本发明涉及植物组学领域，具体地涉及一种利用质谱技术结合化学计量学模式识别技术判别道地药材特异性标志物并以此证明药材道地性的方法。
背景技术：
道地药材，是指药材质优效佳，这一概念源于生产和中医临床实践，数千年来被无数的中医临床实践所证实，是源于古代的一项辨别优质中药材质量的独具特色的综合标准，也是中药学中控制药材质量的一项独具特色的综合判别标准。通俗的认为，道地药材就是指在一特定自然条件和生态环境的区域内所产的药材，并且生产较为集中，具有一定的栽培技术和采收加工方法，质优效佳，为中医临床所公认。
近来，科技人员对药材的道地性进行了大量的研究，所采用的方法，如组学、指纹图谱、红外光谱、电子鼻，乃至遗传信息研究，但是目前很多药材的道地性研究依旧停留在“货真”层面，甚至传统道地产区的“质优”都受到一定程度的挑战。
由于现有的道地药材的识别缺少定量分析的基础，所以药材的药理研究和掺假预防缺乏科学依据。发现新的生物标志物构成的植物，生物以及医学研究的基本部分，具有良好的生物标记物的特征在于高灵敏度(识别真阳性)和特异性(识别真阴性)，能够提供明确的确认/排除信息。超高效液相色谱与高分辨质谱联用(uhplc-hrms)是此类分析的有力工具。
鉴于现有的问题，亟待解决的问题是提供一种方法来确定道地药材和非道地药材之间的特异性标志物和差异性标记物，对道地药材和非道地药材加以区分。
技术实现要素：
根据本申请的一个方面，提供了一种利用质谱技术识别道地药材特异性标志物和差异性标志物及判断道地药材的方法，所述方法至少包括以下步骤：
(1)选取不同产地的道地药材样品和非道地药材样品，制备得到质谱待测溶液；
(2)采集所述待测溶液的质谱数据；
(3)提取步骤(2)中的质谱数据，生成所述道地药材样品和所述非道地药材样品的成分的峰强度表，并对得到的数据进行归一化处理；
(4)基于vip-plot和t-检验方法来筛选所述道地药材中的特异性标志物，并对所述特异性标志物进行ms-ms分析，将所得的ms-ms数据与步骤(2)中的数据库进行比较，鉴定所述特异性标志物；
(5)重复步骤(1)至(3)来获取未知药材的质谱数据，基于步骤(4)中的所述特异性标志物，通过建立人工神经网络或roc曲线等预测模型来判断所述未知药材是否为所述道地药材。
在优选的实施方式中，所述步骤(3)还包括数据预处理的步骤：将所述质谱数据进行峰对齐和特征峰合并，排除同位素分布为100的特征，对峰的离子特征的tr和m/z值进行校准。
在优选的实施方式中，所述数据预处理的步骤通过progenesisqi软件进行。
在优选的实施方式中，在步骤(3)的归一化处理后，还包括主成分分析和偏最小二乘判别分析的步骤：
通过所述主成分分析检查数据集的内在变异；
通过所述偏最小二乘判别分析，从数据中提取特异性化合物的最大信息。
在优选的实施方式中，所述人工神经网络是多层感知器的人工神经网络模型。
在优选的实施方式中，在步骤(4)选出满足vip值大于1.0和t检验中p<0.05的化合物作为所述特异性标志物。
在优选的实施方式中，所述步骤(1)包括：
将不同产地的药材进行研磨，加入体积比为70:30的甲醇/水提取液，进行代谢物提取；
将样品匀浆、离心取上清液加入内标物。
在优选的实施方式中，所述内标物为5-氟尿嘧啶、没食子酸、原儿茶酸、3-硝基苯酚、对叔丁基苯酚和2,4-二叔丁基苯酚的混合物。
在优选的实施方式中，所述提取液与所述内标物的体积比为4：1。
在优选的实施方式中，所述不同产地的药材与所述提取液的体积比为1：5-30。
本申请能产生的有益效果包括：
1.本发明使用液质联用为分析检测手段，适合于复杂体系的分离分析，提高了样品的分析通量，灵敏度、分离度和分析速度，有助于目标化合物与竞争性电离杂质的分离，从而减弱离子抑制作用。
2.本发明通过模式识别方法，对道地药材和非道地药材进行了整体分析，建立了可靠的方法来确定特异性标志物和差异标志物，并且验证特异性标志物和差异标志物在道地药材和非道地药材中的存在情况，证明它们的独特性和差异性。
3.使用特征标志物建立的人工神经网络模型，在经过充分的训练之后可以准确区分道地和非道地药材样品。神经网络判别模型对预测药材具有较高的准确性。
4.上述差异性标志物将适用于药材在加工过程中的质量控制，从而有助于了解这种草药的药理活性，为药理研究和掺假预防提供科学依据，同时可以科学指导中药材的引种和扩种，实现道地药材的可持续发展。
5.本发明所建立的发现药材的生物标志物的通用技术体系，可辐射应用到植物和微生物代谢组学分析、食品安全代谢组学分析等领域。
附图说明
图1-1和1-2分别显示了在负离子模式下获得的道地枸杞样品和非道地枸杞样品的总离子流图色谱(tic)；
图2-1为道地枸杞和非道地枸杞的pca聚类图；图2-2所示为道地枸杞和非道地枸杞的pls-da聚类图，图2-3所示交叉验证说明模型的可靠性，这意味着道地枸杞和非道地枸杞有显著差异；
图3为标志物m/z301.0353的提取色谱图，在道地枸杞样本中峰强度高，在非道地枸杞中峰强度低，且差异明显，是道地枸杞与非道地枸杞间的差异标志物。
具体实施方式
下面结合实施例详述本申请，但本申请并不局限于这些实施例。
本发明的实施例利用质谱技术判别道地药材的特异性标志物和差异性标志物并以此证明药材道地性的方法，该方法包括下述步骤：
(1)道地药材和非道地药材的前处理；
(2)通过液质联用对道地药材和非道地药材进行非靶向分析，对其组分进行测定；
(3)数据处理软件提取分析数据并导入到代谢组学相关软件进行模式识别分析；
(4)数据进行挖掘来发现生物标志物；
(5)基于人工神经网络(anns)对药材进行判别分析；
上述的方法中，步骤(1)将不同产地的道地药材和非道地药材进行研磨，称量一定量的道地药材和非道地药材，并以1ml至100mg道地药材或非道地药材的比例加入甲醇/水(70：30，v/v)用于代谢物提取，将样品匀浆，置于1.5ml匀浆管中，加入匀浆磁珠6个，匀浆机匀浆两次，每次持续30s，两次匀浆之间间隔5s，12000rpm离心15min，取40μl上清液加入进样瓶待测，加入10μl内标待测。
上述的方法中，步骤(2)流动相a为浓度为0.5％的醋酸水，b为乙腈。色谱柱为db-5ms，液相系统为agilent1290lc(agilenttechnologies，waldbronn，germany)，色谱柱的规格为zorboxeclipseplusrrhdc18(150mm×3.6mm,1.8μm,agilent,usa)，在50℃-60℃下进行色谱分离。二元洗脱系统包含0.5％乙酸水溶液，梯度如下：0min:2％b,流速0.1ml/min；1min:2％b,流速0.3ml/min；15min:100％b,流速0.3ml/min；20min:100％b,流速0.3ml/min；20.1min:100％b,流速0.1ml/min；进样体积为1-5μl。
上述的方法中，质谱分析过程采用电喷雾离子源负离子模式进行检测；质谱参数如下：质谱仪采用电喷雾离子源负离子模式进行检测；质谱参数如下：毛细管电压为2800v-3000v，锥孔电压为80-150v，电喷雾气温度为340-360℃，数据采集范围在100-3000m/z。电喷雾气流量流量＝6.0-10l/min；离子源电压＝80v；二级质谱采取10-60ev的碰撞能量；每次扫描的采集时间为20-40秒。设置在线仪器的实时内标，以及加入到样品中的内标物的混合物用于校准实验数据。由软件进行数据采集。在线仪器的实时内标，m/z112.98和1033.9888以及样品加入的内标物，5-氟尿嘧啶，没食子酸，原儿茶酸，3-硝基苯酚，对叔丁基苯酚和2,4-二叔丁基苯酚的混合物用于校准实验数据。
上述的方法中，通过progenesisqi软件提取步骤(2)由超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱仪所采集到的数据，对数据进行预处理(包括对齐和特征合并)，排除同位素分布为100的特征(可能是噪音离子)，对离子特征的tr和m/z值进行校准,生成峰强度列表，progenesisqi参数如下：filiter:0.1-0.5；absoluteionintensity:100-2000。然后将得到的数据导入到metaboanalyst进行归一化处理，将标尺化后的数据进行主成分分析和偏最小二乘法-判别分析。主成分分析(pca)是一种无监督模式识别方法，最初用于检查数据集的内在变异；偏最小二乘判别分析(pls-da)是一种监督模式识别方法，用于从数据中提取有关判别特征/化合物的最大信息。使用交叉验证和置换测试来验证模型。模型的质量由rx2和q2值来描述。rx2定义为模型解释的数据中方差的比例，并指示拟合优度，q2定义为模型预测的数据方差比例，并指示可预测性，通过基于vip值来选择差异代谢物。
上述的方法中，对步骤(3)的数据进行挖掘来发现生物标志物。结合vip-plot和t-检验来选择道地药材和非道地药材中的差异标志物，并对标志物msms分析，搜索数据库，从而鉴定标志物。
建立多层感知器(mlp)的人工神经网络模型，将道地药材与非道地药材区分开。在人工神经网络模型中，随机选择训练集和测试集。
在以下的实施例中，选取道地枸杞和非道地枸杞为研究对象，应用本发明提供的方法来识别道地枸杞中的特异性标志物和差异性标志物，并判断未知枸杞是否为道地枸杞。
枸杞系茄科植物宁夏枸杞(lyciumbarbaruml.)的干燥成熟果实，具有抗氧化、抗衰老、免疫促进、抗肿瘤、神经保护、降低血糖和保肝活性，是一种常用药食两用中药，在我国宁夏、甘肃、青海、新疆、内蒙古等地多有种植。通常认为，产于宁夏中宁县的枸杞质量最优，该地区也是枸杞的道地产地。从而，在以下实施例中，将宁夏中宁县的枸杞定义为道地枸杞。
实施例1
1.枸杞的前处理：
将55个不同产地的枸杞进行研磨，称量100mg的枸杞，并以1ml至100mg枸杞的比例加入甲醇/水(70：30，v/v)用于代谢物提取，将样品匀浆，置于1.5ml匀浆管中，加入匀浆磁珠6个，匀浆机匀浆两次，每次持续30s，两次匀浆之间间隔5s，12000rpm离心15min，收集上清液，分别取40μl加入10μl的内标物(5-氟尿嘧啶，没食子酸，原儿茶酸，3-硝基苯酚，对叔丁基苯酚，和2,4-二叔丁基苯酚的混合物),混匀。
2.通过液质联用对枸杞进行非靶向分析，对其组分进行测定：
①超高相液相色谱测定步骤1获得样品成分及相对峰强度，色谱柱为db-5ms，液相系统为agilent1290lc(agilenttechnologies，waldbronn，germany)，色谱柱的规格为zorboxeclipseplusrrhdc18(150mm×3.6mm,1.8μm,agilent,usa)，在60℃下进行色谱分离。二元洗脱系统包含0.5％乙酸水溶液，梯度如下：0min:2％b,流速为0.1ml/min；1min:2％b,0.3ml/min；15min:100％b,0.3ml/min；20min:100％b,0.3ml/min；20.1min:100％b,0.1ml/min。
②agilent1290lc连接电喷雾离子化(esi)的agilent6520q-tof质谱仪(agilenttechnologies，santaclara，ca，usa)，采集模式为负离子模式。质谱参数如下：毛细管电压为2800v，锥孔电压为80v，电喷雾气温度为350℃，数据采集范围在100-2000m/z。电喷雾气流量流量＝8.0l/min；离子源电压＝80v；二级质谱采取30ev的碰撞能量；每次扫描的采集时间为30秒。设置在线仪器的实时内标，以及加入到样品中的内标物的混合物用于校准实验数据。由软件进行数据采集。在线仪器的实时内标，m/z112.98和1033.9888以及样品加入的内标物，5-氟尿嘧啶，没食子酸，原儿茶酸，3-硝基苯酚，对叔丁基苯酚，和2,4-二叔丁基苯酚的混合物用于校准实验数据。
3.progenesisqi软件提取分析数据并导入到metaboanalyst进行主成分分析；
①通过uhplc-q-tof-ms分析枸杞样品(共55个)，分析时间为16min,对(tr)和m/z值进行校准,生成峰强度列表，使用progenesisqi参数：filiter:0.1；absoluteionintensity:1000。对数据进行预处理(包括对齐和特征合并)，排除同位素分布为100的特征(可能是噪音离子)。
②进行多变量统计学分析，用于发现道地枸杞和非道地枸杞的差异标记物。主成分分析(pca)是一种无监督模式识别方法，最初用于检查数据集的内在变异；偏最小二乘判别分析(pls-da)是一种监督模式识别方法，用于从数据中提取有关判别特征/化合物的最大信息。使用交叉验证和置换测试来验证模型。模型的质量由rx2和q2值来描述。rx2定义为模型解释的数据中方差的比例，并指示拟合优度，q2定义为模型预测的数据方差比例，并指示可预测性。图2所示，道地枸杞与非道地枸杞显示出清晰的分类，这意味道地枸杞与非道地枸杞有显著差异。通过基于vip值和t检验来选择差异代谢物。
4.对数据进行挖掘来发现生物标志物
①上述步骤3得到的特征中，筛选同时满足vip>1且p<0.05的特征，共得到212个特征。
②分别将这些特征标志物提取色谱图和质谱图，验证可靠性，共筛选出10个差异离子，如表一所示。这10个特征表现为道地枸杞特征强度>非道地枸杞特征强度。如图3显示，为标志物m/z301.0353的提取色谱图，在道地枸杞样本中峰强度高，在非道地枸杞中峰强度低，且差异明显。
③为了证明这10个标记物的特异性，对50个批次的道地枸杞和非道地枸杞进行分析，差异明显。
表1：实施例1得到的10个潜在的道地枸杞与非道地枸杞间的差异化合物
5.未知枸杞的识别
采用与步骤1至3中相同的方法，对未知枸杞进行前处理、质谱分析以及质谱数据归一化处理等一系列步骤。使用生物标志物建立多层感知器(mlp)的人工神经网络模型。判断未知枸杞是否是道地枸杞。
人工神经网络分析具有良好的学习能力，在复杂系统中进行模式识别和分类。使用spss22软件(il，chicago，usa)，建立多层感知器(mlp)的人工神经网络模型，将道地枸杞和非道地枸杞区分开。
尽管上述实施例仅以道地枸杞和非道地枸杞为实验对象，构建了用于筛选和鉴定道地枸杞特异性的化合物的集合，并基于鉴定出的特异性标志物将道地枸杞与非道地枸杞加以区分，但是本领域技术人员应当知晓，本发明构思同样适用于其他道地药材的特异性标志物的鉴定，及其他道地药材和非道地药材划分的应用。
以上所述，仅是本申请的几个实施例，并非对本申请做任何形式的限制，虽然本申请以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本申请，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本申请技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于技术方案范围内。
1.一种利用质谱技术识别道地药材特异性标志物和差异性标志物及判断道地药材的方法，其特征在于，所述方法至少包括以下步骤：
(1)选取道地药材样品和非道地药材样品，制备得到质谱待测溶液；
(2)采集所述待测溶液的质谱数据；
(3)提取步骤(2)中的质谱数据，生成所述道地药材样品和所述非道地药材样品的成分的峰强度表，并对得到的数据进行归一化处理；
(4)基于vip-plot和t-检验方法来筛选所述道地药材中的特异性标志物，并对所述特异性标志物进行ms-ms分析，将所得的ms-ms数据与步骤(2)中的数据库进行比较，鉴定所述特异性标志物；
(5)重复步骤(1)至(3)来获取未知药材的质谱数据，基于步骤(4)中的所述特异性标志物，通过建立人工神经网络或roc曲线等预测模型来判断所述未知药材是否为所述道地药材。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)还包括数据预处理的步骤：将所述质谱数据进行峰对齐和特征峰合并，排除同位素分布为100的特征，对峰的离子特征的保留时间和m/z值进行校准。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述数据预处理的步骤通过progenesisqi软件进行。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(3)的归一化处理后，还包括主成分分析和偏最小二乘判别分析的步骤：
通过所述主成分分析检查数据集的内在变异；
通过所述偏最小二乘判别分析，从数据中提取特异性化合物的最大信息。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述人工神经网络是多层感知器的人工神经网络模型。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(4)选出满足vip值大于1.0和t检验中p<0.05的化合物作为所述特异性标志物。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)包括：
将不同产地的药材进行研磨，加入50％-70％的甲醇、乙醇、乙腈等提取液，进行代谢物提取；
将样品匀浆、离心取上清液加入内标物。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述内标物为5-氟尿嘧啶、没食子酸、原儿茶酸、3-硝基苯酚、对叔丁基苯酚和2,4-二叔丁基苯酚的混合物。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述提取液与所述内标物的体积比为4：1。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述不同产地的药材与所述提取液的体积比为1：5-30。
技术总结