本发明涉及生物基因工程技术领域，尤其涉及一种用于检测非洲猪瘟病毒(asfv)核酸的反应体系、试剂盒及其应用。
背景技术：
非洲猪瘟是一种高度传染性、爆发性的导致家猪和野猪出血症状的一种高度致死性传染病。非洲猪瘟传播迅速，导致严重的社会经济危机，是动物和动物产品的国际贸易中重要监控疫病。非洲猪瘟的病原是非洲猪瘟病毒(africanswinefevervirus，asfv)，是非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属成员，非洲猪瘟病毒是一种有囊膜的双链dna病毒，该病毒在野外主要依靠钝缘软蜱进行传播，而在家养环境中不依赖钝缘软蜱也能传播。仅仅通过对b646l基因的c末端区域进行测序就已经鉴定出20多个asfv的基因型。1921年肯尼亚首次报告非洲猪瘟以后，该病仅限于撒哈拉以南的非洲地区。2007年后迅速扩散到俄罗斯西部和南部广大地区并在这些地区的家猪和野猪之间互相感染而失去控制。该病毒随后传播到东欧和中欧。2018年8月，中国辽宁省报告了一次新的asfv疫情，仅2019年全国就报告多达63起。
国内外目前常用的快速诊断方法包括基于抗原抗体反应建立的血清学诊断方法、基于核酸扩增建立的病原检测技术，目前快速、高通量的液相芯片技术和微流控芯片技术也是建立在这两种技术的基础上。但是这些检测方法都有一定的局限性。
基于抗原抗体反应的快速诊断方法的开发周期长、成本高；鉴于高特异性、高灵敏度的pcr、rt-pcr等技术现场条件难以开展；rpa技术尽管非常方便的实现现场诊断，但rpa主要具有几个方面的局限性：rpa不能做到实时定量检测；rpa对引物的设计非常敏感，需要将引物设计的更长且需要从多对引物中筛选高灵敏度的引物。此外，液相芯片技术仪器和试剂昂贵，微流控芯片检测灵敏度有待优化、检测结果不稳定，上述因素影响了这些技术在检疫工作中的推广使用。
规律成簇间隔短回文重复(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats，crispr)在基因编辑过程中发挥了强大的生命力，正在生物医学研究领域引起一场巨变。其中，科学家掌握了对一种蛋白-cas9的操作技术，并先后利用该技术对多种细胞的dna进行了编辑。这种技术被称为crispr/cas9基因编辑系统，迅速成为生命科学最热门的技术。不像其他基因编辑手段，它使用起来廉价、迅速且简单，并因此席卷全球实验室。最近科学家发现crispr在核酸检测方面同样表现出了强大的生命力。
高灵敏度、特异的单个底物的快速核酸检测便携平台有助于疾病的检测和监控、流行病学和一般实验室项目。现有的核酸检测方法必须考虑灵敏度、特异性、简便、费用和效率。微生crispr和crispr相关的适应性免疫系统包含了可用于基于crispr诊断(crispr-dx)的可编程内切酶。尽管有一些cas酶分解dna，单效应rna引导核糖核酸酶如cas13a可以通过重新编辑crisprrnas(crrnas)的方式为特定的rna的灵敏检测提供平台。cas13a蛋白识别并能结合了其靶rna序列后可以被激活，活化的cas13a可以分解所处环境中的非靶标rnas。这种crrnas程序的旁系-分裂活性使cas13a通过在体内启动程序性细胞死亡或体外的非特异性的降解标记rna来检测特定rna的存在。特异性的高灵敏度酶促解锁(sherlock)是一种基于核酸扩增和cas13a介导的报告rna的非特异性断裂来实时检测目的序列的具有渺摩尔级敏感性体外核酸检测平台。
sherlock核酸检测技术的优势主要表现在检测结果变异性低、灵敏度高、检测体系各成分可以冻干并在试纸上实现检测重现、检测成本低等优势。通过重复的变异系数衡量发现，sherlock表现出了比ddpcr，qpcr和rpa更低的变异性。用sherlock方法可以检测并区分含有寨卡病毒(zikv)或登革热病毒(denv)基因片段的慢病毒样品，这表明sherlock方法在核酸检测方面具有更高的灵敏性，并且sherlock能够检测低于2am的病毒分子。为了检测sherlock的试纸和冻干的潜在应用，研究人员发现被冻干随后又水化的cas13a-ssrna复合物能够检测20fm的为扩增的ssrna，同时可以在玻璃纤维纸进行目标检测；sherlock方法中的其他组分如t7聚合酶可以冷冻干燥。冻干和试纸点样检测cas13a反应相结合使ssrna的检测灵敏度的水平与液相反应相当，虽然试纸点样和冻干法能轻微的降低读数的绝对信号，但是sherlock能够轻易的检测浓度低至20am的寨卡病毒。sherlock是一种经济、适应性强的crispr-dx检测平台，但目前为止在asfv核酸检测领域，sherlock的应用还十分罕见。
技术实现要素：
为了克服现有技术中所存在的对非洲猪瘟病毒(asfv)核酸检测的灵敏度和敏感性低，且反应时间长等缺陷，本发明提供一种用于检测非洲猪瘟病毒(asfv)核酸的反应体系、试剂盒及其应用，利用sherlock技术建立了一种asfv核酸的快速检测方法，其具有很高的特异性和敏感性，为asfv感染的诊断提供了一个快速、简便、准确的检测方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一个方面是提供一种用于检测asfv核酸的反应体系，该反应体系为sherlock反应体系，其包括用于扩增目的核酸片段的rpa引物对和/或crrna；其中，所述引物对包括如seqidno.1和seqidno.2所示序列的引物。
为了进一步优化上述反应体系，本发明采取的技术措施还包括：
进一步地，所述crrna用于结合扩增后的所述目的核酸片段转录的ssrna；其中，所述crrna由crdna合成，所述crdna的序列如seqidno.3所示。
更进一步地，利用t7快速rna合成试剂以所述crdna为模板合成crrna；优选地，所述t7快速rna合成试剂包括无rna酶水、10倍反应液、ntp、t7rna聚合酶混合液；更优选地，所述t7快速rna合成试剂组成的反应体系包括：无rna酶水10μl；10倍反应液1.5μl；ntp各1.5μl；模板1μl；t7rna聚合酶混合液1.5μl；其中，反应条件为：37～42℃反应3～5h，优选为37℃反应4h；其中，所得的crrna，冻干-20℃保存，用时加无rna酶水配置至预定浓度。
进一步地，所述引物对和crrna根据asfv的vp2蛋白基因的保守序列设计。更进一步地，使用vectorntisuite软件分析不同国家和地区分离的asfv的vp2蛋白基因的保守序列，利用primerexpress软件设计引物和crdna。
进一步地，所述反应体系还包括cas13a和荧光标记探针；所述cas13a与已结合ssrna的crrna结合从而使其具有rna酶活性，具有rna酶活性的所述cas13a切割所述荧光标记探针；可理解的是，所述荧光标记探针的序列可为任一合适的商品化产品，具体可为fam标记的rna。
进一步地，在所述反应体系中，所述引物对中的每一引物的浓度分别为200～800nm，优选400nm。
进一步地，在所述反应体系中，所述crrna的浓度为20～80nm，优选30nm。
进一步地，在所述反应体系中，所述cas13a的浓度为40～100nm，优选50nm。单效应rna引导核糖核酸酶如cas13a可以通过重新编辑crisprrnas(crrnas)的方式为特定的rna的灵敏检测提供平台。cas13a蛋白识别并结合了其靶rna序列后可以被激活，活化的cas13a可以分解所处环境中的非靶标rnas。这种crrnas程序的旁系-分裂活性使cas13a通过在体内启动程序性细胞死亡或体外的非特异性的降解标记rna来检测特定rna的存在，大大提高本发明所述试剂盒的检测灵敏度。
进一步地，在所述反应体系中，所述荧光标记探针的浓度为50～200nm，优选100nm。
进一步地，所述反应体系还包括rpa反应液；更进一步地，所述rpa反应液包括重组酶、单链dna结合蛋白和链置换聚合酶。可理解的是，rpa反应液可为任一合适的常规产品，例如为购自twistamp公司或杭州众测公司的rpa反应液。进一步地，所述rpa反应液中还可包括dntp，在反应体系中，所述dntp的浓度为50μm～1mm，优选200μm。
进一步地，所述反应体系还包括t7转录酶、mg2 、ntp；更进一步地，在所述反应体系中，所述mg2 的浓度为10～50mm，优选20mm；和/或，所述ntp的浓度为500μm～2mm，优选1mm。
进一步地，所述反应体系包括10μm上游引物2μl、10μm下游引物2μl；4μmcrrna1μl；2μmcas13a1μl；1μm荧光标记探针5μl；400mmmg2 3μl；10mmntp6μl；2倍rpa反应液25μl；20u/μlt7转录酶2μl。以上为单次反应的试剂用量，所述反应体系需要-20℃保存；在该反应体系中所加入的模板dna的量为3μl。
本发明的第二方面是提供一种用于检测asfv核酸的试剂盒，其包括如任一上述的用于检测asfv核酸的反应体系，该反应体系中各组分及用量如上所述。
为了进一步优化上述试剂盒，本发明采取的技术措施还包括：
进一步地，所述试剂盒还包括核酸提取试剂；更进一步地，所述核酸提取试剂为dna提取试剂或rna提取试剂，其中dna提取或rna提取可采用常规试剂及方法提取，例如用tiangen的试剂盒提取dna，用trizol方法提取rna等。
进一步地，所述核酸提取试剂包括缓冲液、漂洗液、洗脱缓冲液、吸附柱和收集管等。更进一步地，所述核酸提取试剂包括：蛋白酶、磁珠、裂解液、异丙醇、洗液和缓冲液。
进一步地，所述试剂盒还包括阴性对照，所述阴性对照优选ddh2o。
本发明的第三个方面是保护一种用于检测asfv核酸的引物对和/或crrna；其中，所述引物对包括序列如seqidno.1和seqidno.2所示的引物；所述crrna由crdna合成，所述crdna的序列如seqidno.3所示。进一步地，上述检测为sherlock检测。
本发明的第四个方面是提供一种引物对和/或crrna、或任一上述的反应体系在制备用于检测asfv核酸的试剂中的应用；其中，所述引物对包括序列如seqidno.1和seqidno.2所示的引物；所述crrna由crdna合成，所述crdna的序列如seqidno.3所示。所述引物和crdna的设计、crrna的合成如上所述。
可理解的，所述试剂可为任一形式的试剂类型，其优选为试剂盒，采用sherlock检测体系。
本发明的第五个方面是提供一种非诊断目的的用于检测asfv核酸的方法，其包括如下步骤：
步骤(1)使用核酸提取试剂提取待检样品中的核酸；
步骤(2)以步骤(1)提取的核酸为模板，采用任一上述的反应体系进行sherlock反应；
步骤(3)在步骤(2)所述的sherlock反应结束后，分析检测结果。
为了进一步优化上述检测方法，本发明采取的技术措施包括：
进一步地，在步骤(1)中，使用核酸提取试剂提取待检样品中的dna或rna，如果提取的为rna，再进行逆转录得cdna；所得的dna或cdna作为扩增模板。
进一步地，所述sherlock反应的反应条件为：反应时间为20～40min、反应温度为37～42℃；优选地，反应时间为40min、反应温度为37℃。
进一步地，所述分析检测结果的的操作过程可为本领域的常规方法，具体可为恒温扩增仪检测、微流控芯片仪检测、酶标仪检测结果的分析。
进一步地，所述核酸提取试剂可为本领域常规的提取病毒dna或rna的试剂。
进一步地，该检测方法的检测下限量为1fg/μl。
需知：本发明中所提及的“浓度”均为试剂盒中各成其在整个反应体系中的终浓度；crrna、ntp以及mg2 等成分的浓度亦是如此。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
与现有技术相比，本发明采用上述技术方案，具有如下技术效果：
本发明提供了一种用于检测asfv核酸的sherlock方法，该方法可以在37℃恒温条件下对目的核酸进行扩增，扩增后的目的核酸片段转录为ssrna后可与crrna结合，进而与cas13a结合而使得cas13a有rna酶活性，有活性的cas13a切割荧光标记的rna探针而产生荧光，产生的荧光可进行实时检测。
本发明利用上述sherlock方法分别检测猪细小病毒(ppv)、圆环病毒2型(pcv-2)、猪乙型脑炎病毒(jev)、猪伪狂犬病毒(prv)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv)、古典猪瘟病毒(csfv)，同时与rt-pcr方法进行对比，检测所建立方法的特异性，并证实本发明所建立的asfv核酸的sherlock检测方法具有很高的特异性和敏感性，为基层单位普通实验室asfv感染的诊断提供了一个快速、简便、准确的检测手段。
上述sherlock方法与普通pcr方法相比以下优势：
(1)sherlock属于等温扩增技术，对仪器设备要求低，仅需要恒温水浴锅即可完成反应；(2)sherlock检测速度快，反应时间在40min以内，比常规pcr反应时间(通常为1～2h)要短；(3)试验条件允许的前提下加入荧光标记的探针序列，在genieⅱ恒温扩增仪上进行扩增，也可包埋到微流控芯片上，通过微流控芯片仪进行恒温扩增，可实现核酸扩增的实时监控；也可以通过荧光酶标仪读出荧光值进行结果判定。
上述优势使得本发明建立的sherlock方法可以用于基层单位普通实验室或在室外进行asfv快速检测和鉴别诊断。
附图说明
图1为采用实施例1中不同引物crrna组合的rpa扩增结果示意图；其中，m：marker；1：asfvf1和asfvr1扩增；2：asfvf2和asfvr2扩增；3：asfvf3和asfvr3扩增。
图2为基于cas12a和cas13a检测方法的实时荧光检测对比图；其中孔1：利用cas12a检测1pg/μl的asfv质粒；孔2：利用cas12a检测的阴性对照；孔3：利用cas13a检测1pg/μl的asfv质粒；孔4：利用cas13a检测的阴性对照。
图3为本发明一实施例中采用酶标仪检测sherlock方法的荧光强度示意图。
图4为本发明一实施例中实时荧光sherlock检测asfv采用恒温扩增仪检测的特异性结果示意图；其中，孔1为asfv阳性质粒；孔2至孔8分别为ppv、pcv-2、jev、prv、prrsv、csfv和阴性对照。
图5为本发明一实施例中采用实时荧光sherlock检测asfv的敏感性结果示意图；其中，孔1至孔8的模板浓度分别为1pg/μl、100fg/μl、10fg/μl、1fg/μl、100ag/μl、10ag/μl、1ag/μl和0ag/μl。
具体实施方式
本发明涉及一种用于检测asfv核酸的反应体系，其为sherlock反应体系，包括用于扩增目的核酸片段的rpa引物对和/或crrna，所述crrna用于结合扩增后的所述目的核酸片段转录的ssrna；其中，所述引物对包括如seqidno.1和seqidno.2所示序列的引物，所述crrna由crdna合成，所述crdna的序列如seqidno.3所示；上述反应体系还包括cas13a和荧光标记探针等，所述cas13a与已结合ssrna的crrna结合从而使其具有rna酶活性，具有rna酶活性的所述cas13a切割所述荧光标记探针。本发明还涉及包括上述反应体系的试剂盒及上述rpa引物对和/或crrna的相关应用。
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照本领域常规方法和条件，或按照商品说明书选择。下述实施例中未注明具体成分的试剂和原料均市售可得。
下述实施例中rt-pcr检测方法的步骤如下：
rt-pcr引物探针为《陆生动物诊断试验与疫苗手册(2019)》公布的序列，其上游引物(asfvf)序列为：5’ctg-ctc-atg-gta-tca-atc-tta-tcg-a3’，下游引物(asfvr)序列为：5’gat-acc-aca-aga-tc(ag)-gcc-gt3’。探针序列为：(fam)-cca-cgg-gag-gaa-tac-caa-ccc-agt-g-3’-[6-carboxy-tetramethyl-rhodamine(tamra)]。在pcr薄壁管中，加dna模板1μl、2倍taq酶混合液10μl、上下游引物各0.8μl、探针和rox各0.4μl，加水补足总体积至20μl。将pcr管置荧光pcr仪上，按如下程序扩增：首先50℃2min，95℃10min；然后95℃15s，58℃1min，40个循环；58℃1min时收集荧光。每个检测设置3个重复，ct值小于40判定为阳性。
下述实施例中：asfv阳性质粒为根据非洲猪瘟p72基因序列合成，委托上海生工合成。
实施例1-rpa引物和crdna的设计及crrna的合成
(1)rpa引物和crdna的设计
使用vectorntisuite软件分析不同国家和地区分离的asfv的p72蛋白基因的保守序列，用primerexpress软件设计引物和crdna。引物和crdna由上海生工生物技术有限公司合成。引物以depc-h2o稀释引物至10μm，-20℃保存备用。
表1引物对和crdna组合
(2)利用crdna合成crrna
利用hiscribet7快速rna合成试剂盒，以表1提供的crdna为模板，配制20μl反应体系：
37℃反应4h，即得crrna，冻干-20℃保存，用时加无rna酶水至crrna浓度为4μm。
实施例2-反应体系的建立和优化
1、核酸提取及cdna模板制备
对于dna病毒样品，取100μl组织上清液或体液样本，按dna抽提试剂盒(市售可得，例如购自tiangen的试剂盒)说明书要求进行病毒dna提取，最后将dna用50μl水溶解，即得扩增模板；对于rna病毒样品，取100μl上清液或体液，用trizol方法提取rna，再进行逆转录，得cdna模板。
dna的提取步骤具体操作如下：
向100μl组织上清液或体液样本中加入700μl65℃预热缓冲液1的离心管，混匀后将离心管放在65℃水浴20min，水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次；
加入700μl氯仿，充分混匀，12000rpm离心5min；
将上层水相转入一个新的离心管中，加入700μl缓冲液2，充分混匀，转移到吸附柱中，12000rpm离心30s，弃掉废液；
向吸附柱中加入500μl缓冲液3，12000rpm离心30s，弃掉废液，将吸附柱放入收集管中；
向吸附柱中加入600μl漂洗液，12000rpm离心30s，弃掉废液，将吸附柱放入收集管中；重复本操作一次；
将吸附柱放入收集管中，12000rpm离心2min，弃掉废液。将吸附柱置于室温放置数分钟；
将吸附柱转入另一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50～200μl洗脱缓冲液，室温放置3min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。
2、最佳引物对的筛选
在反应体系中其他组分浓度不变的情况下，分别利用设计的3对引物及crrna对同一核酸样本进行rpa扩增，反应条件为37℃40min，扩增后的产物纯化后1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。引物对1的反应体系的扩增曲线以及荧光强度明显优于引物对2的反应体系及引物对3的反应体系(见图1)，因此选取引物对1和crrna1用于后续反应体系优化研究。
3、引物浓度的优化
在反应体系中其他组分浓度不变的情况下，分别使用从100nm/反应至800nm/反应梯度的引物进行sherlock反应，经过实时荧光检测发现，引物在200～800nm之间均可有效的反应，基于成本及荧光检测结果，选定最佳的引物浓度为400nm/反应。
4、crrna浓度的优化
在反应体系中其他组分浓度不变的情况下，分别使用从1nm/反应至80nm/反应梯度的crrna进行sherlock反应，经过实时荧光检测发现，crrna在20～80nm之间均可有效的反应，其中最佳的crrna浓度为30nm/反应。
3、cas13a的浓度的优化
在反应体系中其他组分浓度不变的情况下，分别使用从1nm/反应至100nm/反应梯度的cas13a进行sherlock反应，经过实时荧光检测发现，cas13a在40～100nm之间均可有效的反应，综合考虑检测成本和反应时间，最佳的cas13a浓度为50nm/反应。
5、荧光标记探针浓度的优化
在反应体系中其他组分浓度不变的情况下，分别使用从10nm/反应至200nm/反应梯度的荧光标记探针进行sherlock反应，经过实时荧光检测发现，荧光标记探针在50～200nm之间均可有效的反应，综合考虑检测成本和荧光强度，最佳的荧光标记探针浓度为100nm/反应。
6、mg2 浓度的优化
在反应体系中其他组分浓度不变的情况下，分别使用从10mm/反应至50mm/反应梯度的mg2 浓度进行sherlock反应，经过实时荧光检测发现，mg2 浓度在10～50mm之间均可有效的反应，其中最佳的mg2 浓度为20mm/反应。
7、ntp浓度的优化
在反应体系中其他组分浓度不变的情况下，分别使用从500μm/反应至2mm/反应梯度的ntp进行sherlock反应，经过实时荧光检测发现，ntp在500μm至2mm之间均可有效的反应，其中最佳的ntp浓度为1mm/反应。
8、dntp浓度的优化
在反应体系中其他组分浓度不变的情况下，分别使用从50μm/反应至1mm/反应梯度的dntp进行sherlock反应，经过实时荧光检测发现，dntp在50μm至1mm之间均可有效的反应，其中最佳的dntp浓度为200μm/反应。
9、最佳反应时间的确定
鉴于rpa作为sherlock的限速反应，为确定sherlock最佳反应时间，评价rpa的反应时间，以筛选出最佳引物的最佳反应时间。以1×103拷贝/μl的重组质粒pt-asfv-p72dna为模板(该质粒是本实验室没有非洲猪瘟阳性核酸以前直接从上海生工合成的商品化试剂)，分别以10min、20min、25min、30min、35min和40min为不同的反应时间进行sherlock扩增。sherlock反应结束后，取5μl产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，并用紫外凝胶成像系统分析电泳结果。结果发现，37℃下sherlock反应时间为20min时，电泳即可获得一条大小约为250bp的特异性条带。对sherlock产物条带用紫外凝胶成像系统进行半定量分析，sherlock反应30min后，条带约为20min时条带的5.7倍，而反应30min后扩增的条带没有显著增加，因此考虑到ssrna的转录和后续cas13a对荧光标记探针的切割时间，将asfvsherlock最佳反应时间确定为40min。
10、实时荧光sherlock检测
根据上述各组分及浓度的优化，以下述步骤进行实时荧光sherlock检测，其具体如下：
反应体系50μl：2倍rpa反应液25μl、上下游引物(asfvf、asfvr)各2μl(初始浓度均为10μm)、cas13a1μl，初始浓度为4μm的crrna1μl，探针5μl，ntp6μl，t7转录酶2μl；混匀后，最后加入初始浓度为400mm的mg2 3μl、待检核酸溶液3μl。反应条件为：37℃孵育40min。在反应结束后，查看荧光扩增曲线并进行结果判定。
实施例3-基于cas12a和cas13a检测方法的敏感性比较
为测试建立的基于cas12a和cas13a检测方法的灵敏性，以浓度为1pg/μl的asfv阳性质粒为模板，并设置阴性对照为ddh2o，再分别利用cas12a和cas13a检测方法实施检测。检测结果见图2，结果显示，基于cas13a检测asfv质粒的荧光信号强度高于基于cas12a的检测方法，具有更高的灵敏度。
实施例4-利用酶标仪、恒温扩增仪和微流控芯片仪检测荧光强度
1、酶标仪检测荧光值
将实施例2中构建的优化后的反应体系50μl加入平底96孔板中，37℃避光孵育35min后，利用荧光酶标仪检测，激发波长为492nm，发射波长为518nm，间隔10min检测一次荧光值，每个检测设置两个重复。由图3可以看出，反应20min后即可以通过检测荧光强度区分阳性样品和阴性样品，阳性样品的荧光值随着反应时间的延长逐渐升高。
2、恒温扩增仪实时检测
将实施例2中构建的优化后的反应体系50μl加到薄壁八连管中，利用genieⅱ恒温扩增仪上进行扩增，反应温度设定为37℃，反应时间设定为2h。为充分体现本发明建立的方法的实时荧光变化，本实施例中所展示图片的均为恒温扩增检测，反应时间均为2h(图4)。由图4可以看出，反应约15min后荧光强度逐渐升高，反应20min即可以通过检测荧光强度区分阳性样品和阴性样品，阳性样品的荧光值随着反应时间的延长逐渐升高。猪细小病毒(ppv)、圆环病毒2型(pcv-2)、猪乙型脑炎病毒(jev)、猪伪狂犬病毒(prv)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv)、古典猪瘟病毒(csfv)6种病毒样品由本实验室保存，6种病毒样品的荧光值无明显变化。图4中孔1为asfv阳性质粒，孔2至孔8分别为ppv、pcv-2、jev、prv、prrsv、csfv)和阴性对照。
3、微流控芯片仪实时检测
配制25μl实施例2中构建的优化后的反应体系，将上述反应体系旋涡振荡混匀，瞬时离心，全部加入到微流控芯片加样孔中，用与芯片匹配的封口膜封住加样孔及透气孔，使用刮片赶走气泡，确保封口膜完全贴合。程序设置：1600r/min低速离心10s，4600r/min高速离心30s。温度为37℃，反应时间为40min。待温度上升到设定温度，微流控芯片仪开始离心，离心结束后，仪器便开始连续采集荧光信号。由微流控芯片仪的检测过程可以看出，反应约15min后荧光强度逐渐升高，反应20min即可以通过检测荧光强度区分阳性样品和阴性样品，阳性样品的荧光值随着反应时间的延长逐渐升高，阴性样品的荧光值无明显变化。由于所用微流控芯片检测仪操作软件的表示荧光强度的纵坐标刻度过大，无法调整，阳性样品和阴性样品荧光强度的曲线在运行时可以区分，运行结束后无法通过软件中的反应曲线直观看出阴性和阳性样品的荧光曲线差别，只能通过荧光强度值区分，因此本实施例未提供荧光扩增曲线。
实施例5-实时荧光sherlock检测asfv的特异性试验
分析asfvvp2蛋白基因序列，设计引物及crdna，建立实时荧光sherlock检测asfv方法，并分别使用ppv、pcv-2、jev、prv、prrsv和csfv作为对照。结果显示，经实时荧光sherlock检测，asfv阳性样品在反应5min后荧光信号出现显著增强，其它病毒均未检测到荧光信号(图4)。这说明所建立的实时荧光sherlock检测体系具有优异的特异性。
实施例6-实时荧光sherlock检测asfv的敏感性试验
为测试建立的sherlock方法的敏感性，将asfv阳性质粒进行定量并梯度稀释，制备浓度分别为1pg/μl、100fg/μl、10fg/μl、1fg/μl、100ag/μl、10ag/μl、1ag/μl、0ag/μl的模板，并设置阴性对照为ddh2o，再分别用sherlock和qpcr(rt-pcr)方法检测。结果表明q-pcr的检测下限为1fg/μl，实时荧光sherlock检测asfv的敏感性结果见图5，其中图5中孔1至孔8的模板浓度分别为1pg/μl、100fg/μl、10fg/μl、1fg/μl、100ag/μl、10ag/μl、1ag/μl和0ag/μl。结果显示，sherlock检测asfvdna模板的下限量为1fg/μl。
实施例7-试剂盒的组装
按照核酸的提取和sherlock反应两个部分完成试剂盒组分的配制，以下提供的数据及试剂组分为单次检测所需试剂：
1、核酸提取(室温保存)
核酸提取试剂包括蛋白酶(20mg/ml)、磁珠(50mg/ml)、裂解液、异丙醇、洗液一(4.2m盐酸胍，40％异丙醇)、洗液二(0.1m氯化钠，25％异丙醇，25％酒精)、洗液三(80％酒精)和te缓冲液。裂解液的配制方法：1mol/ltris-hcl(ph8.0)10ml，0.5mol/ledta(ph8.0)10ml，sds0.50g，盐酸胍47.77g，尿素30.03g，吐温-201ml，加超纯水至100ml，充分溶解，室温保存。
2、sherlock检测(20℃保存)
(此处的体积为每个试剂盒(50t)的各组分总体积：)2倍rpa反应液(已确认)1250μl、上下游引物(asfvf、asfvr)各100μl(初始浓度均为10μm)、cas13a50μl，初始浓度为4μm的crrna50μl，探针5μl/管，共50管，ntp300μl，t7转录酶100μl；混匀后，最后加入初始浓度为400mm的mg2 150μl。
按照50份检测剂量为一个包装，将上述配制好的试剂分别装入无dnase酶的瓶或管中，并按照相应的储存温度保存运送。
实施例8-试剂盒的应用—实时荧光sherlock检测asfv的重复性试验
为了验证建立的实时荧光sherlock方法的可靠性，利用实时荧光sherlock方法和rt-pcr检测方法用于检测46份核酸。sherlock与rt-pcr检测结果对比见表2。
表2rt-pcr与sherlock检测结果
结果显示，含有11份核酸为qpcr(rt-pcr)检测阳性，经实时荧光sherlock检测asfv的11份阳性核酸呈显著荧光信号扩增，而以ddh2o作为模板的阴性对照和所有asfv阴性样品均未检测到荧光信号，其检测与rt-pcr检测结果一致。
由上述实施例可知，采用本发明所述的反应体系、试剂盒及sherlock检测方法进行非洲猪瘟病毒(asfv)核酸的检测，其反应时间短、检测速度快，特异性及敏感性高，重复性好，这为asfv感染的诊断提供了一个快速、简便、准确的检测手段。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
序列表
<110>上海海关动植物与食品检验检疫技术中心
<120>一种用于检测非洲猪瘟病毒核酸的反应体系、试剂盒及其应用
<160>9
<170>siposequencelisting1.0
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1.一种用于检测非洲猪瘟病毒核酸的反应体系，其特征在于，所述反应体系为sherlock反应体系，其包括用于扩增目的核酸片段的rpa引物对和/或crrna；其中，所述引物对包括如seqidno.1和seqidno.2所示序列的引物。
2.根据权利要求1所述的一种用于检测非洲猪瘟病毒核酸的反应体系，其特征在于，所述crrna用于结合扩增后的所述目的核酸片段转录的ssrna；其中，所述crrna由crdna合成，所述crdna的序列如seqidno.3所示。
3.根据权利要求2所述的一种用于检测非洲猪瘟病毒核酸的反应体系，其特征在于，所述反应体系还包括cas13a和荧光标记探针；所述cas13a与已结合ssrna的crrna结合从而使其具有rna酶活性，具有rna酶活性的所述cas13a切割荧光标记探针。
4.根据权利要求3所述的一种用于检测非洲猪瘟病毒核酸的反应体系，其特征在于，在所述反应体系中，所述引物对中的各引物的浓度均为200～800nm，所述crrna的浓度为20～80nm，所述cas13a的浓度为40～100nm，所述荧光标记探针的浓度为50～200nm。
5.根据权利要求3所述的一种用于检测非洲猪瘟病毒核酸的反应体系，其特征在于，所述反应体系还包括rpa反应液、t7转录酶、mg2 、ntp；其中，所述rpa反应液包括重组酶、单链dna结合蛋白和链置换聚合酶。
6.一种用于检测非洲猪瘟病毒核酸的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1～5中任一项所述的用于检测非洲猪瘟病毒核酸的反应体系。
7.根据权利要求6所述的一种用于检测非洲猪瘟病毒核酸的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括核酸提取试剂和阴性对照。
8.一种引物对和/或crrna、或如权利要求1～5中任一项所述的反应体系在制备用于检测非洲猪瘟病毒核酸的试剂中的应用，其特征在于，所述引物对包括序列如seqidno.1和seqidno.2所示的引物；所述crrna由crdna合成，所述crdna的序列如seqidno.3所示。
9.一种非诊断目的的用于检测非洲猪瘟病毒核酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤(1)使用核酸提取试剂提取待检样品中的核酸；
步骤(2)以步骤(1)提取的核酸为模板，采用如权利要求1～5中任一项所述的反应体系进行sherlock反应；
步骤(3)在步骤(2)所述的sherlock反应结束后，分析检测结果。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述sherlock反应的反应条件为：反应时间为20～40min、反应温度为37～42℃。
技术总结