本发明涉及到基于gc-hs的丙戊酸钠中潜在遗传毒性杂质测定方法，该方法采用气相色谱顶空进样法进行测定丙戊酸钠中潜在的遗传毒性杂质1-溴丙烷。
背景技术：
：1-溴丙烷(bp)是丙戊酸钠合成过程中使用的起始原料之一，1-溴丙烷可以作为残留杂质存在于最终药物中。根据其作为伯烷基卤化物的结构，1-溴丙烷是具有潜在的致癌杂质。1-溴丙烷的化学结构如式所示。丙戊酸钠为一种不含氮的广谱抗癫痫药。本品对多种方法引起的惊厥，均有不同程度的对抗作用。对人的各型癫痫如对各型小发作、肌阵挛性癫痫、局限性发作、大发作和混合型癫痫均有效。口服吸收快而完全，主要分布在细胞外液，在血中大部分与血浆蛋白结合。多用于其它抗癫痫药无效的各型癫痫病人，尤以小发作为最佳。丙戊酸钠口服溶液作为抗癫痫药。其作用机理尚未完全阐明。实验见本品能增加gaba的合成和减少gaba的降解，从而升高抑制性神经递质γ-氨基丁酸(gaba)的浓度，降低神经元的兴奋性而抑制发作。在电生理实验中见本品可产生与苯妥英相似的抑制na 通道的作用。对肝脏有损害。技术实现要素：本发明的目的是提供了一种具有测定准确，重现性好，操作简单、分析速度快的新的丙戊酸钠中1-溴丙烷的含量测定方法。为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：丙戊酸钠中1-溴丙烷的含量测定方法，包括以下步骤：色谱条件：以二甲基聚硅氧烷为固定液的毛细管色谱柱；起始温度40℃，维持6分钟，以每分钟15℃的速率升温至220℃，维持3分钟；进样口温度为220℃；检测器温度为250℃；顶空瓶平衡温度为80℃，平衡时间为20分钟。流速：2.0ml/min；分流比：10:1；载气：氮气。供试品溶液的制备：取丙戊酸钠原料约0.2g，精密称定，置预先加有0.5g氯化钠的顶空瓶中，精密加二甲基亚砜0.2ml和水0.8ml溶解，密封，作为供试品液。对照品溶液的制备：精密称取1-溴丙烷对照品适量，加二甲基亚砜定量稀释制成每1ml中约含0.5μg的溶液，精密量取0.2ml，置预先加有0.5g氯化钠的顶空瓶中，再精密加水0.8ml，密封，作为对照品溶液。空白溶液的制备：精密加入二甲基亚砜0.2ml和水0.8ml，密封，作为空白溶液。测定方法：精密量取供试品溶液与对照溶液分别顶空进样，记录色谱图，按外标法计算含量。附图说明图1空白辅料干扰试验空白组；图2空白辅料干扰试验对照组；图3正溴丙烷标准曲线图。具体实施方式为证实本发明测定方法的效果，发明人进行了大量的实验，并对最终确定的测定方法进行了科学的验证，验证实验如下：系统适用性试验取对照品溶液顶空进样，平行测定6份进行分析，记录色谱图。试验结果见下表：表1系统适用性结果名称123456平均值rsd(％)峰面积1.982.132.162.242.302.082.155.30保留时间(min)4.4034.4034.4054.4044.4034.4054.400.02理论塔板数29328290622864227837287643069829055.17——拖尾因子1.01.11.21.21.11.01.0——对照品峰面积的相对标准偏差为5.30％，小于10.0％；保留时间的相对标准偏差为0.02％，小于1.0％；理论板数均大于5000；拖尾因子均小于2.0。试验结果表明该含量测定方法系统适用性良好。空白辅料干扰试验分别空白溶液、对照品溶液、供试品溶液顶空进样，记录色谱图，试验结果见下表：表2专属性试验结果名称保留时间(min)备注(结论)空白溶剂——不干扰正溴丙烷的测定供试品液——不干扰正溴丙烷的测定对照品溶液4.403——试验结果表明空白溶剂、主成分及各杂质不干扰丙戊酸钠中正溴丙烷的测定，该测定方法专属性较好。具体如图1、2所示。定量限和检测限对照溶液：精密称取正溴丙烷对照品适量，加二甲基亚砜定量稀释制成每1ml中约含0.5μg的溶液，作为对照溶液。检测限溶液：取对照溶液适量，逐级稀释，精密量取对照稀释溶液0.2ml，置预先加有0.5g氯化钠的顶空瓶中，加水0.8ml，密封，当正溴丙烷信噪比约为3:1时作为检测限溶液。定量限溶液：取对照溶液适量，逐级稀释，精密量取对照稀释溶液0.2ml，置预先加有0.5g氯化钠的顶空瓶中，加水0.8ml，密封，当正溴丙烷信噪比约为10:1时作为定量限溶液。供试品溶液：精密称取丙戊酸钠约0.2g，置预先加有0.5g氯化钠的顶空瓶中，精密加定量限溶液(检测限溶液)对应的对照品稀释溶液0.2ml和水0.8ml溶解，密封，作为供试品液。表3定量限与检测限名称杂质浓度(μg/ml)信噪比检测限及定量限溶液浓度(μg/ml)检测限溶液0.04949.00.0494检测限供试品溶液0.04948.4——定量限溶液0.098912.60.0989定量限供试品溶液0.098910.9——取定量限溶液顶空注入色谱仪，平行进样6次测定，记录色谱图。表4定量限精密度名称123456平均值rsd(％)保留时间(min)4.3944.3964.3974.4064.3954.3944.400.10峰面积0.630.560.680.710.660.620.648.19信噪比17.215.116.616.416.315.916.25——测定结果定量限为0.0989μg/ml，检测限为0.0494μg/ml；平行配制6份定量限浓度的溶液测定其吸收度的rsd小于10.0％，试验结果表明定量限精密度良好。定量限回收率对照溶液：精密称取正溴丙烷对照品适量，加二甲基亚砜定量稀释制成每1ml中约含0.5μg的溶液，作为对照贮备溶液；精密量取0.2ml，置预先加有0.5g氯化钠的顶空瓶中，再精密加水0.8ml，密封。定量限对照溶液：精密量取正溴丙烷对照贮备溶液适量，加二甲基亚砜定量稀释制成每1ml中约含0.1μg的溶液。样品溶液：精密称取丙戊酸钠约0.2g，置预先加有0.5g氯化钠的顶空瓶中，精密加二甲基亚砜0.2ml和水0.8ml溶解，密封。供试品溶液：精密称取丙戊酸钠约0.2g，置预先加有0.5g氯化钠的顶空瓶中，精密加定量限对照溶液0.2ml和水0.8ml溶解，密封；平行制备6份。测定方法：分别取对照溶液、样品溶液和供试品溶液顶空注入色谱仪，记录色谱图。测定其含量，将实测值与理论值比较，计算回收率，并计算6个回收率数据的相对标准偏差。表5定量限回收率试验结果试验结果表明，定量限为0.0989μg/ml(相当于限度浓度的20％)时，回收率为109.83％，在回收率70％～125％之间，6份正溴丙烷主峰保留时间的相对标准偏差为0.10％，峰面积的相对标准偏差为8.19％，小于15.0％，回收率良好。线性范围对照品贮备液：取正溴丙烷对照品适量；配制成浓度约5.0μg/ml浓度作为对照品贮备液。以杂质限度(限度0.5ppm)为100％浓度，在定量限～200％浓度范围以内，配制6个不同浓度的杂质对照溶液；分别精密量取0.2ml，置预先加有0.5g氯化钠的顶空瓶中，精密加水0.8ml，密封，作为杂质对照品溶液。分别测定该杂质峰的面积。以浓度为横坐标(x)，峰面积为纵坐标(y)，进行线性回归分析。表6稀释过程表7标准曲线的制备试验结果表明正溴丙烷在0.09776μg/ml～0.97765μg/ml的浓度范围(相当于定量限～限度浓度200％范围)呈良好的线性。具体如图3所示。重复性由分析人员a在相同的条件下分别取对照品溶液和供试品溶液顶空进样，记录色谱图，计算6份供试液的含量。表8重复性试验结果平行测定6份样品，其含量测定结果rsd小于10.0％，试验结果表明该方法重复性良好。中间精密度由不同分析人员b在不同的时间条件下分别制备对照品溶液和供试品溶液顶空进样，记录色谱图，计算6份供试液的含量；最后结合重复性的6个含量数据(操作人员a测定)，计算12个含量数据的rsd。表9中间精密度由不同的操作人员不同时间平行测定6份样品，其含量测定结果rsd为6.48％，含量重复性与中间精密度12个数据rsd为7.12％，均小于10.0％，试验结果表明该方法测定该方法中间精密度良好。准确度(回收率)对照贮备溶液：精密称取正溴丙烷对照品适量，加二甲基亚砜定量稀释制成每1ml中约含50μg的溶液。对照溶液ⅰ(0.5μg/ml)：精密量取对照贮备溶液1ml，置100ml量瓶中，加二甲基亚砜稀释至刻度。对照溶液ⅱ(1.0μg/ml)：精密量取对照贮备溶液1ml，置50ml量瓶中，加二甲基亚砜稀释至刻度。对照溶液ⅲ(0.25μg/ml)：精密量取对照贮备溶液ⅰ10ml，置20ml量瓶中，加二甲基亚砜稀释至刻度。对照溶液：精密量取对照溶液ⅰ0.2ml，置预先加有0.5g氯化钠的顶空瓶中，精密加水0.8ml，密封。样品溶液：精密称取丙戊酸钠约0.2g，置预先加有0.5g氯化钠的顶空瓶中，精密加二甲基亚砜0.2ml和水0.8ml溶解，密封。供试品溶液：精密称取丙戊酸钠约0.2g，平行9份，置预先加有0.5g氯化钠的9个顶空瓶中，分别加入上述对照溶液ⅲ、ⅱ、ⅰ各0.2ml和水0.8ml溶解，密封，各浓度的供试品溶液分别配制三份，杂质浓度为0.25ppm、0.5ppm和1.0ppm的溶液(相当于限度浓度的50％、100％、200％)。测定方法：分别取对照品溶液、样品溶液和供试品溶液顶空进样，测定其含量，将实测值与理论值比较，计算回收率，并计算9个回收率数据的相对标准偏差。表10回收率试验结果该方法测定其高、中、低浓度含量回收率均在70％～125％之间，平均回收率为77.2％，rsd小于10.0％；均符合要求，试验结果表明该方法准确度高、回收率好。溶液稳定性取丙戊酸钠原料约0.2g，精密称定，置预先加有0.5g氯化钠的顶空瓶中，精密加入对照品溶液0.2ml(0.5μg/ml)和水0.8ml溶解，密封，平行制备7份，将供试品溶液分别贮存在室温条件下放置0、4、8、12、24、48、72h，分别进样；计算峰面积的rsd。表11稳定性试验结果时间(h)048122448平均值rsd(％)主峰面积1.911.811.671.811.741.601.7576.31试验结果表明，供试品溶液主成分的峰面积应不大于10.0％。耐用性试验取对照品溶液和供试品溶液，照含量测定方法，分别考察样品振摇时间、样品脱水剂用量、扫描次数考察、不同液体池考察，试验结果见下表：表12耐用性试验结果各条件下的拖尾因子均小于2.0，理论板数均大于5000；含量数据的相对标准偏差为5.24％，含量变化绝对值(极差)为0.000005％；符合验证要求。取3批丙戊酸钠原料，依法制得对照品溶液和供试品溶液，采用气相色谱法测定正溴丙烷含量，均未检出。当前第1页1 2 3
技术特征：1.一种基于gc-hs的丙戊酸钠中潜在遗传毒性杂质测定方法，其特征在于：该方法采用气相色谱顶空进样法进行测定，包括以下步骤：
1)供试品溶液的制备：取丙戊酸钠原料约0.2g，精密称定，置预先加有0.5g氯化钠的顶空瓶中，精密加二甲基亚砜0.2ml和水0.8ml溶解，密封，作为供试品液；
2)对照品溶液的制备：精密称取正溴丙烷对照品适量，加二甲基亚砜定量稀释制成每1ml中约含0.5μg的溶液，精密量取0.2ml，置预先加有0.5g氯化钠的顶空瓶中，再精密加水0.8ml，密封，作为对照品溶液；
3)空白溶液的制备：精密加入二甲基亚砜0.2ml和水0.8ml，密封，作为空白溶液；
4)测定方法：精密量取供试品溶液与对照溶液分别顶空进样，记录色谱图，按外标法计算含量。
技术总结本发明提供了一种基于GC‑HS的丙戊酸钠中潜在遗传毒性杂质测定方法，具体包括以下步骤：1)供试品溶液的制备；2)对照品溶液的制备；3)空白溶液的制备；4)测定方法；用于测定丙戊酸钠药物中潜在的遗传毒性杂质1‑溴丙烷含量。在丙戊酸钠药物中获得的平均回收率为97.3％。发现该方法良好耐用性，可用于测定丙戊酸钠中的1‑溴丙烷。
技术研发人员：唐检珍;李朝阳;万华英
受保护的技术使用者：四川健能制药有限公司
技术研发日：2019.12.25
技术公布日：2020.06.09
