一种抗阿尔兹海默病候选化合物的血药浓度检测方法与流程

本发明涉及药物分析学临床前药代动力学研究范畴，尤其涉及一种sd大鼠血浆中抗阿尔兹海默病候选化合物zcy-15的血药浓度定量分析方法。
背景技术：
：n-甲基-d-天冬氨酸(nmda)受体，是离子型谷氨酸受体的一个亚型，分子结构复杂，药理学性质独特，不仅在神经系统发育过程中发挥重要的生理作用，而且对神经元回路的形成亦起着关键的作用，是目前已知的治疗阿尔茨海默症的重要作用靶点，美金刚是唯一作用于nmda受体的上市药物，但不良反应较多。zcy-15是一个全新合成的作用于nmda受体的化合物，其体外药效学实验表明zcy-15的药物活性媲美且略优于美金刚。化合物zcy-15的制备方法参阅申请日为2017-08-23，申请号为201710728442.1，
专利名称：为“n-(3,5-二甲基金刚烷-1-基)-n’-取代苯基脲类化合物及其制备方法和用途”的发明专利。从该专利文中可知，zcy-15的化学名称为n-(3,5-二甲基金刚烷-1-基)-n’-(3-甲基苯基)脲，化学结构式见图1。因为zcy-15是创新性化合物，其生物样品的测定方法国内外均无文献报道，为能够开展关于其体内吸收、分布、代谢、排泄等相关特征的动物及人体药代动力学研究，有必要建立一个高灵敏度、快捷方便的zcy-15血药浓度定量分析方法。技术实现要素：本发明的目的在于提供了一种操作简单快捷、样本剂量小、专属性强、准确度高、重现性好、分析时间短、峰形好及色谱保留时间合适的一种抗阿尔兹海默病候选化合物的血药浓度检测方法。本发明采用的技术方案是：一种抗阿尔兹海默病候选化合物的血药浓度检测方法，其方法样品为采自sd大鼠的血浆，化合物zcy-15为检测对象；所述方法是血浆样品经预处理后，在混合流动相梯度洗脱下，通过色谱柱分离，之后采用二级质谱检测器检测；具体步骤如下：步骤一：血浆样品预处理；给予zcy-15灌胃后的sd大鼠血浆中，加入乙腈和内标工作液，混合涡旋，离心，之后提取上清液，与流动相溶液混匀进样；步骤二：样品分离；采用高纯球形硅胶微粒作为填充剂的aqelavenusilasbc8色谱柱(2.1×50mm，3μm)，柱温：40℃；超高液相系统采用通用型二元高压泵和进样器，选取乙腈-醋酸铵水溶液的混合液作为流动相，梯度洗脱；步骤三：二级质谱仪检测样品；采用esi离子源作为离子源，多反应监测模式(mrm)进行正离子模式检测；定量分析的离子分别为：zcy-15：m/z313.2→163.1，碰撞能量为29ev，is：m/z237→194.1，碰撞能量为25ev；进一步，所述血浆样品采于周龄为7～9周、体重为210±30g的健康成熟sd大鼠；经眼眶后静脉丛取血250μl，高速离心之后取上清液制成；取样量为80μl；进一步，步骤(1)中，所述乙腈为色谱级溶液，其作用是沉淀血浆样品中的蛋白质成分；进一步，步骤(1)中，所述内标工作液为卡马西平甲醇溶液，浓度为1μg·ml-1；进一步，步骤(2)中，所述醋酸铵水溶液浓度为5mmol·l-1；进一步，步骤(2)中，所述流动相为乙腈(有机相)—醋酸铵水溶液的混合液，采用梯度洗脱的方法，流动相配比时间变化如下：时间(min)有机相(％)0550.6552.1953.1953.2553.655表1进一步，步骤(3)中，所述质谱仪条件为毛细管电压4.0kv，锥孔电压25v，脱溶剂气温度和源温度分别为400℃和120℃。与现有技术比较，本发明具有以下优点：1.本发明样品采集量小：测定一份样品仅需250μl血浆：2.本发明预处理简单快捷：乙腈沉淀样品中蛋白质成分，混合涡旋，离心，之后提取上清液进样，适用于常规定量分析检测；3.本发明灵敏度高：通过二级质谱检测，显著提高检测灵敏度，最低定量限为1.95ng·ml-1；4.本发明选择性好：空白血浆中的内源性物质对化合物和内标的测定没有干扰；5.本发明测定时间短：整个分析测定过程为3.6min；6.本发明zcy-15的测定线性范围为1.95～1000ng·ml-1，线性范围跨度大，能够很好地满足化合物体内动态分析变化测定的需求；7.本发明回收率稳定，日内和日间的精密度(相对标准差，rsd)均小于15％。附图说明图1是本发明方法中zcy-15的化学结构式。图2是本发明方法实施例中zcy-15的质谱扫描图。图3是空白血浆离子检测(mrm)色谱图。图4是空白血浆中加入zcy-15(1.95ng·ml-1)的离子检测(mrm)色谱图。图5是实际血浆样品的zcy-15离子检测(mrm)色谱图。具体实施方式结合实施例和附图对本发明方法做详细说明：1.所需仪器与试剂⑴.仪器：agilent1290infinity高效液相色谱仪(美国agilent公司)，abapi4000三重四级杆串联质谱仪配备电喷雾离子源(esi源，美国absciex公司)；⑵.试剂：卡马西平(纯度99.3％)，购自中国药品生物制品检定所；乙腈、醋酸铵为色谱级；其他化学试剂均为分析纯。2.实验部分⑴.血浆样品预处理方法：血浆样品采于周龄为7～9周、体重为210±30g的健康成熟sd大鼠；按每公斤体重衡定量灌胃给予zcy-15后，经眼眶后静脉丛取血250μl，高速离心之后取上清液制成；取样量为80μl；取20μl血浆于1.5mlep管中，分别加入10μl内标(卡马西平，1μg·ml-1)和60μl乙腈，涡旋30s，然后13000r·min-1离心5min。吸取上清液至新的ep管中，取20μl加入到180μl流动相溶液中，涡旋30s，取10μl至进样瓶中进样；⑵.uplc-ms/ms分析条件色谱条件色谱柱：aqelavenusilasbc8色谱柱(2.1×50mm，3μm)，柱温：40℃；流动相为乙腈(有机相)-醋酸铵水溶液的混合液，采用梯度洗脱的方法，流动相配比时间变化如下：时间(min)有机相(％)0550.6552.1953.1953.2553.655表1流动相流速为：0.3ml·min-1；进样量：5μl；质谱条件离子源为esi源，多反应监测模式(mrm)进行正离子模式检测，定量分析的离子分别为：zcy-15：m/z313.2→163.1，碰撞能量为29ev，is：m/z237→194.1，碰撞能量为25ev；毛细管电压4.0kv，锥孔电压25v，脱溶剂气温度和源温度分别为400℃和120℃。zcy-15的最佳碰撞能量为29ev；上述色谱条件为典型条件，实际应用中应根据仪器的不同，对各参数进行适当调整，以获得最佳检测结果；⑶.uplc-ms/ms分析结果：样品zcy-15的质谱扫描图参见附图2。3.方法确证⑴.专属性：本发明方法中待测物与内标的专属性由标准曲线最低浓度与同法操作的空白血浆进行对比评价。空白血浆、含有zcy-15(1.95ng·ml-1)的空白血浆、实际血浆样品的色谱图分别参见图3、4、5，图中可见空白血浆中的内源性物质不会干扰zcy-15和内标的测定；⑵.标准曲线：zcy-15的标准曲线系列溶液由乙腈配制：取sd大鼠空白血浆，加入zcy-15标准曲线系列溶液，配制成含有zcy-15浓度为1.95、7.81、15.36、62.5、250、500、1000ng·ml-1的标准血浆溶液；分别取80μl按血浆样品预处理项下方法处理并进行uplc-ms/ms分析，采用加权最小二乘法进行回归分析，得到标准曲线，标准曲线方程为：y＝0.00342x 0.00031(r＝0.9995)，y代表待测药物与内标的峰面积之比，x代表待测化合物浓度。本发明方法中zcy-15定量测定线性范围为1.95～1000ng·ml-1，最低定量限为1.95ng·ml-1；⑶.提取回收率：按标准曲线系列溶液配制方法项下操作，制备低、中、高三个浓度分别为3.91、125、800ng·ml-1的质控样品，每个浓度进行6次样本分析，记录色谱峰。配制最终测定浓度的不含有基质的纯样品溶液进行分析，得到相应的峰面积，将二者峰面积进行比值，得到样品提取回收率。测定和分析结果如下：表2zcy-15的提取回收率(n＝6)如表2所示，zcy-15三个浓度的提取回收率分别为99.27％、100.00％、101.34％；⑷.精密度与准确度：按标准曲线系列溶液配制方法项下操作，制备低、中、高三个浓度分别为3.91、125、800ng·ml-1的质控样品，每个浓度进行6次样本分析，连续测定3天，方法精密度由求得的日内和日间的rsd(％)来评价，准确度由实测值与理论值的比值来评价，分析结果如下：表3血浆样品中zcy-15的uplc-ms/ms测定方法的准确度和精密度如表3所示，zcy-15的日内、日间精密度分别包含在5.85％～7.74％和5.64％～7.75％，准确度范围为-8.25％～-0.60％：均符合＜±15％的标准，说明本发明方法有很好的精密度和准确度；⑸.稳定性：sd大鼠血浆样品稳定性试验是按标准曲线系列溶液配制方法项下操作，制备zcy-15的低、高浓度分别为3.91和800ng·ml-1的两种qc血浆样品来考察。考察条件为：在-20℃条件放置100天和室温放置12小时后提取，样品处理后在进样管中放置24小时，冻融3次循环，测得的稳定性试验结果如下：表4血浆样品中zcy-15的稳定性实验结果如表4所示，zcy-15实测值与理论值的偏差均在±15％以内，符合要求，说明本方法具有良好的稳定性；⑹.基质效应：按标准曲线系列溶液配制方法项下操作，制备zcy-15的低、中、高三个浓度的质控样品，浓度分别为：3.91、125、800ng·ml-1，每个浓度进行6次样本分析，记录色谱峰结果。之后配制不含基质的最终测定浓度的纯样品溶液进行分析，得到对应的峰面积，以二者峰面积比值来考察样品的基质效应。测定和分析结果如下：浓度(ng·ml-1)基质效应(％)rsd(％)3.9194.52±6.747.1312591.19±3.724.0880093.83±8.529.09表5zcy-15的基质效应(n＝6)如表5所示，基质效应对样品测定的影响不大，符合要求。以上所述的实施例仅针对本发明优选的实施方式进行描述，并未对本发明的范围进行了限定，在不脱离本发明设计精神的原则下，本领域普通技术人员对于本发明的技术方案做出的所有变形和改进内容，均应属于本发明权利要求书确定的保护范围内。当前第1页1 2 3 
技术特征：

1.一种抗阿尔兹海默病候选化合物的血药浓度检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、样品预处理：给予zcy-15灌胃后的sd大鼠血浆中，加入乙腈和内标工作液，混合涡旋，离心，之后提取上清液进样；

步骤二、样品分离：采用高纯球形硅胶微粒作为填充剂的aqelavenusilasbc8色谱柱(2.1×50mm，3μm)，柱温：40℃；超高液相系统采用通用型二元高压泵和进样器，选取乙腈-醋酸铵水溶液的混合液作为流动相，梯度洗脱；

步骤三、二级质谱仪检测样品：采用esi离子源作为离子源，多反应监测模式(mrm)进行正离子模式检测；定量分析的离子分别为：zcy-15：m/z313.2→163.1，碰撞能量为29ev，is：m/z237→194.1，碰撞能量为25ev。

2.根据权利要求1所述的一种抗阿尔兹海默病候选化合物的血药浓度检测方法，其特征在于：所述血浆样品采于周龄为7～9周、体重为210±30g的健康成熟sd大鼠；经眼眶后静脉丛取血250μl，高速离心后取上清液配制而成；取样量为80μl。

3.根据权利要求1所述的一种抗阿尔兹海默病候选化合物的血药浓度检测方法，其特征在于：步骤(1)中，所述乙腈为色谱级溶液。

4.根据权利要求1所述的一种抗阿尔兹海默病候选化合物的血药浓度检测方法，其特征在于：步骤(1)中，所述内标工作液为卡马西平甲醇溶液，浓度为1μg·ml^-1。

5.根据权利要求1所述的一种抗阿尔兹海默病候选化合物的血药浓度检测方法，其特征在于：步骤(2)中，所述醋酸铵水溶液浓度为5mmol·l^-1。

6.根据权利要求1所述的一种抗阿尔兹海默病候选化合物的血药浓度检测方法，其特征在于：步骤(2)中，所述流动相为乙腈(有机相)-醋酸铵水溶液的混合液，采用梯度洗脱的方法，流动相配比时间变化如下：

时间(min)有机相(％)0550.6552.1953.1953.2553.655

表1

7.根据权利要求1所述的一种抗阿尔兹海默病候选化合物的血药浓度检测方法，其特征在于：步骤(3)中，所述质谱仪条件为毛细管电压4.0kv，锥孔电压25v，脱溶剂气温度和源温度分别为400℃和120℃。

技术总结
一种抗阿尔兹海默病候选化合物的血药浓度检测方法，包括以下步骤：(1)在给予ZCY‑15灌胃后的SD大鼠血浆中，加入乙腈和内标工作液，混合涡旋，离心，之后提取上清液进样；(2)采用高纯球形硅胶微粒作为填充剂的色谱柱，柱温：40℃；超高液相系统采用通用型二元高压泵和进样器，选取乙腈‑醋酸铵水溶液的混合液作为流动相，梯度洗脱；(3)采用ESI离子源作为离子源，多反应监测模式(MRM)进行正离子模式检测。定量分析的离子分别为：ZCY‑15：m/z313.2→163.1，碰撞能量为29eV，IS：m/z237→194.1，碰撞能量为25eV。本测定方法具有专属性强，灵敏度高，样品取样量小，预处理简单快捷，测定迅速准确，分析周期短等优点，特别适用SD大鼠血浆中ZCY‑15的血药浓度检测和药代动力学研究。

技术研发人员：林建阳;林城江;张东虎;孙珊珊;阎成炟;时月
受保护的技术使用者：中国医科大学附属第一医院
技术研发日：2020.01.20
技术公布日：2020.06.09