本发明涉及流感病毒分型技术领域，尤其是涉及一种流感病毒血凝素亚型分型引物、试剂盒和分型方法。
背景技术：
流感病毒(influenzavirus)为正粘病毒科(orthomyxoviridae)流感病毒属，根据流感病毒的核壳蛋白和基质蛋白抗原性的不同有甲(a)、乙(b)和丙(c)三个血清型，其中，只有甲、乙两型流感病毒对人类具有流行病学意义。流感病毒的基因组由8条单股负链的rna组成，主要的抗原决定簇是血凝素(haemagglutinin，ha)和神经氨酸酶(neuraminidase，na)两种跨膜糖蛋白。
每个ha分子由ha1和ha2两个亚单位经二硫键连接组成。ha裂解为ha1和ha2是病毒感染细胞的先决条件，也是决定病毒致病力高低的重要因素之一。目前发现16种不同的ha血清亚型，不同亚型间氨基酸差异显著，且一般不会出现血清学交叉反应。ha是流感病毒中突变率最高的蛋白，除了组成受体结合位点的氨基酸外，整个ha分子都是高度变异的，只要几个氨基酸的突变就会导致病毒逃避宿主的免疫系统。流感病毒的抗原性和致病性很大程度上取决于ha的变异情况，使得ha成为病毒变异、毒力和宿主特异性的主要决定因素，与流感的流行暴发和疫苗防控有着密切关系。
流感病毒的变异除了rna病毒固有的突变、同源重组、非同源重组、基因组重配等，还包括抗原漂变等形式，所以一般ha亚型的分型技术有效周期短，需要进行周期性的更新以保证结果的准确性。因此，有必要提出一组能够长期有效对流感病毒血凝素亚型进行分型的引物。
技术实现要素：
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种流感病毒血凝素亚型分型引物、试剂盒和分型方法。
第一方面，本发明的一个实施例提供了一种流感病毒血凝素亚型分型引物，包括核苷酸序列如下的特异性引物对中的至少一对：
针对流感病毒血凝素h1亚型的特异性引物对：
h1-f：5′-aatgtracwgtracmcactcw-3′，
h1-r：5′-tcraaracctacacragrtta-3′；
针对流感病毒血凝素h2亚型的特异性引物对：
h2-f：5′-taycaycacagcaatgaycar-3′，
h2-r：5′-atrgtttadgaaccgdtadatrcgatgt-3′；
针对流感病毒血凝素h3亚型的特异性引物对：
h3-f：5′-atyactccaaatggaagcaty-3′，
h3-r：5′-cgactyctrtacccktta-3′；
针对流感病毒血凝素h4亚型的特异性引物对：
h4-f：5′-tgytayccatttgatgtg-3′，
h4-r：5′-gtycctatgttyctgtar-3′；
针对流感病毒血凝素h5亚型的特异性引物对：
h5-f：5′-gtbackgtyacacaygcy-3′，
h5-r：5′-gagtaccttttactytcttgagatctr-3′；
针对流感病毒血凝素h6亚型的特异性引物对：
h6-f：5′-tggtayggmtaycaycatgar-3′，
h6-r：5′-acraaacttaaraccgtrttyacr-3′；
针对流感病毒血凝素h7亚型的特异性引物对：
h7-f：5′-ttctatgcrgaratgaar-3′，
h7-r：5′-ccvttacastawttracc-3′；
针对流感病毒血凝素h8亚型的特异性引物对：
h8-f：5′-gagggratgtgytaycct-3′，
h8-r：5′-tcgtarttraccraytgrttyttc-3′；
针对流感病毒血凝素h9亚型的特异性引物对：
h9-f：5′-ggttggtatggdttccagcattca-3′，
h9-r：5′-cggaagrayaagacccggtac-3′；
其中，核苷酸序列中的r为a或g，y为c或t，m为a或c，k为g或t，s为g或c，w为a或t，b为g、t、c中的任一种，v为g、a、c中的任一种，d为g、a、t中的任一种。
本发明实施例的流感病毒血凝素亚型分型引物至少具有如下有益效果：
基于公开数据库的极大样本量(n>100000)，通过多序列比对的保守序列分析，所设计出的引物对能够长期有效应对流感病毒血凝素的基因漂变和基因突变等状况的发生，在一个较大的时间尺度上维持分型结果的有效性。
第二方面，本发明的一个实施例提供了一种上述流感病毒血凝素亚型分型引物在制备流感病毒分型试剂中的应用。通过这些分型引物的引入，分型试剂能够在长时间内保证分型结果的准确性而不必进行经常性的更新，避免人力物力等的浪费。
第三方面，本发明的一个实施例提供了一种用于流感病毒分型的试剂盒，该试剂盒包括上述的流感病毒血凝素亚型分型引物。通过使用上述分型引物，能够使试剂盒在长时间内对流感病毒的血凝素亚型进行有效的分型。
根据本发明的一些实施例的试剂盒，还包括阳性对照品和阴性对照品。通过阳性对照品和阴性对照品的设置，用于排除反应体系的污染等问题。阳性对照应当在扩增过程中能够完全扩增出引物对应的靶向基因片段，例如，可以是引物对应的靶向基因片段的质粒。阴性对照应当在扩增过程中无法获得特异性条带，例如，可以是depc水，即使用depc(焦碳酸二乙酯)处理过并经高温高压灭菌的无核酸超纯水。
根据本发明的一些实施例的试剂盒，还包括核酸提取试剂。通过相应的核酸提取试剂完成对样本中病毒核酸的提取以方便后续扩增检测程序的进行。
根据本发明的一些实施例的试剂盒，还包括酶液和缓冲液。酶液为包括热启动taqdna聚合酶的混合液，缓冲液为包括tris、mg2 、tritonx-100等在内组成的缓冲液，另外还包括dntps等。酶液和缓冲液的具体组成和配比为本领域技术人员所熟知并可根据实际需求进行调整，在此不再赘述。
第四方面，本发明的一个实施例提供了一种流感病毒的分型方法，包括以下步骤：
提取待测样品的总rna；
以样本的总rna为模板，用上述流感病毒血凝素亚型分型引物进行扩增；
扩增产物进行电泳检测，根据特异性条带的位置判断分型结果；
所述分型方法不用于疾病的诊断与治疗。
以上述分析引物进行分型，能够保证分型结果在长时间内的准确性。
根据本发明的一些实施例的分型方法，根据特异性条带的位置判断分型结果的方法为：
当1534bp处出现特异性条带时，待测样品为h1亚型；
当481bp处出现特异性条带时，待测样品为h2亚型；
当532bp处出现特异性条带时，待测样品为h3亚型；
当1243bp处出现特异性条带时，待测样品为h4亚型；
当1219bp处出现特异性条带时，待测样品为h5亚型；
当349bp处出现特异性条带时，待测样品为h6亚型；
当790bp处出现特异性条带时，待测样品为h7亚型；
当175bp处出现特异性条带时，待测样品为h8亚型；
当556bp处出现特异性条带时，待测样品为h9亚型。
根据本发明的一些实施例的分型方法，扩增的程序为90～95℃，2～4min；90～95℃，20～40s；50～65℃，20～60s，70～74℃，30～90s，30～40个循环；70～74℃，8～12min。
本发明实施例所公开的分型引物、分型试剂盒以及分型方法基于公开数据库的极大样本量(n>100000)，通过多序列比对的保守序列分析，所设计出的引物对能够长期有效应对流感病毒血凝素的基因漂变和基因突变等状况的发生，在一个较大的时间尺度上维持分型结果的有效性。
附图说明
图1～图9是本发明的一个实施例的流感病毒h1～h9亚型标准品扩增结果的电泳图。
图10是本发明的一个实施例的引物与样本的匹配结果。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例提供一种流感病毒血凝素亚型分型引物对。为保证引物在长时间内有效，发明人基于现有的极大样本量的数据库分析，数据库收录序列的时间跨度从1918年到2018年，超过100年的时间，基于数据库内各血凝素亚型的保守氨基酸序列计算，对保守氨基酸序列在核酸序列数据库中的定位，根据保守氨基酸序列对应的保守区域核酸序列的单核苷酸多态性分析，通过保守核酸序列的计算，基于保守核酸序列进行序列筛选，并设计响应的引物。引物的具体信息如下表1所示，各亚型模板注释信息如下表2所示。
表1.引物信息
其中，序列中的r为a或g，y为c或t，m为a或c，k为g或t，s为g或c，w为a或t，b为g、t、c中的任一种，v为g、a、c中的任一种，d为g、a、t中的任一种。
表2.血凝素各亚型注释
实施例2
本实施例提供一种用于流感病毒血凝素亚型分型的试剂盒，包括引物预混液、pcr反应预混液、阳性对照品、阴性对照品。
其中，引物预混液包括实施例1中的seqidno.1～18的引物。
pcr反应预混液包括酶液、缓冲液等，可以采用2×taqpcrmastermix。
阳性对照品为以puc57为质粒载体的连有h1～h9引物的靶向基因片段的质粒溶液。
阴性对照品为depc水。
实施例3
本实施例提供一种流感病毒血凝素亚型的分型方法，包括以下步骤：
1.核酸的提取
获取咽拭子待测样品，灭活处理(56℃加热30min)后按照提取凯杰、天根等商业化病毒核酸提取试剂盒的方法进行提取。
2.反转录
病毒rna核酸的反转录，获得病毒核酸的cdna。
3.pcr扩增
pcr反应液体系如下：2μl的步骤1提取得到的核酸作为模板，5μl的2×taqpcrmastermix，3.6μl的引物预混液，去离子水补齐至10μl。
pcr扩增反应的程序如下：
95℃，10min；95℃，15s，55℃，30s，72℃，60s，30个循环；72℃，10min。
4.电泳检测
将扩增得到的pcr产物用5％tae胶，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测，于凝胶成像仪进行成像拍照，通过与marker的条带比对，确定待测样品中的流感病毒的血凝素亚型。
实施例4
标准品的扩增
按照实施例3中的方法将流感病毒h1～h9亚型的标准品作为扩增模板进行扩增及电泳检测，结果如图1～图9所示。图1～图9依次是本发明的一个实施例的流感病毒h1～h9亚型标准品扩增结果的电泳图。各个扩增结果的电泳图中的泳道2为marker，泳道3～11分别为各亚型标准品作为模板的扩增结果。从图中可以看到，任一亚型均只产生其对应的特异性条带，该结果表明本实施例中设计的引物对各亚型均有较强的特异性结合能力。
实施例5
考察实施例1所设计的引物在数据库中历史数据中的表现，结果如图10所示。图10是本发明的一个实施例的引物与样本的匹配结果。该图中纵向为h1-h9亚型的序列数据集，数据集收录了1918年-2018年全世界范围内的各流感亚型流感病毒的血凝素片段测序结果。横向为h1～h9检测引物对，每个100*100像素方格为等比例引物和样本序列匹配程度的情况。从图中可以看出，本发明实施例所提供的引物对能够对长时间跨度的h1～h9亚型有较好的特异性。
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所述技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
sequencelisting
<110>清华大学深圳国际研究生院
<120>流感病毒血凝素亚型分型引物、试剂盒和分型方法
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cggaagrayaagacccggtac21
1.一种流感病毒血凝素亚型分型引物，其特征在于，包括核苷酸序列如下的特异性引物对中的至少一对：
针对流感病毒血凝素h1亚型的特异性引物对：
h1-f：5′-aatgtracwgtracmcactcw-3′，
h1-r：5′-tcraaracctacacragrtta-3′；
针对流感病毒血凝素h2亚型的特异性引物对：
h2-f：5′-taycaycacagcaatgaycar-3′，
h2-r：5′-atrgtttadgaaccgdtadatrcgatgt-3′；
针对流感病毒血凝素h3亚型的特异性引物对：
h3-f：5′-atyactccaaatggaagcaty-3′，
h3-r：5′-cgactyctrtacccktta-3′；
针对流感病毒血凝素h4亚型的特异性引物对：
h4-f：5′-tgytayccatttgatgtg-3′，
h4-r：5′-gtycctatgttyctgtar-3′；
针对流感病毒血凝素h5亚型的特异性引物对：
h5-f：5′-gtbackgtyacacaygcy-3′，
h5-r：5′-gagtaccttttactytcttgagatctr-3′；
针对流感病毒血凝素h6亚型的特异性引物对：
h6-f：5′-tggtayggmtaycaycatgar-3′，
h6-r：5′-acraaacttaaraccgtrttyacr-3′；
针对流感病毒血凝素h7亚型的特异性引物对：
h7-f：5′-ttctatgcrgaratgaar-3′，
h7-r：5′-ccvttacastawttracc-3′；
针对流感病毒血凝素h8亚型的特异性引物对：
h8-f：5′-gagggratgtgytaycct-3′，
h8-r：5′-tcgtarttraccraytgrttyttc-3′；
针对流感病毒血凝素h9亚型的特异性引物对：
h9-f：5′-ggttggtatggdttccagcattca-3′，
h9-r：5′-cggaagrayaagacccggtac-3′；
其中，所述核苷酸序列中的r为a或g，y为c或t，m为a或c，k为g或t，s为g或c，w为a或t，b为g、t、c中的任一种，v为g、a、c中的任一种，d为g、a、t中的任一种。
2.权利要求1中流感病毒血凝素亚型分型引物在制备流感病毒分型试剂中的应用。
3.一种用于流感病毒分型的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的流感病毒血凝素亚型分型引物。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括阳性对照品和阴性对照品。
5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括核酸提取试剂。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，还包括酶液和缓冲液。
7.一种流感病毒的分型方法，其特征在于，包括以下步骤：
提取待测样品的总rna；
以所述总rna为模板，用权利要求1所述的流感病毒血凝素亚型分型引物进行扩增；
扩增产物进行电泳检测，根据特异性条带的位置判断分型结果；
所述分型方法不用于疾病的诊断与治疗。
8.根据权利要求7所述的分型方法，其特征在于，根据特异性条带的位置判断分型结果的方法为：
当1534bp处出现特异性条带时，待测样品为h1亚型；
当481bp处出现特异性条带时，待测样品为h2亚型；
当532bp处出现特异性条带时，待测样品为h3亚型；
当1243bp处出现特异性条带时，待测样品为h4亚型；
当1219bp处出现特异性条带时，待测样品为h5亚型；
当349bp处出现特异性条带时，待测样品为h6亚型；
当790bp处出现特异性条带时，待测样品为h7亚型；
当175bp处出现特异性条带时，待测样品为h8亚型；
当556bp处出现特异性条带时，待测样品为h9亚型。
9.根据权利要求7所述的分型方法，其特征在于，所述扩增的程序为90～95℃，2～4min；90～95℃，20～40s；50～65℃，30～60s，70～74℃，30～90s，30～40个循环；70～74℃，8～12min。
技术总结