本发明属于稳定同位素技术研究领域，具体涉及一种分析糖中不可交换氢的稳定氢同位素比值的方法。
背景技术：
：氢原子是构成生命体的重要元素，根据中子数的不同氢原子可分为氢/氕(h)、氘(2h)和氚(3h)，其中h和2h是稳定同位素，基于稳定同位素的自然分馏效应，不同来源的含氢化合物具有不同的氢同位素比值(2h/h，记作δ2h)，因而自然丰度背景下的生命物质δ2h值在气候生态学、水文科学、法庭科学、食品真实性研究等领域具有重要研究和应用。生命物质(如纤维素、糖、蛋白质、脂肪等)的分子中氢原子的结合方式有四类：一是直接结合在碳原子上，二是直接结合在氮原子上形成胺基，三是直接结合在硫原子上形成巯基，四是直接结合在氧原子上形成羟基。由于不同原子与氢结合时构成的基团的电子云差异，从稳定同位素分析的角度分析，直接结合在碳原子上的氢结合最紧密，不会与周围环境中其他分子上的氢进行交换，被称为是“不可交换氢”。然而，胺基、巯基和羟基上的氢结合比较不稳定，容易与其他分子上的羟基和巯基进行氢原子交换，因而属于“可交换氢”。由于生命体中含有大量的水，测定生命物质的δ2h时不只需排除水的干扰，还应考虑水对生命物质中可交换氢部分的影响。因此，稳定同位素分析领域通常研究生命物质的不可交换氢部分的δ2h值以代替生命物质整体的δ2h值。目前，测定不可交换氢部分的δ2h值的方法是通过化学结构相近的物质进行校正，或采取置换的方式将生命物质的可交换氢原子除去的方法，如：jeffreyf.kelly等人测定标准物质和样品(包括羽毛、血液、土壤有机质等)的整体δ2h值，由于已知标准物质的不可交换氢部分的δ2h值，通过计算得出样品的不可交换氢部分的δ2h值；l.i.wassenaar等人开发了一种离线平衡-双路进样系统分析方法，将羽毛样品在水蒸气中反应一定时间使样品的可交换氢与水蒸气中的氢达到平衡，然后将样品转化成水再进行分析的方法；johns.roden等人和marcs.filot等人采用l.i.wassenaar的方法研究了纤维素的不可交换氢部分的δ2h值；zacharyd.sharp等人采用上述方法研究了头发不可交换氢部分的δ2h值并用于法庭科学；petere.sauer等人简化了样品-水蒸气平衡系统。分析可得，上述研究对象羽毛、纤维素、头发等有机质均为不吸水或难吸水的物质，因此可通过水蒸气进行氢同位素交换，进而通过烘干、氮吹的方式除去用于平衡反应的水分子。然而，糖属于极易吸水的物质，上述方法不仅不能避免糖中可交换氢的影响，还会因吸水而引入非糖分子的氢原子影响测定结果。在糖的不可交换氢部分δ2h的分析方法研究中，主要包括两类：johndunbar【dunbar,j.,schmidt,h.-.measurementofthe2h/1hratiosofthecarbonboundhydrogenatomsinsugars.z.anal.chem.317,853–857(1981)doi:10.1007/bf00466937】将糖进行硝化处理，用硝基取代糖中的可交换氢，然后再燃烧成水，通过分析水的氢同位素比值进而得出糖中不可交换氢的氢同位素比值，由于添加浓硝酸、乙酸酐等试剂，存在安全风险，并且前处理过程很复杂；simonkelly将糖中的果糖分子用液相色谱分离收集后进行衍生处理，转化成六亚甲基四胺后用气相色谱-裂解-稳定同位素比值质谱分析，由于涉及衍生化，引入了大量的非糖氢原子，难以准确测定，并且衍生物-六亚甲基四胺的毒性较大，且该方法只适用于果糖分析，不能分析葡萄糖、蔗糖等糖类，因此长久以来两个方法均难以推广应用。技术实现要素：本发明开发了一种基于代谢组学和稳定同位素分析技术分析糖中不可交换氢的稳定氢同位素比值δ2h值的方法，该方法操作简单，分析快速效率高，安全无风险。本发明提出一种分析糖中不可交换氢的稳定氢同位素比值的方法，包括如下步骤：1)选择不可交换氢的稳定氢同位素比值已知的糖化合物作为工作标准，配制上述糖化合物的水溶液，发酵，转化成乙醇，测定发酵液中乙醇的氢同位素比值；2)建立乙醇的氢同位素比值δ2h乙醇与作为工作标准的糖化合物中不可交换氢的稳定氢同位素比值δ2h糖不可交换氢的关系模型，得δ2h糖不可交换氢＝a*δ2h乙醇 b；3)配制待测糖的水溶液，发酵，使得糖分转变成乙醇，测定待测糖发酵液中乙醇的氢同位素比值；4)将待测糖发酵液中乙醇的氢同位素比值代入上述关系模型中，计算，得待测糖中不可交换氢的稳定氢同位素比值。进一步地，步骤1)中，作为工作标准的糖类化合物至少为3个，且不可交换氢的稳定氢同位素比值互不相同。进一步地，配制步骤1)中糖化合物的水溶液、配制步骤3)中待测糖的水溶液时，所使用的水来源相同，且水中氢同位素比值相同。进一步地，步骤1)中糖化合物的水溶液中糖浓度、步骤3)中待测糖的水溶液中糖浓度相同；所述糖浓度为170g/l～280g/l。进一步地，步骤1)、步骤3)中，发酵的条件相同；具体包括：向糖化合物的水溶液或待测糖的水溶液中加入活性干酵母，30±0.5℃厌氧发酵直至发酵结束。进一步地，所述活性干酵母的添加量为0.5wt％。进一步地，步骤3)中，去除待测糖中水分采用冷冻干燥方式。进一步地，步骤2)、步骤4)中，乙醇的氢同位素比值用气相色谱-裂解-稳定同位素比值质谱仪(gc-p-irms)测定。任选地，确认气相色谱-裂解-稳定同位素比值质谱系统的工作环境、气密性、离子室的真空度均符合要求，检验仪器测定δ2h的精密度和稳定性，必要时调整离子源参数值。进一步地，所述糖包括葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖。可用于检测国标gb5009.8-2016中规定的5种糖。本发明具有以下优势：本发明基于代谢过程中的同位素分馏机理，选择不可交换氢的氢同位素比值已知的糖化合物作为工作标准，将其转化成乙醇后，测定乙醇中氢同位素比值特征，二者(已知的糖化合物氢不可交换氢的稳定氢同位素比值、转化成的乙醇中氢同位素比值)之间建立关系模型；待测糖的水溶液发酵将糖转化成乙醇，测定乙醇的氢同位素比值，将该结果代入关系模型中，计算得待测糖中不可交换氢的稳定氢同位素比值。本发明操作简单，实验成本低，分析快速效率高，安全无风险，适合大批量样品的分析测试。具体实施方式需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。实施例1建立作为工作标准的糖化合物发酵液中乙醇的δ2h乙醇与糖中不可交换氢δ2h糖不可交换氢的关系模型1)选择三个糖化合物工作标准物质，其不可交换氢的δ2h糖不可交换氢值分别为-125.35‰、-101.25‰和-80.63‰；其中，工作标准的糖化合物优选葡萄糖，其不可交换氢的δ2h糖不可交换氢值通过johndunbar等人所提出的方法测得。2)将三个作为工作标准的糖化合物分别配制成200g/l的糖水溶液，加入0.5g活性干酵母后，30±0.5℃进行酒精发酵。3)发酵液离心后取澄清液，用气相色谱-裂解-稳定同位素比值质谱仪测定发酵液中乙醇的δ2h乙醇值，结果见表1。表1糖与乙醇的δ2h对比结果根据表1数据可得，发酵液乙醇的δ2h乙醇与糖中不可交换氢的δ2h糖不可交换氢的关系模型：δ2h糖不可交换氢值＝0.9848*δ2h乙醇 241.88。其中，r2＝0.9854。实施例2分析待测糖中不可交换氢的氢同位素比值取2个蔗糖样品和1个葡萄糖为研究对象，将各样品配制成200g/l的糖水溶液后，加0.5g活性干酵母进行酒精发酵，测定发酵液中乙醇的δ2h乙醇测定值，结果见表2。表2蔗糖与葡萄糖发酵乙醇的δ2h乙醇测定测定值指标蔗糖1#蔗糖2#葡萄糖δ2h乙醇测定(‰)-365.69-330.18-317.03将表2各数据代入实施例1的关系模型中，计算得出糖的不可交换氢的δ2h糖不可交换氢计算值，结果见表3。表3糖的不可交换氢的δ2h糖不可交换氢计算计算值指标蔗糖1#蔗糖2#葡萄糖δ2h糖不可交换氢计算(‰)-118.26-83.29-70.34实施例3验证本发明方法的准确性选择不可交换氢的δ2h值已知的葡萄糖(δ2h糖不可交换氢＝-132.59)为测试样品，配制3份葡萄糖水溶液100g，加0.5g活性干酵母发酵，分别测定发酵液中乙醇的δ2h值，结果见表4。表4葡萄糖发酵液中乙醇重复性测定结果指标重复1重复2重复3δ2h乙醇测定(‰)-381.84-375.99-378.68由表4可知，三份发酵液中乙醇氢同位素比值(δ2h乙醇测定)的标准偏差为2.93‰，符合稳定同位素比值质谱测定δ2h值的精密度要求。三份发酵液的平均测定结果为-378.84‰，根据实施例1中的关系模型计算得出δ2h糖不可交换氢计算为-131.20‰，与给定值之间的差值仅1.39‰，在仪器的测定误差范围内，因此，本发明方法能够准确测定糖中不可交换氢的氢同位素比值。以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页1 2 3
技术特征：1.一种分析糖中不可交换氢的稳定氢同位素比值的方法，包括如下步骤：
1)选择不可交换氢的稳定氢同位素比值已知的糖化合物作为工作标准，配制上述糖化合物的水溶液，发酵，转化成乙醇，测定发酵液中乙醇的氢同位素比值；
2)建立乙醇的氢同位素比值δ2h乙醇与作为工作标准的糖化合物中不可交换氢的稳定氢同位素比值δ2h糖不可交换氢的关系模型，得δ2h糖不可交换氢＝a*δ2h乙醇 b；
3)配制待测糖的水溶液，发酵，使得糖分转变成乙醇，测定待测糖发酵液中乙醇的氢同位素比值；
4)将待测糖发酵液中乙醇的氢同位素比值代入上述关系模型中，计算，得待测糖中不可交换氢的稳定氢同位素比值。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
步骤1)中，作为工作标准的糖类化合物至少为3个，且不可交换氢的稳定氢同位素比值互不相同。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
配制步骤1)中糖化合物的水溶液、配制步骤3)中待测糖的水溶液时，所使用的水来源相同，且水中氢同位素比值相同。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
步骤1)中糖化合物的水溶液中糖浓度、步骤3)中待测糖的水溶液中糖浓度相同；所述糖浓度为170g/l～280g/l。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
步骤1)、步骤3)中，发酵的条件相同；具体包括：向糖化合物的水溶液或待测糖的水溶液中加入活性干酵母，30±0.5℃厌氧发酵直至发酵结束。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
步骤3)中，去除待测糖中水分采用冷冻干燥方式。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
步骤2)、步骤4)中，乙醇的氢同位素比值用气相色谱-裂解-稳定同位素比值质谱仪测定。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
所述糖包括葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖。
技术总结本发明提出一种分析糖中不可交换氢的稳定氢同位素比值的方法，属于稳定同位素技术研究领域。该方法包括如下步骤：1)选择不可交换氢的稳定氢同位素比值已知的糖化合物作为工作标准，发酵，转化成乙醇，测定发酵液中乙醇的氢同位素比值；2)建立δ2H糖不可交换氢＝a*δ2H乙醇 b；3)配制待测糖的水溶液，发酵，使得糖分转变成乙醇，测定待测糖发酵液中乙醇的氢同位素比值；4)将待测糖发酵液中乙醇的氢同位素比值代入上述关系模型中，计算，得待测糖中不可交换氢的稳定氢同位素比值。本发明主要用于分析糖中不可交换氢的稳定氢同位素比值，操作简单，实验成本低，分析快速效率高，安全无风险，适合大批量样品的分析测试。
技术研发人员：钟其顶;王道兵
受保护的技术使用者：中国食品发酵工业研究院有限公司
技术研发日：2020.02.06
技术公布日：2020.06.09
