本发明涉及分子生物学检测技术，特别是涉及及一种检测新型冠状病毒和/或流感病毒的检测试剂盒及其使用方法。
背景技术：
2019新型冠状病毒（covid-19）属于乙型冠状病毒属病毒，是人类历史上确定的第7种可感染人的冠状病毒(hcov)，其基因特征与sars-cov和mers-cov有明显区别。2020年2月11日，国际病毒分类委员会（ictv）宣布，2019新型冠状病毒的分类名为严重急性呼吸综合证冠状病毒2（sars-cov-2），同日世界卫生组织（who）将这一病毒感染导致的疾病正式命名为covid-19。2019新型冠状病毒肺炎主要经飞沫、接触传播，人群普遍易感。2019新型冠状病毒感染的一般症状有：发热、乏力、干咳，逐渐出现呼吸困难，部分患者起病症状轻微，甚至可无明显发热。严重症状有：急性呼吸窘迫综合征、脓毒性休克、难以纠正的代谢性酸中毒、出凝血功能障碍。除上述症状，还有可能具有如下不典型症状：如轻度纳差、乏力、恶心呕吐、腹泻、头痛等。从目前的收治的病例情况看，多数患者预后良好，少数患者病情危重，甚至与其它基础性疾病并发导致死亡。因此及时、准确检测该新型冠状病毒十分重要。
流感病毒（influenzavirus）属于正粘病毒科（orthomyxoviridae），为单链rna膜病毒。流感病毒结构自外而内可分为包膜、基质蛋白以及核心三部分。流感病毒颗粒外膜有两种类型表面糖蛋白，一型为血细胞凝集素(h)，分为15个亚型，一型为神经氨酸酶(n)，分为9个亚型。它分为甲（a）、乙（b）、丙（c）三型，人流感主要是甲型流感病毒和乙型流感病毒引起的。其中，甲型流感的传染源主要是病人，其次是隐性感染者，以空气飞沫传播为主，其次是通过病毒污染的茶具、食具、毛巾等间接传播，密切接触也是传播流感的途径之一。病人自发病后5d内均可从鼻涕、口涎、痰液等分泌物排出病毒，传染期约1周，以病初2～3d传染性最强。感染后的症状主要表现为高热、咳嗽、流涕、肌痛等，多数伴有严重的肺炎，严重者心、肾等多种脏器衰竭导致死亡，病死率很高。而肺炎是最常见的并发症。乙型流感病毒仅在人之间传播，呈暴发或小流行，不引起世界性流感大流行。乙型和甲型流感的临床症状相似，但是甲型流感病毒导致的住院率四倍于乙型流感病毒。乙型流感通常有肌炎及胃肠道症状。乙型流感病毒的抗原变异很慢。
人流感主要是甲型流感病毒和乙型流感病毒引起的；丙型流感病毒虽然也能感染人类，但其抗原稳定，致病力较弱，主要侵犯幼儿和免疫力低下的人群。甲型流感病毒是最为常见的流感病毒，其亚型被称为禽流感。甲型流感病毒最容易发生抗原变异，这种变异被称为“飘变”(drift)，形象地说，“飘变”就是病毒通过细小的变化伪装自己，从而达到躲避人体免疫系统识别的目的。流感大流行就是甲型流感病毒出现新亚型或旧亚型重现引起的。甲型流感病毒可以进一步分为h1n1、h3n2、h5n1、h7n9等亚型(其中的h和n分别代表流感病毒两种表面糖蛋白)。甲型流感对人类致病性高，曾多次引起世界性大流行。乙型流感病毒的抗原变异较小，通常只引起流感的局部爆发。
由此可见，新型冠状病毒的感染后的症状与普通流感极其相似，早期快速诊断区分患者感染类型就能够及时指导临床治疗，为患者的合理用药提供依据，这对于对疫情监测以及预防具有重要意义。因此，发明一种能够同时快速准确检测区分新型冠状病毒covid-19与流感病毒的方法和试剂盒显得尤为迫切。
目前检测流感病毒的pcr检测试剂盒与新型冠状病毒covid-19的pcr检测试剂盒市面上已有销售，但是对于covid-19检测的灵敏度、准确度（比如减少假阴性等）等方面需要进一步提高，且尚未有相关的产品可实现新型冠状病毒covid-19与流感病毒的同步检测。本发明的目的即为解决上述问题。
技术实现要素：
基于此，本发明的目的在于提供一种检测新型冠状病毒（covid-19）和/或流感病毒的试剂盒及其使用方法。可用于体外定性检测新型冠状病毒感染的肺炎疑似病例、疑似聚集性病例患者、其他需要进行新型冠状病毒感染诊断或鉴别诊断者的鼻咽拭子、痰液等样本中的新型冠状病毒rna，同时检测样本中的流感病毒a/brna辅助排除疑似病例，可用于对新型冠状病毒感染患者的高效率、高特异性、低成本鉴别诊断。
在本发明的第一方面，提供了引物探针组合物，该组合物包括选自下组的一种或多种引物探针组：
用于检测新型冠状病毒orf1ab基因的引物探针组a，所述引物探针组a包括seqidno.1所示的正向引物，seqidno.2所示的反向引物，seqidno.3所示的探针；
用于检测新型冠状病毒s基因的引物探针组b，所述引物探针组b包括seqidno.4所示的正向引物，seqidno.5所示的反向引物，seqidno.6所示的探针；
用于检测新型冠状病毒n基因的引物探针组c，所述引物探针组c包括seqidno.7所示的正向引物，seqidno.8所示的反向引物，seqidno.9所示的探针；
用于检测新型冠状病毒e基因的引物探针组d，所述引物探针组d包括seqidno.10所示的正向引物，seqidno.11所示的反向引物，seqidno.12所示的探针；
用于检测流感病毒a的引物探针组e，所述引物探针组e包括seqidno.13所示的正向引物，seqidno.14所示的反向引物，seqidno.15所示的探针；
用于检测流感病毒b的引物探针组f，所述引物探针组f包括seqidno.16所示的正向引物，seqidno.17所示的反向引物，seqidno.18所示的探针；
用于检测内标的引物探针组g，所述引物探针组g包括seqidno.19所示的正向引物，seqidno.20所示的反向引物，seqidno.21所示的探针。
表1seqidno.1~21的序列信息表
进一步的，本发明所使用上述探针的5’端标记有荧光基团，3’端标记有荧光淬灭基团；所述荧光基团可选自fam、rox、vic、tamra、cy5、cy3、ned、tet、joe、hex；所述淬灭基团选自bhq1、bhq2、bhq3、mgb。优选的，针对不同靶基因的探针分别标记有不同的荧光基团。
本发明的第二方面，提供了一种用于病毒检测的试剂盒，所述试剂盒包括本发明第一方面所述的引物探针组合物。
优选的，所述引物探针组合物包括：用于检测新型冠状病毒的引物探针组a、引物探针组b、引物探针组c、引物探针组d的任意两种以上（“以上”包括两种的情形）；可选的，用于检测流感病毒a的引物探针组e；和可选的，用于检测流感病毒b的引物探针组f。
优选的，所述引物探针组合物包括如seqidno.1~6所示的引物探针组。
优选的，所述引物探针组合物包括如seqidno.1~6和seqidno.13~21所示的引物探针组。
优选的，所述引物探针组合物包括如seqidno.1~3和seqidno.7~12所示的引物探针组。
优选的，所述引物探针组合物包括如seqidno.1~3和seqidno.7~21所示的引物探针组。
优选的，所述引物在pcr反应体系中的终浓度之和在50～500nm之间，所述探针在pcr反应体系中终浓度之和在25～250nm之间。
优选的，所述试剂盒还包括内标及用于检测内标的引物探针组g。
优选的，所述新型冠状病毒和/或流感a/b病毒的样本来源于人鼻咽拭子、痰液样本、肺泡灌洗液样本、血液样本、粪便样本或环境样本。
进一步的，所述试剂盒还包括病毒保存液（如hank’s平衡盐、pbs缓冲液等）和核酸提取试剂。
进一步的，所述试剂盒还包括用于pcr检测的tris缓冲液、镁离子、da/g/c/utps、dna聚合酶、逆转录酶、ung酶。
进一步的，所述试剂盒还包括阳性对照品以及阴性对照品。
在本发明的第三方面，提供了本发明第一方面所述的引物探针组合物在制备通过如下方法检测新型冠状病毒和/或流感病毒的试剂盒中的用途，所述方法包括：样本采集、病毒核酸提取、核酸扩增、结果判定；所述结果判定包括在核酸扩增步骤得到的扩增曲线上的指数扩增阶段设定阈值（threshold），得到对应的ct值（circulatingthreshold），根据ct值对检测结果进行判定。其中对于新型冠状病毒核酸检测结果的判定是针对新型冠状病毒至少两个靶基因的核酸扩增得到的ct值综合判定。所述阈值可以在扩增曲线上的指数扩增阶段任意位置上设定，所述ct值是指扩增反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。
本发明的试剂盒可同时检测新型冠状病毒和流感病毒，能够实现两种病毒感染的区分，有效缓解门诊聚集大量的肺炎疑似病例和其他疑似聚集性病例患者从而形成的医疗“挤兑”。
本发明的检测新型冠状病毒使用新型冠状病毒的多个基因，相对于单基因检测而言，检测的准确度更高，可避免检测的假阳性或假阴性。另外，本发明采用的检测体系的特异性也更好，不受其他病原体及影响，灵敏度也更好，可实现新型冠状病毒和/或流感病毒低拷贝样本的检测。
附图说明
图1扩增曲线分析
图2orf1ab基因检测灵敏度
图3s基因检测灵敏度
图4流感病毒a检测灵敏度
图5流感病毒b检测灵敏度
图6试剂盒orf1ab基因检测特异性
图7试剂盒s基因检测特异性
图8试剂盒流感病毒a检测特异性
图9试剂盒流感病毒b检测特异性
图10orf1ab基因重复性检测结果
图11s基因重复性检测结果
图12流感病毒a重复性检测结果
图13流感病毒b重复性检测结果
图14orf1ab基因干扰实验验证
图15s基因干扰实验验证
图16流感病毒a干扰实验验证
图17流感病毒b干扰实验验证
图18orf1ab基因临床样本检测结果
图19s基因临床样本检测结果。
具体实施方式
针对新型冠状病毒核酸序列特点，设计包括新型冠状病毒orf1ab、n、e和s基因不同靶点引物探针，分别为检测新型冠状病毒荧光标记探针及引物组，和检测流感病毒a/b荧光标记探针及引物组，在同一反应体系内检测新型冠状病毒、流感病毒a/b，提高检测的准确性和可靠性，防止漏检。
另外为了对标本采集、核酸提取过程及pcr扩增过程进行监控，采用rna假病毒内标，针对假病毒内标设计特异性的引物探针，并加入到反应体系中进行pcr反应。该假病毒不包括新型冠状病毒、流感病毒a/b、人类基因组序列或相似序列，可用于独立对每个反应进行监控，监控试剂盒本身及实验操作是否正常，用以排除因试剂盒失效或个别样本操作失误导致的假阴性。
在引物、探针的设计过程中，本发明的引物探针可尽量避免发卡结构、引物内部二聚体、引物间二聚体以及错配的形成。此外，通过对ncbiblast在线数据库对上述设计的特异性引物和探针序列进行比对分析避免与其他病毒或人类基因发生非特异结合。
荧光定量pcr（flurogenicquantitativepolymerasechainreaction，fq-pcr），又称为实时定量pcr（real-timequantitativepcr,rt-qpcr）或定量pcr（qpcr），是由美国appliedbiosystems公司推出的一种定量试验技术，它是通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，标记跟踪pcr产物进行实时监测反应，获得扩增曲线，利用与之相适应的软件对产物进行分析，计算待测样品核酸模板的初始浓度。可以按如下步骤依据荧光定量pcr扩增曲线获得ct（cycle-threshold）值。
a.扩增曲线特征的描述：扩增曲线一般呈s型，可分为基线期、指数增长期、线性增长期和平台期（示例如图1）。
b.基线（baseline）设定：根据实验情况，选择荧光本底值较稳定的一段区域作为基线的设定范围。建议基线选取5~22个循环。
c.阈值（threshold）设定：δrn（校正后报告荧光强度）的一个值，由软件自动确定或手动设置，用于在实验分析中确定ct值。阈值设置应高于基线，且控制在扩增曲线的指数增长阶段范围内，一般以超过阴性对照品扩增曲线的最高点为准。
d.ct值（cycle-threshold）：阈值线与扩增曲线的交叉点确定ct值。
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
实施例1引物探针、试剂及检测方法
1.1引物探针序列
选取新型冠状病毒covid-19的orf1ab基因作为扩增靶区域，设计特异性引物和荧光探针，探针用fam标记，检测样本中是否含有新型冠状病毒rna。选取新型冠状病毒s基因，设计特异性引物和荧光探针，探针用rox标记，检测样本中是否含有新型冠状病毒rna。选取流感病毒a特征性保守序列，设计特异性引物和荧光探针，探针用cy5标记，检测样本中是否含有流感病毒arna。选取流感病毒b特征性保守序列，设计特异性引物和荧光探针，探针用vic标记，检测样本中是否含有流感病毒brna。选取非人基因组非试剂盒检测靶标的其他物种序列设计内标引物探针，探针用tamra标记，在反应体系中加入内标引物探针，用以监控整个实验流程。选取的引物探针组合如表2。
通过荧光定量pcr在abiprism®7500上检测样本中新型冠状病毒rna和流感a/b病毒rna。
表2本实施例选取的引物探针序列
1.2新型冠状病毒covid-19和流感a/b核酸联合检测（五色荧光pcr）所需试剂见表3，
表3各试剂组成成分
各组分浓度没有特殊要求，可使用常规的pcr反应浓度，比如：引物配制浓度均为0.1~1μmol/l，探针配置浓度均为0.05~0.5μmol/l。0.1~50mmol/l的datp，0.1~50mmol/l的dctp，0.1~50mmol/l的dgtp，0.1~100mmol/l的dutp，1~20mmol/l的mgcl2、体积百分比为30%~70%的无酶水；5~200u的逆转录酶，10~200u的rna酶抑制剂，1~50u的热启动dna聚合酶，1~10u的热敏udg酶。
1.3样本处理
（1）采用核酸提取试剂盒（例如上海思路迪核酸提取试剂见申请号202010085567.9的专利，或者qiagenqiaampdspviralrnaminikit）进行样本核酸的提取和纯化，阳性对照、阴性对照无需进行核酸提取，直接进行核酸检测；
（2）内标按照1μl/人份加入样本裂解液。如果只监控rt-pcr过程，则取0.5μl/人份加入抽提好的rna中。
1.4扩增检测
（1）根据待扩增样本数（含阳性对照和阴性对照）按以下比例分别配制pcr反应液，并分装至pcr反应管（板）中，分装体积为12.5μl。
（2）分别加入12.5μlrna模板、阴性对照和阳性对照，盖上管盖（若为pcr反应板则封膜），在室温（15℃-25℃）放置5分钟后转移到扩增检测区，将pcr反应管（板）放入荧光pcr扩增仪进行扩增检测。
（3）扩增检测参数设定：
（4）扩增反应及检测
按照如上设置进行扩增反应及检测，确定样本的ct值。
（5）参考值（ct值）
经对阴性样本和接近最低检测限样本的检测，确定本试剂盒fam通道的参考值为39.5，rox通道的参考值为39.0，vic通道的参考值是38.0，cy5通道的参考值是38.0。
（6）检测结果的解释
a.阴性对照（nc）的检测结果应为新型冠状病毒、流感病毒均阴性且内标阳性，若否，则此次检测结果无效，提示存实验操作或环境在核酸污染。
b.阳性对照（pc）的检测结果应为新型冠状病毒、流感病毒、内标均阳性，若否，则此次检测结果无效。
c.待测样本的检测结果根据表4、5、6进行判定：
表4新型冠状病毒检测结果判定方法
表5流感a检测结果判定方法
表6流感b检测结果判定方法
实施例2检测灵敏度
利用实施例1的引物探针组合（表2）、试剂及核酸扩增检测方法来验证灵敏度。
covid-19采用3份临床真实样本提取后的rna混合成1份，通过ddpcr定量后为6460copeis/μl，采用病毒保存液，将样本分别稀释到8copies/μl，0.8copies/μl，0.4copies/μl，0.2copies/μl，0.1copies/μl，0.05copies/μl，进行核酸提取后扩增。
流感病毒a（influa）采用第二代甲/乙型流感病毒核酸检测试剂国家参考品的s4（s4:influa/h3n2,1.2×104copies/μl）进行评价，采用病毒保存液分别进行10倍梯度稀释，分别稀释到1.2×103copies/μl，120copies/μl，12copies/μl，1.2copies/μl,0.12copies/μl，进行提取后扩增。
流感病毒b（influb）采用第二代甲/乙型流感病毒核酸检测试剂国家参考品的s1（s1:influb/victoria,2×104copies/μl）进行评价，采用病毒保存液分别进行10倍梯度稀释，分别稀释到2×103copies/μl，200copies/μl，20copies/μl，2opies/μl，0.2copies/μl进行提取后扩增。
对梯度稀释产物进行提取，使用三个生产批次的试剂盒进行检测，按95%阳性检出率确定最低检测限。根据梯度稀释后的检测结果，本试剂盒对covid-19的检测灵敏度是0.2copies/μl（图2和图3），对流感病毒a的检测灵敏度达到0.12copies/μl（图4），对流感病毒b的检测灵敏度达到0.2copies/μl（图5）。
实施例3特异性
利用实施例1的引物探针组合（表2）、试剂及核酸扩增检测方法来验证特异性。
为证明试剂盒的交叉反应性，选取了人冠状病毒oc43、人冠状病毒229e、人冠状病毒nl63、人冠状病毒hku1、sars冠状病毒、mers冠状病毒、脑膜炎双球菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、风疹病毒、腮腺炎病毒、呼吸道腺病毒3型、呼吸道腺病毒7型、呼吸道合胞病毒b型、副流感病毒2型、酿脓链球菌、百日咳鲍特菌、白假丝酵母、绿脓假单胞菌、表皮葡萄球菌等21种病原体和人基因组dna分别进行检测。
首先将病毒稀释至1e 05cfu/ml，细菌和人基因组dna稀释至1e 06copies/ml，然后使用核酸提取试剂盒提取各病原微生物的核酸后，covid-19进行荧光pcr检测（详细步骤参照实施例1），考察是否会与上述病原体或人基因组dna产生交叉反应。
从反应结果可以看出（图6、图7、图8、图9），21种病原体和人基因组dna均无交叉反应性，检测结果均为阴性，具有良好的特异性。
实施例4重复性检测
利用实施例1的引物探针组合（表2）、试剂及核酸扩增检测方法来进行重复性检测。
选用经ddpcr定值的covid-19阳性rna和国家盘中已知浓度的influa(s4)和influb(s1)，采用病毒保存液梯度稀释到5copies/ul作为阳性样本，记为r1，将r1继续10倍稀释到0.5copies/ul，作为弱阳性参考品，记为r2。结果表明，对新型冠状病毒和流感a/b检测重复性结果较好（图10、图11、图12、图13）。
实施例5干扰物检测
利用实施例1的引物探针组合（表2）、试剂及核酸扩增检测方法来进行干扰物检测。
选取了5种采样干扰物质：正常人全血、正常人痰液、正常人鼻分泌物，人血红蛋白、甘油三脂，以及11种在呼吸道感染中常用的药物作为药物干扰物质：干扰素、扎那米韦、利巴韦林、奥司他韦、帕拉米韦、鼻腔喷雾剂、滴鼻液、类固醇、黏蛋白、莫匹罗星、妥布霉素，研究了这些干扰物质的影响。
将covid-19阳性rna和流感病毒a/brna用病毒保存液稀释到2×lod（最低检测限），按照10%医学水平的比例或浓度的采样干扰物质以及药物说明书中的用量的最高浓度作为干扰浓度加入到稀释样本中，以未加入干扰物质为对照，经核酸提取后进行荧光pcr检测，每个样本重复测定3次，对结果进行阴阳性判断，评价各干扰物质加入前后对检测结果的影响。
图中（图14、图15、图16、图17）可以看出，加入5种采样干扰物质和11种药物的样本与各对照相比，不影响阴阳性的判断。
实施例6临床样本检测
利用实施例1的引物探针组合（表2）、试剂及核酸扩增检测方法来进行临床样本检测。
收集了44例临床样本，用本试剂盒进行检测，并根据ct值对结果进行判读，检测结果（图18和图19），44例临床样本中，共检出23例新型冠状2病毒covid-19核酸阳性临床样本，21例新型冠状病毒covid-19核酸阴性，流感a/b均为阴性。同时使用sanger测序或二代测序对检测结果进行验证，结果表明本试剂盒检测准确率达到了100%。
实施例7引物探针、试剂及检测方法
选取新型冠状病毒covid-19的orf1ab基因作为扩增靶区域，设计特异性引物和荧光探针，探针用fam标记，检测样本中是否含有新型冠状病毒rna。选取新型冠状病毒n基因和e基因，设计特异性引物和荧光探针，探针用rox标记，检测样本中是否含有新型冠状病毒rna。选取流感病毒a特征性保守序列，设计特异性引物和荧光探针，探针用cy5标记，检测样本中是否含有流感病毒arna。选取流感病毒b特征性保守序列，设计特异性引物和荧光探针，用vic标记，检测样本中是否含有流感病毒brna。选取非人基因组非试剂盒检测靶标的其他物种序列设计内标引物探针，探针用tamra标记，在反应体系中加入内标引物探针，用以监控整个实验流程
本实施例所选取的引物探针组合如表7所示：
表7本实施例所选取的引物探针组合
通过荧光定量pcr在abiprism®7500上检测样本中新型冠状病毒rna。
1）新型冠状病毒covid-19和流感a/b核酸联合检测所需试剂见表8，
表8各试剂组成成分
2)样本处理
2.1内标按照1μl/人份加入样本裂解液。如果只监控rt-pcr过程，则取0.5μl/人份加入抽提好的rna中。
2.2采用另购的核酸提取试剂盒进行样本核酸的提取和纯化，阳性对照、阴性对照无需进行核酸提取，直接进行核酸检测；
3)扩增检测
3.1根据待扩增样本数（含阳性对照和阴性对照）按以下比例分别配制pcr反应液，并分装至pcr反应管（板）中，分装体积为12.5μl。
3.2分别加入12.5μl模板、阴性对照和阳性对照，盖上管盖（若为pcr反应板则封膜），在室温（15℃-25℃）放置5分钟后转移到扩增检测区，将pcr反应管（板）放入荧光pcr扩增仪进行扩增检测。
3.3扩增检测参数设定：
3.4参考值及检测结果判定
阴性对照（nc）的检测结果应为新型冠状病毒、流感病毒均阴性且内标阳性，若否，则此次检测结果无效，提示存实验操作或环境在核酸污染。
阳性对照（pc）的检测结果应为新型冠状病毒、流感病毒、内标均阳性，若否，则此次检测结果无效。
待测样本的检测结果根据表4、表5、表6的方法进行判定。
4）实验验证
收集了282例临床样本进行检测，并根据ct值对结果进行判读，检测结果如表9所示。282例临床样本中，共检出133例新型冠状病毒covid-19核酸阳性临床样本，149例新型冠状病毒covid-19核酸阴性，流感a/b均为阴性。同时使用二代测序对检测结果进行验证，结果表明阳性符合率为99.3%，阴性符合率为100%。
表9282例临床样本检测结果汇总
实施例8临床样本检测
我们选取了50例弱阳性的临床样本，利用不同组合基因的引物探针组合进行检测，并对结果进行判读。新型冠状病毒单基因检测采用fam通道进行检测，检测结果参照表10进行判定；当新冠单基因与流感病毒a/b联合检测时，参照表10、表5和表6进行判定。新型冠状病毒多基因（即使用多个新型冠状病毒的靶基因）检测采用fam通道和rox通道进行检测，检测结果判读方式如表4；当新冠多基因与流感病毒a/b联合检测时，根据表4、表5、表6进行判定。所有样本的检测结果汇总（表11）所示：
表10单基因检测结果判读
表11不同引物组合检测临床样本检测数据汇总
*备注：表11中单基因情形选择fam检测通道；双基因情形，第一个基因（加号左边）选择fam，第二个基因（加号右边）选择rox；三基因情形，前面一个基因选择fam，后面两个基因选择rox；四基因情形，前面两个选择fam，后面两个选择rox通道。假阴性率=100%–阳性样本检出率。
50例弱阳性临床样本中，使用单基因检测弱阳性临床样本的阳性检出率在40%-70%，假阴性率在30%-60%，而多基因联合检测的阳性样本的检出率均在90%以上，假阴性率在10%以下。综上所述，多基因的联合检测相对于单基因检测而言，检测灵敏度更高，阳性样本的检出率更高，可避免错检漏检的发生。
序列表
<110>上海思路迪医学检验所有限公司
<120>一种检测新型冠状病毒和流感病毒的试剂盒
<130>lt2004064f
<160>21
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
caacaagacggcagtgagga20
<210>2
<211>29
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
cacttcaatagtctgaacaactggtgtaa29
<210>3
<211>35
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
tcagacaactactattcaaacaattgttgaggttc35
<210>4
<211>25
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>4
gtagcacaccttgtaatggtgttga25
<210>5
<211>36
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>5
gcgcaaaagaaagtactactactctgtatggttggt36
<210>6
<211>35
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>6
ttgttactttcctttacaatcatatggtttccaac35
<210>7
<211>24
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>7
gaacttctcctgctagaatggctg24
<210>8
<211>28
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>8
gcggcctttaccagacattttgctctca28
<210>9
<211>28
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>9
ctgctcttgctttgctgctgcttgacag28
<210>10
<211>23
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>10
cttgctttcgtggtattcttgct23
<210>11
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<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>11
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agggcattytggacaaakcgtcta24
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tgcagtcctcgctcactgggcac23
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ctcctcgcttcgacacctgttcttcg26
1.引物探针组合物，其特征在于，包括选自如下的一种或多种引物探针组：
用于检测新型冠状病毒orf1ab基因的引物探针组a，所述引物探针组a包括seqidno.1所示的正向引物，seqidno.2所示的反向引物，seqidno.3所示的探针；
用于检测新型冠状病毒s基因的引物探针组b，所述引物探针组b包括seqidno.4所示的正向引物，seqidno.5所示的反向引物，seqidno.6所示的探针；
用于检测新型冠状病毒n基因的引物探针组c，所述引物探针组c包括seqidno.7所示的正向引物，seqidno.8所示的反向引物，seqidno.9所示的探针；
用于检测新型冠状病毒e基因的引物探针组d，所述引物探针组d包括seqidno.10所示的正向引物，seqidno.11所示的反向引物，seqidno.12所示的探针；
用于检测流感病毒a的引物探针组e，所述引物探针组e包括seqidno.13所示的正向引物，seqidno.14所示的反向引物，seqidno.15所示的探针；
用于检测流感病毒b的引物探针组f，所述引物探针组f包括seqidno.16所示的正向引物，seqidno.17所示的反向引物，seqidno.18所示的探针；
用于检测内标的引物探针组g，所述引物探针组g包括eqidno.19所示的正向引物，seqidno.20所示的反向引物，seqidno.21所示的探针。
2.一种用于病毒检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物探针组合物。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述引物探针组合物包括：
用于检测新型冠状病毒的引物探针组a、引物探针组b、引物探针组c、引物探针组d的任意两种以上；
可选的，用于检测流感病毒a的引物探针组e；和
可选的，用于检测流感病毒b的引物探针组f。
4.如权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，所述引物探针组合物包括如seqidno.1~6所示的引物探针组。
5.如权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，所述引物探针组合物包括如seqidno.1~6和seqidno.13~21所示的引物探针组。
6.如权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，所述引物探针组合物包括如seqidno.1~3和seqidno.7~12所示的引物探针组。
7.如权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，所述引物探针组合物包括如seqidno.1~3和seqidno.7~21所示的引物探针组。
8.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括内标及用于检测内标的引物探针组g。
9.如权利要求2或3或8所述的试剂盒，其特征在于，所述引物在pcr反应体系中的终浓度之和在50～500nm之间，所述探针在pcr反应体系中终浓度之和在25～250nm之间。
10.如权利要求2或3或8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括tris缓冲液、镁离子、da/g/c/utps、dna聚合酶、逆转录酶、ung酶。
11.如权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品。
12.如权利要求2或3或8所述的试剂盒，其特征在于，所述新型冠状病毒和/或流感病毒的样本来源于人鼻咽拭子、痰液样本、肺泡灌洗液样本、血液样本、粪便样本或环境样本。
13.如权利要求1所述的引物探针组合物在制备通过如下方法检测新型冠状病毒和/或流感病毒的试剂盒中的应用，其特征在于，所述方法包括：
样本采集、病毒核酸提取、核酸扩增、结果判定；
所述结果判定包括在核酸扩增步骤得到的扩增曲线上的指数扩增阶段设定阈值，得到对应的ct值，根据ct值判定病毒核酸检测结果；
其中对于新型冠状病毒核酸检测结果的判定是针对新型冠状病毒至少两个靶基因的核酸扩增得到的ct值综合判定。
技术总结