物中毒等群体事件。对于人的感染途径主要是经口感染。感染者的粪便或呕吐物以及被它们直接或间接地污染的物品类、或者被诺如病毒污染的牡蛎或者其他的双壳贝类等食品类作为代表性的感染源而被列举。因此，鉴定诺如病毒感染患者、由该病毒导致的污染物对于防止病毒感染的扩大是重要的。
作为用于检测由病毒导致的感染、污染的病毒检查，应用检测病毒抗原的免疫学的测定法、病毒基因扩增法(专利文献1～3、非专利文献1)。作为高灵敏度地检测诺如病毒的手段，可列举出用rt-pcr扩增诺如病毒的rna、测定扩增产物量的方法。例如，根据厚生劳动省药品食品局食品安全部监视安全课的通知(非专利文献2和3)，广泛地利用rt-pcr法进行诺如病毒的检测以及利用实时pcr法进行诺如病毒的定量检测。
rna病毒粒子具有由rna基因组与蛋白质形成的核被封入被称为衣壳的蛋白质壳中而成的基本结构。因此，为了利用基因扩增法检测病毒rna，需要从病毒粒子中提取rna。为了检测作为待检体的粪便中的诺如病毒，例如，将粪便待检体以5～10％(w/v)的浓度悬浮于蒸馏水或生理盐水中，由其离心上清，使用市售的病毒rna提取试剂盒(例如，qiaamp(注册商标)viralrnamini、qiagen公司)提取/纯化rna(非专利文献2)。然而，在多阶段的rna提取·纯化操作之后进行rt-pcr的检测过程是复杂的。因此，提出了将粪便悬浮液与待检体处理液混合、进行短时间热处理来去除壳蛋白，使内部的rna游离，将游离的rna直接供于rt-pcr的简易的检测法(非专利文献4)。另一方面，为了对粪便悬浮液与待检体处理液的混合物进行热处理，需要做以下的工作：为了防止该混合物的暴沸、蒸发而用盖子对反应容器进行密闭，热处理之后卸下盖子，添加rt-pcr反应液。为了改善这一点，提出了将待检体与胍盐等离液剂混合，不必进行热处理而利用rt-pcr来检测病毒的方法(专利文献4)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：wo2002/029119
专利文献2：wo2002/029120
专利文献3：日本特开2004-301684
专利文献4：日本特开2017-209036
非专利文献
非专利文献1：kageyamat,etal.broadlyreactiveandhighlysensitiveassayfornorwalk-likevirusesbasedonreal-timequantitativereversetranscription-pcr.jclinmicrobiol.2003apr；41(4):1548-57.
非专利文献2：厚生労働省医薬食品局食品安全部監視安全課食安監発第1105001号(平成15年11月5日)另附「ノロウイルスの検出法について」、最终订正：食安監発0514004号(平成19年5月14日)
非专利文献3：厚生労働省医薬食品局食品安全部監視安全課食安監発第1105001号(平成15年11月5日)另附「ノロウイルスの検出法について」、最终订正：食安監発1022第1号(平成25年10月22日)
非专利文献4：nishimuran,etal.detectionofnorovirusesinfecalspecimensbydirectrt-pcrwithoutrnapurification.jvirolmethods.2010feb；163(2):282-286.
技术实现要素：
发明要解决的问题
本发明的目的在于提供简便的rna病毒的检测方法。具体而言，提供使用1种以上的表面活性剂，不经热处理地自诺如病毒等rna病毒粒子进行rna提取，接着利用游离的rna的rt-pcr反应来简便地进行病毒检测操作的方法。
用于解决问题的方案
本发明的目的通过以下的发明实现。
[1]
一种检测待检体中的rna病毒的方法，其包括：
工序(1)，将待检体与包含1种以上表面活性剂的待检体处理液混合，生成悬浮液；
工序(2)，从通过工序(1)生成的悬浮液中、通过离心分离提取离心上清；
工序(3)，将通过工序(2)提取的离心上清与包含逆转录酶和dna聚合酶的一步法rt-pcr反应液混合，进行rt-pcr；以及，
工序(4)，检测前述rt-pcr产物。
[2]
根据[1]所述的方法，其中，前述rna病毒选自由诺如病毒、轮状病毒、鼻病毒、冠状病毒、人类免疫缺陷病毒、丙型肝炎病毒、日本脑炎病毒和登革病毒组成的组。
[3]
根据[1]所述的方法，其中，前述rna病毒为诺如病毒。
[4]
根据[3]所述的方法，其中，前述诺如病毒基因型为基因组i(gi)或基因组ii(gii)。
[5]
根据[1]～[4]中任一项所述的方法，其中，前述待检体源自选自由生物试样、生物来源试样、环境试样和环境来源试样组成的组中的试样。
[6]
根据[1]～[4]中任一项所述的方法，其中，前述待检体源自选自由排泄物试样、排泄物来源试样、呕吐物和呕吐物来源试样组成的组中的试样。
[7]
根据[1]～[6]中任一项所述的方法，其中，前述表面活性剂为阴离子表面活性剂。
[8]
根据[7]所述的方法，其中，前述阴离子表面活性剂为选自由烷基硫酸盐、烷基醚硫酸盐、多库酯(docusate)、磺酸盐含氟表面活性剂、烷基苯磺酸盐、烷基芳基醚磷酸盐、烷基醚磷酸盐、烷基羧酸盐、月桂酰肌氨酸钠、羧酸盐含氟表面活性剂、胆酸钠和脱氧胆酸钠组成的组中的1种以上阴离子表面活性剂。
[9]
根据[7]所述的方法，其中，前述阴离子表面活性剂为烷基硫酸盐。
[10]
根据[9]所述的方法，其中，前述烷基硫酸盐为十二烷基硫酸钠或十二烷基硫酸铵。
[11]
根据[1]～[10]中任一项所述的方法，其中，前述表面活性剂的浓度为0.02～0.5％(w/v)。
[12]
根据[1]～[11]中任一项所述的方法，其中，前述待检体处理液包含氢氧化物。
[13]
根据[12]所述的方法，其中，前述氢氧化物为氢氧化钠或氢氧化钾。
[14]
根据[12]或[13]所述的方法，其中，前述氢氧化物的浓度为10～100mm。
[15]
根据[1]～[14]中任一项所述的方法，其中，前述工序(1)中的待检体与待检体处理液的混合比以体积比计为1：3～6。
[16]
根据[1]～[15]中任一项所述的方法，其中，前述逆转录酶选自由amv逆转录酶、mmlv逆转录酶、hiv逆转录酶和它们的突变体组成的组。
[17]
根据[1]～[16]中任一项所述的方法，其中，前述dna聚合酶选自由taqdna聚合酶、tthdna聚合酶、koddna聚合酶、pfudna聚合酶和它们的突变体组成的组。
[18]
根据[1]～[17]中任一项所述的方法，其中，前述工序(4)通过实时测定来进行。
[19]
根据[1]～[18]中任一项所述的方法，其中，前述工序(1)和(2)在1～50℃的温度下进行。
[20]
根据[1]～[19]中任一项所述的方法，其中，前述工序(4)中，使用荧光滤光片测定rt-pcr产物的扩增曲线，判定待检体中的rna病毒的存在为阳性、或为阴性。
[21]
一种rna病毒的检测试剂盒，其含有：包含1种以上表面活性剂的待检体处理液、以及包含逆转录酶和dna聚合酶的一步法rt-pcr反应液。
[22]
根据[21]所述的试剂盒，其中，前述rna病毒选自由诺如病毒、轮状病毒、鼻病毒、冠状病毒、人类免疫缺陷病毒、丙型肝炎病毒、日本脑炎病毒和登革病毒组成的组。
[23]
根据[21]所述的试剂盒，其中，前述rna病毒为诺如病毒。
[24]
根据[23]所述的试剂盒，其中，判定诺如病毒基因型为基因组i(gi)、或为基因组ii(gii)。
[25]
根据[21]～[24]中任一项所述的试剂盒，其中，前述表面活性剂为阴离子表面活性剂。
[26]
根据[25]所述的试剂盒，其中，前述阴离子表面活性剂为选自由烷基硫酸盐、烷基醚硫酸盐、多库酯、磺酸盐含氟表面活性剂、烷基苯磺酸盐、烷基芳基醚磷酸盐、烷基醚磷酸盐、烷基羧酸盐、月桂酰肌氨酸钠、羧酸盐含氟表面活性剂、胆酸钠和脱氧胆酸钠组成的组中的1种以上阴离子表面活性剂。
[27]
根据[25]所述的试剂盒，其中，前述阴离子表面活性剂为烷基硫酸盐。
[28]
根据[27]所述的试剂盒，其中，前述烷基硫酸盐为十二烷基硫酸钠或十二烷基硫酸铵。
[29]
根据[21]～[28]中任一项所述的试剂盒，其还包含试剂盒的操作步骤说明书。
发明的效果
根据本发明，通过将包含诺如病毒等rna病毒粒子的粪便等待检体与包含1种以上表面活性剂的待检体处理液直接混合，从而能够高效地使rna自病毒粒子游离。因此，能够缩短以往必须的工序、即将待检体悬浮于水或缓冲液，从所得悬浮液中通过离心分离来提取离心上清，在提取的离心上清中添加待检体处理液并进行放置这样的rna游离工序，能够快速地利用rt-pcr检测rna病毒。进而，本发明中，由于rna自病毒粒子的游离效率高，因此病毒检测灵敏度高，能够精度良好地检测病毒脱落期。因此，对于亚临床感染的检测、特别是处于感染后的恢复期的感染患者的鉴定是有用的。
具体实施方式
本发明提供检测待检体中的rna病毒的方法。该方法包括：
工序(1)，将待检体与包含1种以上表面活性剂的待检体处理液混合，生成悬浮液；
工序(2)，从通过工序(1)生成的悬浮液中、通过离心分离提取离心上清；
工序(3)，将通过工序(2)提取的离心上清与包含逆转录酶和dna聚合酶的一步法rt-pcr反应液混合，进行rt-pcr；以及，
工序(4)，检测前述rt-pcr产物。
本发明中，待检体中的成为检测对象的rna病毒为具有rna作为基因组的病毒，可列举出具有由脂质双分子层形成的膜即包膜的冠状病毒、人类免疫缺陷病毒、丙型肝炎病毒、日本脑炎病毒、登革病毒等、以及不具有包膜的诺如病毒、轮状病毒、鼻病毒等，但不限定于这些。包膜的主要成分为脂质，因此容易被醇等有机溶剂、表面活性剂破坏，但不具有这样的包膜的诺如病毒等rna病毒通常对于有机溶剂、表面活性剂表现出抗性。
作为本发明中的待检体，可列举出生物试样、生物来源试样、环境试样和环境来源试样等。作为生物试样，包括包含贝类的中肠腺等的动植物组织以及血液、唾液、鼻涕、组织分泌液等体液。特别是，贝类作为由诺如病毒导致的食物中毒的原因食品最需要被重视。作为生物来源试样，包含对于前述生物试样进行例如超声处理等处理而得到的试样。作为环境试样，可列举出包含空气、土壤、尘埃、水等的所有试样。作为环境来源试样，包含对于前述环境试样进行例如超声处理等处理而得到的试样。
作为本发明的另一实施方式，作为待检体，可列举出排泄物试样、排泄物来源试样、呕吐物和呕吐物来源试样等。排泄物试样和呕吐物试样可以原样使用，也可以在蒸馏水、生理盐水或缓冲液中以例如10％(w/v)悬浮而制成乳剂。作为前述缓冲液，没有特别的限定，可列举出磷酸盐缓冲液、tris缓冲液、硼酸盐缓冲液、hepes等两性离子(good)缓冲液。对于前述试样的乳剂，可以为了去除肠内细菌等夹杂物而以例如10000～12000rpm离心分离2～20分钟，将离心上清用作待检体。排泄物来源试样和呕吐物来源试样中包含擦拭试样。擦拭试样是指，以病毒污染的确认作为目的，从手指、食器、菜板、菜刀、烹饪设备、厕所设备、住宅设备等用棉棒、切片棉等擦拭而得到的物质用磷酸盐缓冲液等使之溶出而得到的试样。可以使用对于得到的溶出液进行超离心分离、将离心沉淀悬浮或溶解而得到的物质作为待检体(宗村佳子等、食品衛生学雑誌、2017年58卷4号p.201-204)。
本发明的工序(1)为将待检体与包含1种以上表面活性剂的待检体处理液混合的工序。本说明书中，“表面活性剂”是指，作用于物质的界面而使性质改变的物质的统称。表面活性剂具备在分子内具有亲水性部分和疏水性部分这两者的结构。表面活性剂被分类为阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性表面活性剂和非离子表面活性剂。作为阴离子表面活性剂，可列举出烷基硫酸盐、烷基醚硫酸盐、多库酯、磺酸盐含氟表面活性剂、烷基苯磺酸盐、烷基芳基醚磷酸盐、烷基醚磷酸盐、烷基羧酸盐、月桂酰肌氨酸钠、羧酸盐含氟表面活性剂、胆酸钠和脱氧胆酸钠等，但不限定于这些。作为烷基硫酸盐，优选十二烷基硫酸钠(sodiumdodecylsulfate、sds)和十二烷基硫酸铵，更优选十二烷基硫酸钠。十二烷基硫酸钠也被称为月桂基硫酸钠(sodiumlaurylsulfate、sls)。作为阳离子表面活性剂，可列举出乙基三甲基溴化铵、十六烷基三甲基溴化铵和十四烷基三甲基溴化铵等，但不限定于这些。作为两性表面活性剂，例如可列举出甜菜碱和烷基氨基脂肪酸盐，但不限定于这些。作为非离子表面活性剂，可列举出壬基苯氧基聚乙氧基乙醇(np-40)、聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯(tween(注册商标)80)、聚氧乙烯对叔辛基苯酚(tritonx-100(注册商标))等，但不限定于这些。
表面活性剂在水溶液中添加一定浓度以上时，表面活性剂单体聚集而形成胶束。表面活性剂变得要形成胶束的浓度称为临界胶束浓度。在水溶液中，在表面活性剂胶束内部的疏水性区域中引入蛋白质、脂质的疏水性区域，使蛋白质、脂质发生增溶。rna病毒粒子中，蛋白质的壳即衣壳、由脂质形成的包膜在临界胶束浓度以上的表面活性剂的存在下被增溶，发生变性或破坏。其结果，封入在衣壳中的rna容易成为在水溶液中露出的状态。表面活性剂的临界胶束浓度根据表面活性剂的种类而异，为了使病毒rna高效地露出，待检体处理液中的表面活性剂的浓度优选为0.02～0.5％(w/v)、更优选为0.05～0.3％(w/v)、进一步优选为0.2％(w/v)。
待检体与待检体处理液的混合比优选以体积比计为1：3～6、更优选为1：4。通过将待检体与包含表面活性剂的待检体处理液混合，从而混合液中的表面活性剂的浓度降低，但表面活性剂的上述浓度维持临界胶束浓度。
本发明的一实施方式中，前述待检体处理液包含氢氧化物。本说明书中，“氢氧化物”是指，作为阳离子的金属离子与作为阴离子的氢氧根离子(oh-)以离子键结合而得到的物质。金属为碱金属或碱土金属。作为氢氧化物，例示出氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化镁、氢氧化钙和氢氧化钡，优选氢氧化钠和氢氧化钾。氢氧化物表现出强碱性，在溶解于水时生成氢氧根离子，因此也被称为碱。氢氧化物在水溶液中使蛋白质分子中的天门冬氨酸、谷氨酸等解离性氨基酸的带电状况发生变化，使蛋白质变性。通过该作用，在对rna病毒粒子进行碱处理时发生衣壳的破坏。其结果，封入在衣壳中的rna容易成为在水溶液中露出的状态。为了使病毒rna高效地露出，待检体处理液中的氢氧化物浓度优选为10～100mm、更优选为40～60mm、进一步优选为50mm。
为了使衣壳、由脂质形成的包膜增溶、变形、或破坏，使病毒rna高效地露出，优选的是，在前述待检体处理液中共存有表面活性剂和氢氧化物。
本发明的工序(2)为将待检体与待检体处理液混合，从生成的悬浮液中通过离心分离提取离心上清的工序。通过所述离心分离，能够从悬浮液中去除不溶物。离心分离条件只要能够去除不溶物就没有特别限定，为以8000～12000rpm进行2～10分钟、优选为以10000rpm进行5分钟。为了去除不溶物，除了离心分离之外，例如也可以利用孔径0.22～0.45μm的过滤器进行过滤。
用于使病毒rna高效地从衣壳露出，并以离心上清的形式提取的本发明的工序(1)和(2)中，无需特别进行温度管理，优选在1～50℃下进行，更优选在1～30℃的室温下进行。
本发明的工序(3)为将通过工序(2)得到的离心上清与包含逆转录酶和dna聚合酶的一步法rt-pcr反应液混合，进行rt-pcr的工序。通过工序(2)得到的离心上清中所含的表面活性剂之中，特别是sds对蛋白质的变性效果强。因此，在工序(3)中以高浓度导入sds时，有可能妨碍前述一步法rt-pcr反应液中所含的逆转录酶和dna聚合酶的酶活性，而使rt-pcr不会推进。同样地，通过工序(2)得到的离心上清中所含的氢氧化物也在工序(3)中导入的浓度高时，因高ph而导致前述酶活性的降低。因此，通过工序(2)得到的离心上清与前述一步法rt-pcr反应液的混合比优选以体积比计为1：2～6、更优选为1：4。
本发明的工序(3)中，为了以短时间分析多个待检体，采用一步法rt-pcr。一步法rt-pcr反应液中预先混合有逆转录酶和dna聚合酶，能够在同一容器内进行逆转录反应(单链cdna合成)和pcr。
前述一步法rt-pcr反应液中所包含的逆转录酶是以病毒rna作为模板、生成单链互补dna(cdna)的酶，只要能催化逆转录反应就没有特别的限定，可以使用禽类成髓细胞性白血病病毒(avianmyeloblastosisvirus、amv)、莫洛尼氏鼠白血病病毒(moloneymurineleukemiavirus、m-mlv)和人类免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus、hiv)等rna病毒来源的rna依赖性dna聚合酶以及它们的突变体。另外，也可以使用兼具逆转录酶活性的dna聚合酶。作为所述dna聚合酶，例示出下述taq和tth。
前述一步法rt-pcr反应液所包含的dna聚合酶是嗜热细菌来源的耐热性dna聚合酶，可以使用taq、tth、kod、pfu以及它们的突变体，但不限定于这些。为了避免由dna聚合酶所导致的非特异性扩增，也可以使用热启动dna聚合酶。热启动dna聚合酶是例如结合有抗dna聚合酶抗体的dna聚合酶或者对酶活性部位进行了热敏感性化学修饰而得到的dna聚合酶，是在pcr中经过了最初的变性步骤(90℃以上)之后dna聚合酶被活性化的酶。
前述一步法rt-pcr反应液中包含用于使逆转录反应和pcr在适当的条件下进行的所有成分。作为该成分，至少包含前述逆转录酶、逆转录反应引物、前述耐热性dna聚合酶、pcr引物、dntp混合物(包含脱氧核苷5’-三磷酸；datp、dgtp、dctp和dttp的混合物)以及缓冲液。本发明的一实施方式中，前述反应液包含三羟甲基氨基甲烷(tris)和镁离子。前述反应液中也可以添加rna分解酶抑制剂。作为逆转录反应引物，可以使用对目标rna的序列具有特异性的引物、低聚(dt)引物或随机引物。作为pcr引物，可以使用对于通过逆转录反应生成的cdna的序列具有特异性的引物对(正向和反向)。pcr引物可以与对目标rna序列具有特异性的前述逆转录反应引物相同。另外，可以根据扩增的dna区域、即目标序列的数目向前述一步法rt-pcr反应液中添加2种以上的pcr引物。作为包含前述成分的组合物，可以使用将诺如病毒检测试剂盒(探针法)(岛津制作所、产品编号241-09325-91或241-09325-92)中所含的试剂按照试剂盒处理说明书进行混合而得到的rt-pcr反应液。
在检测诺如病毒rna的情况下，通过使用例如专利文献1和2、非专利文献3以及日本特开2018-78806所述的pcr引物，能够检测到诺如病毒基因型中的基因组i(gi)和基因组ii(gii)，但不限定于此。前述诺如病毒检测试剂盒(探针法)中包含非专利文献3所述的pcr引物，因此可以使用它。
对于rt-pcr中的逆转录反应的反应温度条件、以及pcr条件(温度、时间和循环数)的设定，只要是本领域技术人员就可以容易地进行。
本发明的工序(4)为检测来自工序(3)中进行的rt-pcr的产物的工序。本发明的一实施方式中，通过实时测定来检测pcr产物。进行该实时测定的情况下，工序(3)的rt-pcr和工序(4)的检测该rt-pcr产物的工序在同一容器内进行。
pcr产物的实时测定也被称为实时pcr。实时pcr中，通常利用荧光检测pcr扩增产物。荧光检测方法有：使用嵌入性荧光色素的方法、以及使用荧光标记探针的方法。作为嵌入性荧光色素，可以使用sybr(注册商标)greeni，但不限定于此。嵌入性荧光色素与通过pcr合成的双链dna结合，通过激发光的照射发出荧光。通过测定该荧光强度，能够测定pcr扩增产物的生成量。
作为荧光标记探针，可列举出taqman探针、分子信标(molecularbeacon)、循环探针等，但不限定于这些。taqman探针是5’末端被荧光色素修饰、且3’末端被猝灭剂物质修饰而得到的低聚核苷酸。taqman探针可以在pcr的退火步骤中与模板dna特异性地杂交，但探针上存在有猝灭剂，因此即便照射激发光也会抑制荧光的发生。在之后的延伸反应步骤中，利用taqdna聚合酶所具有的5’→3’核酸外切酶活性，与模板dna杂交的taqman探针被分解时，荧光色素自探针游离，由猝灭剂导致的荧光发生的抑制被解除，从而发出荧光。通过测定该荧光强度，能够测定扩增产物的生成量。作为前述荧光色素，可列举出fam、rox、cy5，但不限定于这些。作为前述猝灭剂，可列举出tamra(注册商标)和mgb，但不限定于这些。为了将2种以上的dna目标序列区别而进行检测，使用分别结合了不同的荧光色素的2种以上的低聚核苷酸探针(例如taqman探针)进行pcr。
工序(4)中，使用与所使用的荧光色素相对应的荧光滤光片，测定rt-pcr产物的扩增曲线。与pcr循环数相应地荧光强度增加时，判定为待检体中的分析对象的rna病毒的存在为阳性，另一方面，pcr中荧光强度没有增加的情况下，被判定为阴性。
本发明的一实施方式中，提供一种rna病毒的检测试剂盒，其含有：包含1种以上表面活性剂的待检体处理液、以及包含逆转录酶和dna聚合酶的一步法rt-pcr反应液。
1.一种检测待检体中的rna病毒的方法，其包括：
工序(1)，将待检体与包含1种以上表面活性剂的待检体处理液混合，生成悬浮液；
工序(2)，从通过工序(1)生成的悬浮液中、通过离心分离提取离心上清；
工序(3)，将通过工序(2)提取的离心上清与包含逆转录酶和dna聚合酶的一步法rt-pcr反应液混合，进行rt-pcr；以及，
工序(4)，检测所述rt-pcr产物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述rna病毒选自由诺如病毒、轮状病毒、鼻病毒、冠状病毒、人类免疫缺陷病毒、丙型肝炎病毒、日本脑炎病毒和登革病毒组成的组。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述rna病毒为诺如病毒。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述诺如病毒基因型为基因组i(gi)或基因组ii(gii)。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，所述待检体源自选自由生物试样、生物来源试样、环境试样和环境来源试样组成的组中的试样。
6.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，所述待检体源自选自由排泄物试样、排泄物来源试样、呕吐物和呕吐物来源试样组成的组中的试样。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，所述表面活性剂为阴离子表面活性剂。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述阴离子表面活性剂为选自由烷基硫酸盐、烷基醚硫酸盐、多库酯、磺酸盐含氟表面活性剂、烷基苯磺酸盐、烷基芳基醚磷酸盐、烷基醚磷酸盐、烷基羧酸盐、月桂酰肌氨酸钠、羧酸盐含氟表面活性剂、胆酸钠和脱氧胆酸钠组成的组中的1种以上阴离子表面活性剂。
9.根据权利要求7所述的方法，其中，所述阴离子表面活性剂为烷基硫酸盐。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述烷基硫酸盐为十二烷基硫酸钠或十二烷基硫酸铵。
11.根据权利要求1～10中任一项所述的方法，其中，所述表面活性剂的浓度为0.02～0.5％(w/v)。
12.根据权利要求1～11中任一项所述的方法，其中，所述待检体处理液包含氢氧化物。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述氢氧化物为氢氧化钠或氢氧化钾。
14.根据权利要求12或13所述的方法，其中，所述氢氧化物的浓度为10～100mm。
15.根据权利要求1～14中任一项所述的方法，其中，所述工序(1)中的待检体与待检体处理液的混合比以体积比计为1：3～6。
16.根据权利要求1～15中任一项所述的方法，其中，所述逆转录酶选自由amv逆转录酶、mmlv逆转录酶、hiv逆转录酶和它们的突变体组成的组。
17.根据权利要求1～16中任一项所述的方法，其中，所述dna聚合酶选自由taqdna聚合酶、tthdna聚合酶、koddna聚合酶、pfudna聚合酶和它们的突变体组成的组。
18.根据权利要求1～17中任一项所述的方法，其中，所述工序(4)通过实时测定来进行。
19.根据权利要求1～18中任一项所述的方法，其中，所述工序(1)和(2)在1～50℃的温度下进行。
20.根据权利要求1～19中任一项所述的方法，其中，所述工序(4)中，使用荧光滤光片测定rt-pcr产物的扩增曲线，判定待检体中的rna病毒的存在为阳性、或为阴性。
21.一种rna病毒的检测试剂盒，其含有：包含1种以上表面活性剂的待检体处理液、以及包含逆转录酶和dna聚合酶的一步法rt-pcr反应液。
22.根据权利要求21所述的试剂盒，其中，所述rna病毒选自由诺如病毒、轮状病毒、鼻病毒、冠状病毒、人类免疫缺陷病毒、丙型肝炎病毒、日本脑炎病毒和登革病毒组成的组。
23.根据权利要求21所述的试剂盒，其中，所述rna病毒为诺如病毒。
24.根据权利要求23所述的试剂盒，其判定诺如病毒基因型为基因组i(gi)、或为基因组ii(gii)。
25.根据权利要求21～24中任一项所述的试剂盒，其中，所述表面活性剂为阴离子表面活性剂。
26.根据权利要求25所述的试剂盒，其中，所述阴离子表面活性剂为选自由烷基硫酸盐、烷基醚硫酸盐、多库酯、磺酸盐含氟表面活性剂、烷基苯磺酸盐、烷基芳基醚磷酸盐、烷基醚磷酸盐、烷基羧酸盐、月桂酰肌氨酸钠、羧酸盐含氟表面活性剂、胆酸钠和脱氧胆酸钠组成的组中的1种以上阴离子表面活性剂。
27.根据权利要求25所述的试剂盒，其中，所述阴离子表面活性剂为烷基硫酸盐。
28.根据权利要求27所述的试剂盒，其中，所述烷基硫酸盐为十二烷基硫酸钠或十二烷基硫酸铵。
29.根据权利要求21～28中任一项所述的试剂盒，其还包含试剂盒的操作步骤说明书。
技术总结