本发明属于食品检测领域，涉及一种检测蜂蜜中外源甜菜糖的方法。
背景技术：
：蜂蜜是颇受青睐的养生保健食品，经过几十年的发展，我国蜂蜜产业取得了很大的成绩：目前，我国蜂群总数已达到920万群，占世界蜂群总数的13％。我国蜂蜜产量从2011年的41.18万吨上升到2018年的54.25万吨，居世界之首，出口量12.93万吨，同比增长0.74％，是世界蜂蜜贸易量的1/4。目前我国蜂产业已经步入了快速发展的轨道，全国已有1300余家不同规模的蜂产品加工企业取了国家认证，其中国家级龙头企业有七家，省级龙头企业35家，行业龙头企业65家。由于蜂蜜属于靠天吃饭的产业，近年来蜂蜜造假事件频发，一些蜂蜜生产企业为了降低成本赚取利润，在售价较高的蜜种中掺入价格低廉的油菜花蜜等，有些企业甚至为了提高产量在蜂蜜中加入蔗糖、糖浆等廉价原料。为了规范蜂蜜行业的发展，打击假冒伪劣产品，保障消费者权益，中国蜂产品协会制定了《蜂蜜》团体标准，相对于国家标准增加了蜂蜜真实性判定的检验方法，明确了应用碳同位素技术检测蜂蜜中的碳-4类植物糖，但该方法仅限于检测甘蔗糖、玉米糖浆等碳-4类植物糖，诸如甜菜等物质与蜜源植物同属碳-3植物，碳同位素技术失去作用。氢同位素特征可用于检测蜂蜜中的甜菜糖，但由于氢同位素比值测定时需排除蜂蜜中水分、蜂蜜中糖的羟基氢的影响，因而不能直接利用蜂蜜中氢同位素比值的平均值。在此背景下，美国分析化学家协会(aoac)制定了点特异性分馏-核磁共振(snif-nmr)检测蜂蜜中甜菜糖的方法。该方法需要①将蜂蜜稀释后经过酵母菌发酵转换成乙醇，由于糖转化为乙醇过程中，一些不可交换氢成分会转移到乙醇的甲基位点上；②通过特定微蒸馏系统在保证无同位素分馏的情况下从发酵液中分离提取乙醇，③准确测定提取物中乙醇浓度并精确称量乙醇进样量，④使用大功率核磁共振波谱仪测定乙醇甲基上的氢同位素比值，记为蜂蜜中糖的不可交换氢的同位素比值。然而，该技术存在两大缺点：①上述微蒸馏系统需要特别定制才能达到回收率高于96.5％、馏分中乙醇浓度大于95％v/v的要求，该微蒸馏系统为法国eurofins公司的专利产品，单套需80万人民币，而且使用过程中对操作人员的熟练程度要求高，尽管如此，单次蒸馏的时间也需要4h以上；②核磁共振仪测定乙醇甲基的氢同位素比值，其原理是测定定量样品中甲基位点的氘的绝对含量，由于自然状态下氘的含量仅占氢原子的0.02％，因此为得到足够的信噪比和稳定性，单一样品的测定时间长达5h以上。上述两个缺陷导致该项技术的分析效率很低，而且我国至今尚无一单位能够运用该技术，这严重妨碍了我国在蜂蜜掺假检测领域的研究与应用。技术实现要素：本发明提出采用稳定同位素技术准确分析蜂蜜中总糖的不可交换氢的稳定氢同位素特征，构建该特征的数据库，并以此为基础检验产品中是否含有甜菜糖。本发明提出一种检测蜂蜜中外源甜菜糖的方法，包括如下步骤：1)选取原蜜样品，去除水分，配制原蜜样品的水溶液，发酵，将原蜜样品转化成乙醇，测定乙醇的氢同位素比值，构建原蜜转化的乙醇的氢同位素比值数据库；2)将待测蜂蜜，去除水分，配制待测蜂蜜的水溶液，发酵，将待测蜂蜜转化成乙醇，测定乙醇的氢同位素比值；3)将步骤2)待测蜂蜜乙醇的氢同位素比值测定结果与步骤1)所得原蜜样品的乙醇的氢同位素比值数据库进行比较，若待测蜂蜜的测定结果小于数据库的最小值，则认定待测蜂蜜中添加了甜菜糖。进一步地，步骤1)和步骤2)中，去除水分包括：将原蜜样品或待测蜂蜜用水溶解，冷冻干燥，得固体粉末。本发明中，所述原蜜样品为真实蜂蜜，是无任何非法添加的产品，其所构建数据库为真实有效的数据库。进一步地，步骤1)和步骤2)中，去除水分、配制原蜜样品的水溶液、配制待测蜂蜜的水溶液中，所使用的水为相同的水，且水中氢同位素比值相同。进一步地，步骤1)和步骤2)中，发酵的条件相同；发酵的条件包括：分别向原蜜样品的水溶液、待测蜂蜜的水溶液加入活性干酵母，30±0.5℃厌氧发酵直至发酵结束。进一步地，所述活性干酵母的添加量为0.5wt％。进一步地，步骤1)和步骤2)中，乙醇的氢同位素比值用气相色谱-裂解-稳定同位素比值质谱技术测定。本发明中，上述技术中，气相色谱从发酵液等含氢混合物中在线分离乙醇，并在裂解装置中将乙醇上的6个氢原子均转变成氢气，再利用稳定同位素比值质谱仪测定乙醇的氢同位素比值，无需离线提纯乙醇，操作简单，方便快捷。进一步地，步骤1)和步骤2)中，发酵所得发酵液中乙醇在进样前用无水丙酮稀释至8g/l。进一步地，步骤3)中，数据库中数据为每年从全国范围内的同类蜂蜜的原蜜样品中获得，数量至少30个。进一步地，所述原蜜、待测蜂蜜均为木本植物的花蜜；所述木本植物的花蜜包括椴树蜜、槐树蜜、枣花蜜中的一种或两种以上。本发明中，由于椴树蜜、槐树蜜、枣花蜜这种木本植物的花蜜的总糖中不可交换氢的δ2h明显高于甜菜糖总糖中的δ2h，故可通过此法进行检测。进一步地，步骤4)中，待测蜂蜜中总糖包括蜂蜜中所含有的葡萄糖、果糖和蔗糖，以及外源甜菜糖。本发明具有以下优势：本发明基于代谢组学、稳定同位素分馏原理和稳定同位素比值分析技术实现了蜂蜜中甜菜糖的检测，通过稳定同位素技术检测蜂蜜中甜菜糖的方法，去除蜂蜜中水分影响、排除蜂蜜糖中羟基氢交换的干扰，分析蜂蜜糖中不可交换氢的同位素特征并建立数据库，通过对比，据此判断待测样品是否含有甜菜糖。本发明提供的方法，克服了当前需要snif-nmr系统的技术难题，有效解决了蜂蜜领域中缺乏简单快速、低成本检验甜菜糖的方法的应用技术难题。具体实施方式需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。实施例1待测洋槐蜜中甜菜糖检测a)收集对照样品：从洋槐蜜生产企业采集纯正无添加的同一品种原蜜样品()31个，记录采样时间与地点；b)获取待测样品：登记待测洋槐蜜()的详细信息，分为待测样品一与待测样品二；c)从各对照样品和待测样品中取出30g洋槐蜜，用25g水溶解后进行冷冻干燥，取粉末待用；d)分别取各样品的固体粉末20g，用80g水(水中δ2h固定且统一，如均为-80.49‰)溶解，加0.5g活性干酵母，30℃厌氧发酵，将糖分转化为乙醇，得发酵液；e)取各发酵液1ml，用无水丙酮将发酵液稀释至乙醇浓度8g/l，用0.22um水系滤膜过滤后保存待用；f)调整气相色谱-裂解-稳定同位素比值质谱系统的工作状态，测定丙酮稀释后的各发酵液中乙醇的氢同位素比值；测得原蜜数据库中的乙醇δ2h值分布范围为-321.88‰～-304.27‰；测得样品一乙醇δ2h值为-330.53‰，测得样品二乙醇δ2h值为-317.97‰；g)对比待测洋槐蜜与原蜜数据库的乙醇δ2h值可知：样品一的乙醇δ2h值小于数据库最小值，可判定为产品中含有甜菜糖；样品二的乙醇δ2h值符合数据库的分布范围，可判定为产品中不含甜菜糖。试验例1验证本发明检测方法的准确性a)选取一个甜菜糖(编号1#)和一个原蜜样品(编号2#)为研究对象；b)根据原蜜样品的含糖量，分别向其中加入20％、40％、60％和80％的甜菜糖，编号分别为3#、4#、5#和6#；c)从上述6个样品中各取30g，加入30g水后进行冷冻干燥，保留固体粉末待用；h)取各样品的固体粉末20g，各加入δ2h＝-80.49‰的水80ml，加入0.5g活性干酵母，30℃厌氧发酵，将糖分转化为乙醇，得发酵液；i)取各发酵液1ml，用无水丙酮将发酵液稀释至乙醇浓度8g/l左右，用0.22um水系滤膜过滤后保存待用；j)调整气相色谱-裂解-稳定同位素比值质谱系统的工作状态，测定丙酮稀释后的各发酵液中乙醇的氢同位素比值，结果见表1。k)同时预测值。根据原蜜样品和甜菜糖的混合比例计算而得。表1各样品转化的乙醇δ2h值(‰)样品编号1#2#3#4#5#6#测定值-371.07-305.43-315.00-333.46-341.62-360.36预测值---318.56-331.69-344.81-357.94差异--3.56-1.773.19-2.42由表1可知，预测值与测定值的差值的绝对值均＜4‰，符合稳定同位素比值质谱仪测定氢同位素比值的标准偏差＜3‰要求，且测定值与预测值的线性相关系数r2为0.9893，因此可说明本发明方法能够准确分析蜂蜜转化的乙醇的氢同位素比值。与实施例1中蜂蜜乙醇的氢同位素数据库对比，由本例可知，当蜂蜜中掺入甜菜糖比例高于25％时乙醇δ2h值已小于数据库的最小值，即可判定为蜂蜜中含有甜菜糖。以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页1 2 3
技术特征：1.一种检测蜂蜜中外源甜菜糖的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)选取原蜜样品，去除水分，配制原蜜样品的水溶液，发酵，将原蜜样品转化成乙醇，测定乙醇的氢同位素比值，构建原蜜转化的乙醇的氢同位素比值数据库；
2)将待测蜂蜜，去除水分，配制待测蜂蜜的水溶液，发酵，将待测蜂蜜转化成乙醇，测定乙醇的氢同位素比值；
3)将步骤2)所得待测蜂蜜的乙醇的氢同位素比值测定结果与步骤1)所得原蜜样品的乙醇的氢同位素比值数据库进行比较，若待测蜂蜜的测定结果小于数据库的最小值，则认定待测蜂蜜中添加了甜菜糖。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
步骤1)和步骤2)中，去除水分包括：将原蜜样品或待测蜂蜜用水溶解，冷冻干燥，得固体粉末。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，
步骤1)和步骤2)中，去除水分、配制原蜜样品的水溶液、配制待测蜂蜜的水溶液中，所使用的水为相同的水，且水中氢同位素比值相同。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
步骤1)和步骤2)中，发酵的条件相同；发酵的条件包括：分别向原蜜样品的水溶液、待测蜂蜜的水溶液加入活性干酵母，30±0.5℃厌氧发酵直至发酵结束。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
步骤1)和步骤2)中，乙醇的氢同位素比值用气相色谱-裂解-稳定同位素比值质谱技术测定。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
步骤1)和步骤2)中，发酵所得发酵液中乙醇在进样前用无水丙酮稀释至8g/l。
7.根据权利要求1和3所述的方法，其特征在于，
步骤3)中，数据库中数据为每年从全国范围内的同类蜂蜜的原蜜样品中获得，数量至少30个。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
所述原蜜、待测蜂蜜均为木本植物的花蜜；所述木本植物的花蜜包括椴树蜜、槐树蜜、枣花蜜中的一种或两种以上。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
步骤4)中，待测蜂蜜中总糖包括葡萄糖、果糖和蔗糖，以及外源甜菜糖。
技术总结本发明提出一种检测蜂蜜中外源甜菜糖的方法，属于食品检测领域。该方法包括如下步骤：1)选取原蜜样品，去除水分，配制原蜜样品的水溶液，发酵，将原蜜样品转化成乙醇，测定乙醇的氢同位素比值，构建原蜜转化的乙醇的氢同位素比值数据库；2)将待测蜂蜜，去除水分，配制待测蜂蜜的水溶液，发酵，将待测蜂蜜转化成乙醇，测定乙醇的氢同位素比值；3)将步骤2)待测蜂蜜乙醇的氢同位素比值测定结果与步骤1)所得原蜜样品的乙醇的氢同位素比值数据库进行比较，若待测蜂蜜的测定结果小于数据库的最小值，则认定待测蜂蜜中添加了甜菜糖。本发明主要用于检测蜂蜜中外源甜菜糖，有效解决了蜂蜜领域中缺乏简单快速、低成本检验甜菜糖的方法的应用技术难题。
技术研发人员：钟其顶;王道兵
受保护的技术使用者：中国食品发酵工业研究院有限公司
技术研发日：2020.02.06
技术公布日：2020.06.09
