本发明属于禽类致病微生物检测技术领域，具体涉及一种能同时检测禽流感病毒、新城疫病毒、禽传染性支气管炎病毒和鸡传染性喉气管炎病毒的方法，以及用于检测禽流感病毒、新城疫病毒、禽传染性支气管炎病毒、鸡传染性喉气管炎病毒的引物对和探针。
背景技术：
禽呼吸道疾病是影响我国养禽业的重要疾病，该类疫病会影响增重及饲料利用率，使产蛋率降低，胴体品质降级，甚至造成相当数量的死亡，影响了养禽的经济效益。临床表现流泪、流鼻涕、咳嗽或打喷嚏、喘气、啰音和呼吸困难等。解剖发现绝大多数病死禽有两种或两种以上的病变，多以喉头和气管发炎较多，常见气囊增厚、气囊炎、支气管肺炎、化脓性肺炎和多发性浆膜炎等。
禽的呼吸道疾病在养禽生产中比较复杂，疾病的种类很多。其中，发病较严重、发病率较高的，主要有禽流感、新城疫、禽传染性支气管炎和鸡传染性喉气管炎。这四种疫病是影响我国养禽业发展的重要病毒性传染病，其发生往往会给养禽业带来巨大的经济损失。
这四种疫病的临床症状和病理变化极为相似，通过临床诊断很难进行鉴别诊断和确诊，必须经过实验室检测确定引发疫病的病原。传统的诊断技术主要针对单一病原进行检测。即使有一些多重检测的方法，也无法涵盖各类病原在我国所有的流行基因型和亚型，检测的敏感性和特异性也不理想。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种同时检测禽流感病毒、新城疫病毒、禽传染性支气管炎病毒、鸡传染性喉气管炎病毒的荧光定量rt-pcr检测方法，以实现对禽呼吸道传染性疾病进行安全、特异、灵敏、快速、方便的检测。
本发明首先提供一种同时检测禽流感病毒、新城疫病毒、禽传染性支气管炎病毒、鸡传染性喉气管炎病毒的引物对和探针组，分别是鉴定禽流感病毒的引物对aivforward、aivreverse和探针aivprobe，鉴定新城疫病毒的引物对ndvforward、ndvreverse和探针ndvprobe，鉴定禽传染性支气管炎病毒的引物对ibvforward、ibvreverse和探针ibvprobe，鉴定鸡传染性喉气管炎病毒的引物对iltvforward、iltvreverse和探针iltvprobe，所有引物对和探针序列信息如下：
禽流感病毒检测正向引物aivforward：
5′-tggartggmtaaagacaagaccaat-3′(seqidno:1)
禽流感病毒检测反向引物aivreverse：
5′-gcrttytggacaaascgtctacgc-3′(seqidno:2)
禽流感病毒检测探针aivprobe：
5′-ctgcagtcctcgctcactgg-3′(seqidno:3)
新城疫病毒检测正向引物ndvforward：
5′-ctcagtgatgtgctyggacc-3′(seqidno:4)
新城疫病毒检测反向引物ndvreverse：
5′-tccagagtatcttrgcmacctg-3′(seqidno:5)
新城疫病毒检测探针ndvprobe：
5′-ttctcwagcagygggacagcct-3′(seqidno:6)
禽传染性支气管炎病毒检测正向引物ibvforward：
5′-ttgaaggtagyggygttcctga-3′(seqidno:7)
禽传染性支气管炎病毒检测反向引物ibvreverse：
5′-cagmaacccacactataccatc-3′(seqidno:8)
禽传染性支气管炎病毒检测探针ibvprobe：
5′-acwggaacaggaccdgccgctgacct-3′(seqidno:9)
鸡传染性喉气管炎病毒检测正向引物iltvforward：
5′-cattacatatttgaacgccagc-3′(seqidno:10)
鸡传染性喉气管炎病毒检测反向引物iltvreverse：
5′-catttctttctaacccgttcg-3′(seqidno:11)
鸡传染性喉气管炎病毒检测探针iltvprobe：
5′-ccgctatcccaattccgagtg-3′(seqidno:12)
其中，禽流感病毒检测探针aivprobe针的5′端进行羧基荧光素rox标记，3′端进行淬灭基团bhq2标记；
新城疫病毒检测探针ndvprobe5′端进行羧基荧光素fam标记，3′端进行淬灭基团bhq1标记；
传染性支气管炎病毒检测ibvprobe5′端进行羧基荧光素hex标记，3′端进行淬灭基团bhq1标记；
鸡传染性喉气管炎病毒检测iltvprobe5′端进行羧基荧光素cy5标记，3′端进行淬灭基团bhq2标记。
上述的引物对和探针用于制备荧光rt-pcr检测试剂盒；
本发明再一个方面提供检测临床样品中禽流感病毒、新城疫病毒、禽传染性支气管炎病毒、鸡传染性喉气管炎病毒的四重荧光rt-pcr检测方法，包括如下的步骤：
1)配制荧光定量rt-pcr反应体系
反应液每管50μl，含有2×onesteprt-pcrbufferⅲ25.0μl，5u/μltakaraextaqhs1.0μl，primescriptrtenzymemixⅱ1.0μl，10pmol/μlaivforward、aivreverse和aivprobe各1.0μl，10pmol/μlndvforward、ndvreverse和ndvprobe各1.0μl，10pmol/μlibvforward、ibvreverse和ibvprobe各1.0μl，10pmol/μliltvforward、iltvreverse和iltvprobe各1.0μl，rnasefreedh2o7.0μl，待检测的样品rna模板4μl；
2)荧光定量rt-pcr反应体系扩增
将检测反应条件设置为：第一阶段，42℃/5min；第二阶段，95℃/10s，第三阶段，95℃/5s，60℃/20s收集荧光，40个循环。保存文件，运行；
3)结果判定
结果分析条件设定：读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，不同仪器可对阈值线的位置进行调整，然后读取检测结果；
质控标准:阴性对照无ct值并且无扩增曲线；阳性对照的ct值应≤36.0，并出现特定的扩增曲线；如阴性对照和阳性条件不满足以上条件，此次实验视为无效；
结果描述及判定如下:禽流感病毒、新城疫病毒、禽传染性支气管炎病毒和鸡传染性喉气管炎病毒的探针分别标记了rox荧光、fam荧光、hex荧光和cy5荧光；如果无ct值并且无荧光扩增曲线，样品判为四种病毒均为阴性；如果出现其中一种荧光扩增曲线，且ct值≤36，则判定为该荧光对应的病毒阳性，其他三种病毒阴性；如果出现多种荧光扩增曲线，且ct值均≤36，则判定为该这几种荧光对应的病毒均为阳性，其余病毒为阴性。
本发明提供一种基于分子生物学的快速检测禽流感病毒、新城疫病毒、禽传染性支气管炎病毒、鸡传染性喉气管炎病毒的四重荧光rt-pcr检测方法，以实现对禽流感病毒、新城疫病毒、禽传染性支气管炎病毒、鸡传染性喉气管炎病毒这四种常见禽呼吸道疾病进行安全、特异、快速、灵敏、简单、高通量的快速检测，从而弥补现有传统检测技术的不足。并且此方法非常适用于高通量检测，能够同时检测大量样品并快速判定结果，而且使用taqman荧光探针，避免传统sybrgreen染色法造成的污染和低特异性。
附图说明
图1：禽流感病毒的实时荧光rt-pcr优化的引物和探针设计示意图，其中引物由方框圈出，探针由斜体并加下划线表示；
图2：新城疫病毒的实时荧光rt-pcr优化的引物和探针设计示意图，其中引物由方框圈出，探针由斜体并加下划线表示；
图3：禽传染性支气管炎病毒的实时荧光rt-pcr优化的引物和探针设计示意图，其中引物由方框圈出，探针由斜体并加下划线表示；
图4：鸡传染性喉气管炎病毒的实时荧光rt-pcr优化的引物和探针设计示意图，其中引物由方框圈出，探针由斜体并加下划线表示；
图5：禽流感病毒检测方法对应引物和探针的灵敏度的检测结果图，从左到右依次为10-1ng/μl，10-2ng/μl，10-3ng/μl，10-4ng/μl，10-5ng/μl，10-6ng/μl，由图可知禽流感病毒检测的灵敏度为10-5ng/μl；
图6：新城疫病毒检测方法对应引物和探针的灵敏度的检测结果图，从左到右依次为10-1ng/μl，10-2ng/μl，10-3ng/μl，10-4ng/μl，10-5ng/μl，10-6ng/μl，由图可知新城疫病毒检测的灵敏度为10-6ng/μl；
图7：禽传染性支气管炎病毒检测方法对应引物和探针的灵敏度的检测结果图，从左到右依次为10-1ng/μl，10-2ng/μl，10-3ng/μl，10-4ng/μl，10-5ng/μl，10-6ng/μl，由图可知传染性支气管炎病毒检测的灵敏度为10-5ng/μl；
图8：鸡传染性喉气管炎病毒检测方法对应引物和探针的灵敏度的检测结果图，从左到右依次为10-1ng/μl，10-2ng/μl，10-3ng/μl，10-4ng/μl，10-5ng/μl，10-6ng/μl，由图可知鸡传染性喉气管炎病毒检测的灵敏度为10-6ng/μl；
图9：本发明引物和探针的特异性检测结果图。
具体实施方式
实时荧光定量pcr(quantitativereal-timepcr)是在pcr定性技术基础上发展起来的核酸定量技术。它是一种在pcr反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个pcr进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技术不仅实现了对dna模板的定量，而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点，目前已广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领域。多重pcr也称复合pcr，是在一个反应体系中加入一对以上引物，各对引物分别结合在模板相对应部分，最终扩增出一条以上目的片段。多重pcr扩增原理与单重pcr相同，但并不是简单地将多对特异性引物混合成一个反应体系，需要考虑到每对引物之间的相互配合，包括引物特异性、引物长度、退火温度及引物结构设计等因素。
本发明是检测禽流感病毒、新城疫病毒、禽传染性支气管炎病毒和鸡传染性喉气管炎病毒的四重荧光rt-pcr反应，这四种病毒均可以引起禽的呼吸道疾病，但由于病毒不断进化，每种病毒又各自有多个基因型，因此，在进行分子生物学检测时，要选择特异性较好同时在病毒基因型之间差异较小的保守区域作为设计检测引物和探针的模板，这样既可以避免在检测时各病毒之间出现非特异性反应，同时还可以检测出病毒的各个基因型。禽流感病毒选择m基因保守区域设计引物和探针，新城疫病毒选择m基因保守区域设计引物和探针，禽传染性支气管炎病毒选择n基因保守区域设计引物和探针，鸡传染性喉气管炎病毒选择gb/ul27基因保守区域设计引物和探针。
本发明在对大量检测引物对和探针筛查、组合和试验的基础上，建立简单、快速、敏感性高、特异性好的四重荧光pcr检测方法，其能在一个检测反应中同时检测禽流感病毒、新城疫病毒、禽传染性支气管炎病毒和鸡传染性喉气管炎病毒4种对我国养禽业影响巨大的禽呼吸道疾病病原，能够满足我国养禽业的快检检测需求。
下面结合实施例对本发明进行详细的描述。
实施例1：引物及探针设计与筛选
从ncbi数据库中查找并下载1641条公开的，包含目前已报到的禽流感病毒流行亚型的m基因序列，根据基因比对分析保守区域，经同源性分析后，以位于124-275的碱基(参考序列genbank登录号ku042441)为目的片段设计上游引物、下游引物和探针，进行组合筛选最佳引物和探针(图1)。
从ncbi数据库中查找并下载899条公开的包含目前已报到的新城疫病毒的m基因序列，根据基因比对分析保守区域，经同源性分析后，以位于764-950的碱基(参考序列genbank登录号：ku665481)为目的片段设计上游引物、下游引物和探针，进行组合筛选最佳引物和探针(图2)。
从ncbi数据库中查找并下载306条公开的包含目前已报到的禽传染性支气管炎病毒的n基因序列，根据基因比对分析保守区域，经同源性分析后，以位于151-480的碱基(参考序列genbank登录号：kj425486)为目的片段设计上游引物、下游引物和探针，进行组合筛选最佳引物和探针(图3)。
从ncbi数据库中查找并下载44条公开的包含目前已报到的鸡传染性喉气管炎病毒的gb/ul27基因序列，根据基因比对分析保守区域，经同源性分析后，以位于296-470的碱基(参考序列genbank登录号：mf417811)为目的片段设计上游引物、下游引物和探针，进行组合筛选最佳引物和探针(图4)。
分别对禽流感病毒、新城疫病毒、禽传染性支气管炎病毒和鸡传染性喉气管炎病毒的引物对和探针进行筛选，包括如下步骤
1)配制荧光定量rt-pcr反应体系
反应液每管25μl，含有2×onesteprt-pcrbufferⅲ12.5μl，5u/μltakaraextaqhs0.5μl，primescriptrtenzymemixⅱ0.5μl，10pmol/μlforward、reverse和probe各0.5μl，rnasefreedh2o8μl，待检测的样品rna模板2μl。
2)荧光定量rt-pcr反应体系扩增
将检测反应条件设置为：第一阶段，42℃/5min；第二阶段，95℃/10s，第三阶段，95℃/5s，60℃/20s(收集荧光)，40个循环。保存文件，运行。
3)结果判定
结果分析条件设定：读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，不同仪器可对阈值线的位置进行调整，然后读取检测结果。
质控标准:阴性对照无ct值并且无扩增曲线；阳性对照的ct值应≤36.0，并出现特定的扩增曲线；如阴性对照和阳性条件不满足以上条件，此次实验视为无效。
结果描述及判定:禽流感病毒、新城疫病毒、禽传染性支气管炎病毒和鸡传染性喉气管炎病毒的探针分别标记了rox荧光、fam荧光、hex荧光和cy5荧光。如果无ct值并且无荧光扩增曲线，样品判为四种病毒均为阴性；如果出现其中一种荧光扩增曲线，且ct值≤36，则判定为该荧光对应的病毒阳性，其他三种病毒阴性；如果出现多种荧光扩增曲线，且ct值均≤36，则判定为该这几种荧光对应的病毒均为阳性，其余病毒为阴性。
相同反应条件，同时用禽流感病毒、新城疫病毒、禽传染性支气管炎病毒和鸡传染性喉气管炎病毒核酸为模板，分别对禽流感病毒、新城疫病毒、禽传染性支气管炎病毒和鸡传染性喉气管炎病毒检测引物和探针进行筛选验证，确保筛选出的引物探针只能检测出与之相对应的病毒核酸，避免在同一个体系中出现交叉扩增反应。通过筛选和验证，最终确定的引物和探针的序列信息如下：
禽流感病毒检测正向引物aivforward：
5′-tggartggmtaaagacaagaccaat-3′(seqidno:1)
禽流感病毒检测反向引物aivreverse：
5′-gcrttytggacaaascgtctacgc-3′(seqidno:2)
禽流感病毒检测探针aivprobe：
5′-ctgcagtcctcgctcactgg-3′(seqidno:3)
新城疫病毒检测正向引物ndvforward：
5′-ctcagtgatgtgctyggacc-3′(seqidno:4)
新城疫病毒检测反向引物ndvreverse：
5′-tccagagtatcttrgcmacctg-3′(seqidno:5)
新城疫病毒检测探针ndvprobe：
5′-ttctcwagcagygggacagcct-3′(seqidno:6)
禽传染性支气管炎病毒检测正向引物ibvforward：
5′-ttgaaggtagyggygttcctga-3′(seqidno:7)
禽传染性支气管炎病毒检测反向引物ibvreverse：
5′-cagmaacccacactataccatc-3′(seqidno:8)
禽传染性支气管炎病毒检测探针ibvprobe：
5′-acwggaacaggaccdgccgctgacct-3′(seqidno:9)
鸡传染性喉气管炎病毒检测正向引物iltvforward：
5′-cattacatatttgaacgccagc-3′(seqidno:10)
鸡传染性喉气管炎病毒检测反向引物iltvreverse：
5′-catttctttctaacccgttcg-3′(seqidno:11)
鸡传染性喉气管炎病毒检测探针iltvprobe：
5′-ccgctatcccaattccgagtg-3′(seqidno:12)
其中，禽流感病毒检测探针aivprobe针的5′端进行羧基荧光素rox标记，3′端进行淬灭基团bhq2标记；新城疫病毒检测探针ndvprobe5′端进行羧基荧光素fam标记，3′端进行淬灭基团bhq1标记；传染性支气管炎病毒检测ibvprobe5′端进行羧基荧光素hex标记，3′端进行淬灭基团bhq1标记；鸡传染性喉气管炎病毒检测iltvprobe5′端进行羧基荧光素cy5标记，3′端进行淬灭基团bhq2标记。
实施例2：引物探针的检测灵敏度和特异性
1)检测灵敏度
分别设置7个不同浓度的禽流感病毒、新城疫病毒、禽传染性支气管炎病毒和鸡传染性喉气管炎病毒核酸模板，进行荧光定量rt-pcr最适条件下的扩增。
参照rna/dna提取试剂盒说明书提取禽流感病毒总核酸，测定所提取的rna/dna模板原始浓度，根据比例稀释至1ng/μl，再按照10倍梯度稀释成10-1ng/μl，10-2ng/μl，10-3ng/μl，10-4ng/μl，10-5ng/μl，10-6ng/μl，分别取2μl作为反应模板，按照前述加样方法进行实时荧光定量rt-pcr核酸扩增。
结果显示本发明设计的引物和探针组合能够保证检测时的灵敏性，禽流感病毒检测引物和探针的检测灵敏度为rna终浓度10-5ng/μl；新城疫病毒检测引物和探针的检测灵敏度为rna终浓度10-6ng/μl；禽传染性支气管炎病毒病毒检测引物和探针的检测灵敏度为rna终浓度10-5ng/μl；鸡传染性喉气管炎病毒检测引物和探针检测灵敏度为rna终浓度10-6ng/μl。
2)检测特异性
配制荧光定量rt-pcr反应体系：反应液每管50μl，含有2×onesteprt-pcrbufferⅲ25.0μl，5u/μltakaraextaqhs1.0μl，primescriptrtenzymemixⅱ1.0μl，10pmol/μlaivforward、aivreverse和aivprobe各1.0μl，10pmol/μlndvforward、ndvreverse和ndvprobe各1.0μl，10pmol/μlibvforward、ibvreverse和ibvprobe各1.0μl，10pmol/μliltvforward、iltvreverse和iltvprobe各1.0μl，rnasefreedh2o7.0μl，待检测的样品rna模板4μl。
选择6株禽流感病毒(h1亚型禽流感病毒1株，h3亚型禽流感病毒1株，h5亚型禽流感病毒1株，h6亚型禽流感病毒1株，h7亚型禽流感病毒4株，h9n2亚型禽流感病毒1株)、3株新城疫病毒(classⅰ1株，classⅱ2株)、3株禽传染性支气管炎病毒和1株鸡传染性喉气管炎病毒的核酸为模板。检测反应条件设置为：第一阶段，42℃/5min；第二阶段，95℃/10s，第三阶段，95℃/5s，60℃/20s(收集荧光)，40个循环。
结果显示，6株禽流感病毒核酸模板对应的通道仅出现了rox荧光检测曲线，3株新城疫病毒核酸模板对应的通道仅出现了fam荧光检测曲线，3株禽传染性支气管炎病毒核酸模板对应的通道仅出现了hex荧光检测曲线，1株鸡传染性喉气管炎病毒核酸模板对应的通道仅出现了cy5荧光检测曲线。结果表明，本实验筛选的引物和探针通过四重荧光rt-pcr方法检测禽流感病毒、新城疫病毒、禽传染性支气管炎病毒鸡传染性喉气管炎病毒的特异性强，相互之间没有交叉反应，可以对这4种禽常见呼吸道病毒进行有效地进行鉴别检测。
实施例3：对实际样品的检测应用
1.样品采集：
采集3个活禽批发市场的各类家禽的咽拭子样品共90份。采用pbs液(ph7.0～7.4，0.01mol/l)作为保存液(含青霉素2000iu/ml、链霉素2000iu/ml、制霉菌素1000iu/ml，bsa5mg/ml)。样品采集后置于加冰的保温箱中密封，24h内送至实验室进行处理或置于-70℃保存。
2.样品制备
将棉拭子置于装有1ml样品保存液的离心管中，涡旋混匀后，4℃10000r/min离心5min，取上清进行核酸提取。
3.核酸提取
参照rna提取试剂盒说明书提取待检的90份临床样品、阳性对照和阴性对照rna。提取的rna须在2h内进行rt-pcr扩增，长时间保存，须置于-70℃条件下。
4.鉴定
4.1对比方法
参考国家标准《gb/t19438.1-2004禽流感病毒通用荧光rt-pcr检测方法》中的荧光rt-pcr检测方法，作为禽流感病毒的对比检测方法。根据标准中所注购买了深圳匹基生物工程股份有限公司生产的禽流感病毒通用型荧光rt-pcr检测试剂盒。参考国家标准《gb/t16550-2008新城疫诊断技术》中的rt-pcr检测方法，作为新城疫病毒的对比检测方法。参考国家标准《gb/t23197-2008鸡传染性支气管炎诊断技术》中的rt-pcr检测方法，作为禽传染性支气管炎病毒的对比检测方法。参考赵妍等建立的鸡传染性喉气管炎病毒taqmanreal-timepcr检测方法，作为鸡传染性喉气管炎病毒的对比检测方法。
4.2样品检测
采用对比方法和本发明方法，同时检测此临床样品。
4.3检测结果
结果显示，采用国标方法鉴定时是单重荧光rt-pcr，结果显示其中15份样品在禽流感病毒通用荧光检测通道和h9亚型禽流感病毒荧光检测通道出现荧光信号，判定为h9亚型禽流感病毒阳性，其余样品均没有荧光信号，h5亚型禽流感病毒荧光检测通道和h7亚型禽流感病毒荧光检测通道均没有荧光信号；采用本发明中的方法鉴定结果为同样的15份样品同时出现了rox荧光信号和cy5荧光信号，没有fam荧光信号和hex荧光信号，判定为h9亚型禽流感病毒阳性，其余样品均没有荧光信号；阳性对照组两种方法均出现相应的荧光信号，结果准确可信。
综上所述，这90份临床样品中，其中15份样品判定为h9亚型禽流感病毒阳性，其余样品均为禽流感病毒阴性。本发明中的方法可以快速、准确的鉴定禽流感病毒，并同时对h5亚型、h7亚型和h9亚型禽流感病毒进行分型检测，满足了当前对于禽流感病毒检测的需求，为禽流感病毒监测发挥重要作用。
序列表
<110>中国动物卫生与流行病学中心
<120>一种检测四种主要禽呼吸道症候群病毒的方法
<160>12
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>25
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
tggartggmtaaagacaagaccaat25
<210>2
<211>24
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
gcrttytggacaaascgtctacgc24
<210>3
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
ctgcagtcctcgctcactgg20
<210>4
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>4
ctcagtgatgtgctyggacc20
<210>5
<211>22
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>5
tccagagtatcttrgcmacctg22
<210>6
<211>22
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>6
ttctcwagcagygggacagcct22
<210>7
<211>22
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>7
ttgaaggtagyggygttcctga22
<210>8
<211>22
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>8
cagmaacccacactataccatc22
<210>9
<211>26
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>9
acwggaacaggaccdgccgctgacct26
<210>10
<211>22
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>10
cattacatatttgaacgccagc22
<210>11
<211>21
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>11
catttctttctaacccgttcg21
<210>12
<211>21
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>12
ccgctatcccaattccgagtg21
1.一种同时检测禽流感病毒、新城疫病毒、禽传染性支气管炎病毒、鸡传染性喉气管炎病毒的引物对和探针组，其特征在于，所述的引物对和探针组的序列信息如下：
禽流感病毒检测正向引物aivforward的序列为seqidno:1、
禽流感病毒检测反向引物aivreverse的序列为seqidno:2、
禽流感病毒检测探针aivprobe的序列为seqidno:3；
新城疫病毒检测正向引物ndvforward的序列为seqidno:4、
新城疫病毒检测反向引物ndvreverse的序列为seqidno:5、
新城疫病毒检测探针ndvprobe的序列为seqidno:6；
禽传染性支气管炎病毒检测正向引物ibvforward的序列为seqidno:7、
禽传染性支气管炎病毒检测反向引物ibvreverse的序列为seqidno:8、
禽传染性支气管炎病毒检测探针ibvprobe的序列为seqidno:9；
鸡传染性喉气管炎病毒检测正向引物iltvforward的序列为seqidno:10、
鸡传染性喉气管炎病毒检测反向引物iltvreverse的序列为seqidno:11、
鸡传染性喉气管炎病毒检测探针iltvprobe的序列为seqidno:12。
2.如权利要求1所述的引物对和探针组，其特征在于，所述的检测禽流感病毒、新城疫病毒、禽传染性支气管炎病毒、鸡传染性喉气管炎病毒的探针的5′端用不同的羧基荧光素进行标记；3′端用不同的淬灭基团进行标记。
3.如权利要求2所述的引物对和探针组，其特征在于，所述的禽流感病毒检测探针aivprobe针的5′端进行羧基荧光素rox标记，3′端进行淬灭基团bhq2标记。
4.如权利要求2所述的引物对和探针组，其特征在于，所述的新城疫病毒检测探针ndvprobe5′端进行羧基荧光素fam标记，3′端进行淬灭基团bhq1标记。
5.如权利要求2所述的引物对和探针组，其特征在于，所述的传染性支气管炎病毒检测ibvprobe5′端进行羧基荧光素hex标记，3′端进行淬灭基团bhq1标记。
6.如权利要求2所述的引物对和探针组，其特征在于，所述的鸡传染性喉气管炎病毒检测iltvprobe5′端进行羧基荧光素cy5标记，3′端进行淬灭基团bhq2标记。
7.权利要求1-6任一项所述的引物对和探针组在制备检测禽流感病毒、新城疫病毒、禽传染性支气管炎病毒、鸡传染性喉气管炎病毒的试剂盒中的应用。
8.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的试剂盒为荧光rt-pcr检测试剂盒。
9.一种荧光rt-pcr检测试剂盒，其特征在于，所述的荧光rt-pcr检测试剂盒中包含有权利要求1-6任一项所述的引物对和探针组。
10.一种检测临床样品中禽流感病毒、新城疫病毒、禽传染性支气管炎病毒、鸡传染性喉气管炎病毒的四重荧光rt-pcr检测方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：
1)配制荧光定量rt-pcr反应体系
反应液每管50μl，含有2×onesteprt-pcrbufferⅲ25.0μl，5u/μltakaraextaqhs1.0μl，primescriptrtenzymemixⅱ1.0μl，10pmol/μlaivforward、aivreverse和aivprobe各1.0μl，10pmol/μlndvforward、ndvreverse和ndvprobe各1.0μl，10pmol/μlibvforward、ibvreverse和ibvprobe各1.0μl，10pmol/μliltvforward、iltvreverse和iltvprobe各1.0μl，rnasefreedh2o7.0μl，待检测的样品rna模板4μl；
2)荧光定量rt-pcr反应体系扩增
将检测反应条件设置为：第一阶段，42℃/5min；第二阶段，95℃/10s，第三阶段，95℃/5s，60℃/20s收集荧光，40个循环；保存文件，运行；
3)结果判定
结果分析条件设定：读取检测结果，阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，不同仪器可对阈值线的位置进行调整，然后读取检测结果；
质控标准:阴性对照无ct值并且无扩增曲线；阳性对照的ct值应≤36.0，并出现特定的扩增曲线；如阴性对照和阳性条件不满足以上条件，此次实验视为无效；
结果描述及判定如下:禽流感病毒、新城疫病毒、禽传染性支气管炎病毒和鸡传染性喉气管炎病毒的探针分别标记了rox荧光、fam荧光、hex荧光和cy5荧光；如果无ct值并且无荧光扩增曲线，样品判为四种病毒均为阴性；如果出现其中一种荧光扩增曲线，且ct值≤36，则判定为该荧光对应的病毒阳性，其他三种病毒阴性；如果出现多种荧光扩增曲线，且ct值均≤36，则判定为该这几种荧光对应的病毒均为阳性，其余病毒为阴性。
技术总结