本发明涉及一种食用油中丙烯酰胺的测定方法，属于食品检测
技术领域：
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背景技术：
：丙烯酰胺为一种含氮极性有机小分子，是有机合成材料的单体，是生产医药、染料、涂料的中间体。1994年被国际癌症研究机构(iarc)列为2a类致癌物，对动物具有神经毒性、生殖毒性、致突变性和致癌性等多种毒副作用。早期人们对丙烯酰胺的关注主要集中在职业暴露方面，2002年瑞典科学家首次报道在烘烤、油炸等食品中发现丙烯酰胺，其中油炸薯条中丙烯酰胺含量高达3.9mg/kg。自此丙烯酰胺在食品中的污染问题引起了人们的高度关注，美国、欧盟、加拿大及我国等多个国家开展了不同类型食品中丙烯酰胺水平的监测和研究，并及时将数据公开以期能获得不同食品中丙烯酰胺的污染情况。2005年世界卫生组织(who)等机构警告公众关注食品中的丙烯酰胺，呼吁采取措施减少食品中的内烯酰胺含量，确保食品的安全性。世界卫生组织规定饮用水中丙烯酰胺含量不能超过0.5μg/l，目前各国对食品中的丙烯酰胺均没有限量值规定。油炸或焙烤等经高温加工的食品中存在不同含量的丙烯酰胺，研究表明丙烯酰胺的形成与加工烹调方式、温度、时间、水分等有关，因此不同食品加工方式和条件不同，其形成丙烯酰胺的量有很大不同。在实际食品加工、餐饮行业及家庭烹饪中存在食用油反复煎炸使用，煎炸温度过高等问题，使得油炸食品成为丙烯酰胺高风险食品，带来了较大的安全隐患。食品中丙烯酰胺的产生机理较复杂，目前较接受的形成途径有天冬氨酸途径和丙烯醛、丙烯酸途径。前一种为游离天门冬氨酸(土豆和谷类中的代表性氨基酸)与还原糖，二者发生maillard系列反应生成丙烯酰胺。此外，食物中油脂类物质也会反应生成丙烯酰胺，主要原理是甘油三酯等通过水解、氧化等反应生成小分子物质丙烯醛，丙烯醛经由直接氧化反应生成丙烯酸，烯酸再与氨水作用进一步生成丙烯酰胺。丙烯酰胺产生机理仍存在较大争议，需要通过分析不同情况下丙烯酰胺的产生情况研究其产生途径，从而有目的的消除或降低丙烯酰胺的摄入量。g.daniali等人通过模型研究的方式研究了植物油和动物油脂在加热处理后丙烯酰胺的产生情况，也报道了不同氨基酸、不同煎炸次数及不同加热温度对棕榈油和大豆油中丙烯酰胺产生量的区别，以此来验证丙烯酰胺的产生途径，其研究表明，添加了天冬氨酸的不同食用油经高温加热后会产生不同含量的丙烯酰胺，且其产生量同过氧化值、碘值、茴香胺值呈正相关。食用油模型研究有一定的局限性，研究真实煎炸不同食品时不同食用油中丙烯酰胺的产生情况有一定的必要性。目前对丙烯酰胺的检测方法有气相色谱法、气相色谱-质谱法(gc-ms)、高效液相色谱法和液相色谱-串联质谱法(hplc-ms/ms)、毛细管电泳法和传感器法等。其中气相色谱法和气相色谱-质谱法需要衍生，前处理较复杂，使用溴化试剂，条件苛刻等缺点。液相色谱法灵敏度较差，干扰严重，而液相色谱-串联质谱法因其高灵敏度、高选择性、定量定性准确及不需要衍生等特点，成为食品中丙烯酰胺检测的主要方法。目前食品中丙烯酰胺检测常用的前处理方法有固相萃取柱法，基质分散固相萃取，液液萃取及分子印迹等方法，这些方法对于食用油这种基质复杂样品存在净化效果差，操作繁琐、样品回收率低等缺点。我国现行食品中丙烯酰胺的检测标准主要有gb5009.204-2014(hplc-ms/ms法和gc-ms法)和sn/t2096-2008(gc-ms)，其中gb5009.204-2014的hplc-ms/ms法中采用丙烯酰胺经典前处理方法，即水提取后双固相萃取柱净化方法，存在操作复杂，回收率低等缺点，而gc-ms法还需要衍生等步骤，操作步骤相对比较繁琐，前处理时间长。食用油的主要成分是不饱和脂肪酸的甘油酯，相对分子质量一般在800以上，而丙烯酰胺一般为小分子，采用凝胶渗透色谱(gpc)将丙烯酰胺与油脂基体分离。目前gpc已用于一些含油样品的油脂分离，但用于食用植物油中丙烯酰胺的检测至今未有报道。凝胶渗透色谱(gpc)是一种用溶剂作流动相，多孔填料或多孔交联高分子凝胶作分离介质的液相色谱法，该方法利用化合物中各组分的分子量大小不同，与柱填料之间的作用不同，导致洗脱时间不同而达到分离的目的。凝胶渗透色谱作为一种样品净化手段，在国内外已得到较为普遍的应用，尤其是在富含脂肪、色素等大分子的样品分离净化方面，gpc具有明显优势，目前此系统是从高分子量基体中分离出低分子量化合物的最有效手段。本研究首次系统的建立了食用油中丙烯酰胺的凝胶色谱-液相色谱-串联质谱(gpc-uplc-ms/ms)检测方法，本方法通过凝胶渗透色谱(gpc)净化植物油样品提取液，除去样品中的油脂及干扰物，再采用液相色谱-串联质谱法进行测定，取得满意效果。方法的系统研究对于食品加工行业及餐饮行业中食用油反复煎炸使用进行更好的监测和指导，对行业发展及政府监管提供技术支持。技术实现要素：本研究利用凝胶色谱净化，结合稳定性同位素稀释-超高效液相色谱-串联质谱技术，发展了一种简便、高效、准确检测食用油中丙烯酰胺的定性定量方法。为了解决上述问题，本发明提供一种食用油中丙烯酰胺的检测方法。本发明是通过以下技术方案实现的：一种食用油中丙烯酰胺的测定方法，包括以下步骤：(1)前处理：称取2.0g样品(精确至0.0001g)，加入置于10ml玻璃刻度管中，用乙酸乙酯－环己烷(1:1,v:v)混合溶液定容至刻度，涡旋1min，过0.45μm有机滤膜后上gpc净化。将收集的流分于45℃下氮气流下浓缩至10ml，加10ml水充分涡旋混合进行液液萃取，冷冻1h后，离心取水相过0.22μm有机滤膜，待上机。(2)标准溶液的配置：分别准确称取丙烯酰胺及丙烯酰胺同位素内标标准物质10mg于10ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配制成1mg/ml标准储备液，于-20℃下避光保存；使用前根据需要用水稀释至适当浓度的标准工作液，4℃下避光保存。(3)获得液相色谱图、回归方程将标准系列工作液分别注入超高效液相色谱-串联质谱联用仪，获得相应的丙烯酰胺及其内标标准质量色谱图；以丙烯酰胺定量离子对和13c3丙烯酰胺内标定量离子对的标准质量色谱图的色谱峰面积比为纵坐标，以标准工作溶液中丙烯酰胺的相应浓度值为横坐标作图，得线性回归方程；(4)定性分析试样用超高效液相色谱-串联质谱联用仪进行检测，获得试样质量色谱图；若试样质量色谱图中存在与标准质量色谱图中的色谱峰相应的色谱峰；则表明试样中含有丙烯酰胺；(5)定量计算采用同位素内标法定量：根据试样中丙烯酰胺定量离子对和13c3丙烯酰胺内标定量离子对色谱峰的面积，采用步骤(3)的回归方程，计算得到丙烯酰胺的浓度；优选地，所述凝胶渗透色谱净化柱:labtech高效不锈钢净化柱,id20×300mm,填料:bio-beadss-x3200-400目，22g；所述凝胶渗透色谱流动相:乙酸乙酯－环己烷(1:1,v:v)。优选地，凝胶渗透色谱净化程序为:0～22min弃去流分，收集22～30min流分，30～35min冲洗gpc柱。进样量5ml；泵流速5.0ml/min。优选地，所述超高效液相色谱仪的色谱柱：atlantist3，柱长150mm，柱内径2.1mm，填料粒径5μm；所述超高效液相色谱的流动相：a：甲醇，b：0.1％甲酸水溶液。优选地，所述超高效液相色谱的洗脱条件为：柱温：25℃，进样体积：5μl；梯度条件见表a：表a液相色谱梯度条件时间/min流速/ml/mina/％b/％梯度变化曲线00.229863.00.229865.00.2208065.10.295569.00.2955610.00.2298614.00.22986“梯度变化曲线为6”是指梯度变化曲线为直线；优选地，质谱条件为：离子源:电喷雾离子源(h-esi)；离子化模式:正离子模式(esi )；喷雾电压:3500v；离子传输管温度:350℃；喷雾器温度:300℃；鞘气流速:45arb；辅助气流速:10arb；吹扫气流速:1arb；扫描方式：多反应监测(mrm)。优选地，丙烯酰胺及同位素定性离子定量离子对及质谱参数见表b。表b丙烯酰胺质谱参数*为定量离子。本发明建立了同时测定食用油中丙烯酰胺的分析方法。试样采用乙酸乙酯－环己烷(1:1,v:v)混合溶液充分溶解后，经gpc净化后，采用atlantist3(150mm×2.1mmi.d.,5μm)分离，以甲醇-0.1％甲酸水溶液为流动相，优化梯度洗脱将极性较强的丙烯酰胺得到较好保留，经稳定性同位素稀释-超高效液相色谱-串联质谱检测，纯标内标法定量。结果表明：丙烯酰胺在1-500ng/ml浓度范围内线性关系良好，相关系数大于0.999。在高中低三个添加水平下，实际样品的回收率在92.6％～108.8％之间，相对标准偏差(rsdn＝6)在0.25％～7.53％之间，采用在空白食用油中添加目标化合物的方法，测得丙烯酰胺的检出限(s/n>3)为2μg/kg，定量下限(s/n>10)为5μg/kg。本发明前处理操作简单高效，自动化程度高，凝胶色谱在线净化，克服丙烯酰胺在前处理中易损失问题，方法回收率好，灵敏度高，定性定量准确。本发明首次系统建立了食用油中丙烯酰胺的凝胶色谱-液相色谱-串联质谱检测方法，方法对于深入研究煎炸油中丙烯酰胺产生情况建立了前提，对行业发展及政府监管提供技术支持。有益效果(1)定性定量准确本发明采用稳定性同位素稀释-凝胶色谱-超高效液相色谱-串联质谱法检测食用油中丙烯酰胺，方法采用凝胶色谱对高油脂样品进行除脂，净化效果好，基质效应小。且方法克服丙烯酰胺在前处理中易损失问题，方法回收率高，相比gb5009.204-2014标准中定量下限为10μg/kg，本方法检出限为2μg/kg，定量下限为5μg/kg，检出限不高于现有文献报道水平，甚至低于部分文献检出限水平。(2)提高检测效率现行gb5009.204-2014标准和目前国内外文献中液相色谱-串联质谱法对食品中丙烯酰胺的检测主要采用双固相萃取柱净化方法，检验周期约为150min，其中样品提取和净化需要120min，特别是其方法氮吹步骤非常困难，检测至少需要15min；而气相色谱-质谱法检验周期约为320min，其中样品提取、净化及衍生共计需要300min，且操作复杂，衍生条件要求严格，检测至少需要20min；本发明净化为全自动凝胶色谱净化系统，提取净化步骤时间约75min，仪器测定15min，整个检验周期需要90min。由此可见，本发明能极大的提高检验效率。若进行批量化检测，检验效率高的优势将更加明显。(3)自动化程度高现行gb5009.204-2014标准液相色谱-串联质谱法采用双固相萃取柱净化方法，过程繁琐，操作复杂，而气相色谱-质谱法在复杂的净化过程后，还要进行条件严格的衍生化反应，本发明净化为全自动凝胶色谱净化系统，自动化程度高，节约人力成本，若进行批量化检测，优势将更加明显。附图说明图1丙烯酰胺标准溶液的mrm色谱图(50ng/ml)；图2食用油中丙烯酰胺的空白基质溶液mrm色谱图；图3食用油中丙烯酰胺的基质加标溶液mrm色谱图(100ug/kg)。具体实施方式下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。实施例11仪器与材料tsqquantiva液相色谱-三重四极杆串联质谱仪，配有电喷雾离子源，美国thermofisher公司；autoclean凝胶渗透色谱仪，美国labtech公司；sigma3-18k高速冷冻离心机，德国sigma公司；超声波清洗器，宁波新芝生物科技有限公司；ms3涡旋混合器，ika公司，n-evap-45位氮吹仪，美国organomation公司；sqp-电子天平，塞多利斯科学仪器有限公司；超纯水，mili-q超纯水机。丙烯酰胺标准物质(纯度≥99％)，德国dr公司，13c3-丙烯酰胺同位素内标(纯度≥99％)，德国witega公司；甲醇、乙腈、环己烷、乙酸乙酯(色谱纯)，美国bruker公司；甲酸、醋酸铵(色谱纯)，美国sigma-aldrich公司；水为milli-q超纯水机制备；氮气(>99.999％)；凝胶渗透色谱净化柱:labtech高效不锈钢净化柱,id20×300mm,填料:bio-beadss-x3200-400目，22g)，美国labtech公司；；色谱柱：atlantist3(150mm×2.1mmi.d.,5μm)，美国waters公司；有机微孔滤膜(0.22μm)上海安谱科学仪器有限公司。2前处理2.1标准储备液分别准确称取丙烯酰胺及丙烯酰胺同位素内标标准物质10mg于10ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配制成1mg/ml标准储备液，于-20℃下避光保存；2.2标准工作溶液使用前根据需要用水稀释至适当浓度的标准工作液，4℃下避光保存。2.3试样称取2.0g样品(精确至0.0001g)，加入置于10ml玻璃刻度管中，用乙酸乙酯－环己烷(1:1)混合溶液定容至刻度，涡旋1min，过0.45μm有机滤膜后上gpc净化。将收集的流分于45℃下氮气流下浓缩至10ml，加10ml水充分涡旋混合进行液液萃取，冷冻1h后，离心取水相过0.22μm有机滤膜，上机测定。3仪器条件3.1色谱条件3.1.1凝胶渗透色谱仪器条件凝胶渗透色谱净化柱:labtech高效不锈钢净化柱，id20×300mm,填料:bio-beadss-x3200-400目，22g)；流动相:乙酸乙酯－环己烷(1:1v:v)；进样量5ml；泵流速5.0ml/min；净化程序:0～22min弃去流分，收集22～30min流分，30～35min冲洗gpc柱。3.1.2高效液相色谱仪器条件色谱柱：atlantist3(150mm×2.1mmi.d.,5μm)；流动相：甲醇(a)和0.1％甲酸溶液(b)，流速：0.2ml/min；柱温：25℃；进样体积：5μl。梯度条件见表1：表1液相色谱梯度条件“梯度变化曲线为6”是指梯度变化曲线为直线；3.2质谱条件离子源:电喷雾离子源(h-esi)；离子化模式:正离子模式(esi )；喷雾电压:3500v；离子传输管温度:350℃；喷雾器温度:300℃；鞘气流速:45ml/min；鞘气流速:45arb；辅助气流速:10arb；吹扫气流速:1arb；扫描方式：多反应监测(mrm)。丙烯酰胺及同位素内标定性离子定量离子对及质谱参数见表2。表2丙烯酰胺质谱参数*为定量离子。4定量结果及评价4.1标准质量色谱图、回归方程用超高效液相色谱-串联质谱仪，按照步骤3的条件，测定标准工作溶液，获得不同浓度的丙烯酰胺定量离子对和13c3丙烯酰胺内标定量离子对质量色谱图(标准质量色谱图)。其中一个浓度水平的标准工作溶液的质量色谱图如图1所示。以丙烯酰胺定量离子对和13c3-丙烯酰胺内标定量离子对的标准质量色谱图的色谱峰面积比为纵坐标，以标准工作溶液中丙烯酰胺的相应浓度值为横坐标作图，得线性回归方程y＝0.00201x 0.02504；在1-500ng/ml范围内，丙烯酰胺的浓度与峰面积呈良好的线性关系，相关系数r2为0.999；待测试样中丙烯酰胺应值应在标准曲线线性范围内，超过线性范围则应稀释后再进行分析。4.2方法回收率、精密度和检出限采用不含丙烯酰胺的食用油，分别加入低中高三个浓度水平的丙烯酰胺标准溶液和相应内标溶液，按照步骤2，3进行检测，获得质量色谱图，其中空白食用油及其加标样品质量色谱图如图2、3所示。丙烯酰胺的回收率(回收率：实测值/加入量×100％)，结果如表3所示。由表3可见回收率在92.6％～108.8％范围内，方法回收率高，重现性好。对不同试样重复测定6次，测定结果均具有良好的重现性，丙烯酰胺的相对标准偏差(rsd)为0.25％～7.53％。采用在空白食用油中添加目标化合物的方法，测得丙烯酰胺的检出限(s/n>3)为2μg/kg，定量下限(s/n>10)为5μg/kg。表3食用油中丙烯酰胺添加回收率及精密度(n＝6)6、样品检测(1)定性分析用超高效液相色谱-串联质谱仪，按照步骤2,3的条件，测定试样，获得试样质量色谱图。若试样质量色谱图中存在与标准质量色谱图中的色谱峰相应的色谱峰；则表明试样中含有丙烯酰胺。相应的色谱峰是指：试样色谱峰的保留时间与标准色谱峰的保留时间比较，变化范围在±2.5％之内；而且试样色谱峰的相对丰度比与相应标准色谱峰相比，偏差不超过表4规定的范围。标准色谱峰是指标准质量色谱图中的目标物的色谱峰。表4定性时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度＞50％20％至50％10％至20％≤10％允许相对偏差±20％±25％±30％±50％(2)定量计算采用同位素内标法定量：根据试样中丙烯酰胺定量离子对和13c3丙烯酰胺内标定量离子对色谱峰的面积，采用步骤4的回归方程，计算得到丙烯酰胺的浓度。对比例1将实施例1中的前处理过程中gpc净化替换为c18固相萃取柱净化时，基质效应严重，净化效果差，影响痕量丙烯酰胺的检测，同时污染仪器、堵塞色谱柱，此方法技术效果差。对比例2将实施例1中的前处理过程中将乙酸乙酯－环己烷浓缩后加水液液萃取替换为将乙酸乙酯－环己烷氮吹干后，加水复溶时，检测到丙烯酰胺在氮吹近干后损失严重，不能有效的对目标物进行准确定量，严重影响了食用油中丙烯酰胺的检测，此方法技术效果差。对比例3将实施例1中的仪器检测过程中，将色谱柱替换为同规格的behc18和beht3色谱柱时，在色谱柱死体积和死时间相同的前提下，丙烯酰胺在色谱柱上保留因子从本技术的2.71下降为-0.009和1.29，该规格色谱柱死时间约为1.1.min，丙烯酰胺色谱保留行为变差，在死时间附近出峰，影响目标物的定性定量，严重影响了食用油中丙烯酰胺的检测，此方法技术效果差。显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。当前第1页1 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技术特征：1.一种食用油中丙烯酰胺的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)前处理：称取2.0g样品，加入置于10ml玻璃刻度管中，用乙酸乙酯－环己烷(1:1,v:v)混合溶液定容至刻度，涡旋1min，过0.45μm有机滤膜后上gpc净化；将收集的流分于45℃下氮气流下浓缩至10ml，加10ml水充分涡旋混合进行液液萃取，冷冻1h后，离心取水相过0.22μm有机滤膜，待上机；
(2)标准溶液的配置：分别准确称取丙烯酰胺及丙烯酰胺同位素内标标准物质10mg于10ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配制成1mg/ml标准储备液，于-20℃下避光保存；使用前根据需要用水稀释至适当浓度的标准工作液，4℃下避光保存；
(3)获得液相色谱图、回归方程
将标准系列工作液分别注入超高效液相色谱-串联质谱联用仪，获得相应的丙烯酰胺及其内标标准质量色谱图；
以丙烯酰胺定量离子对和13c3丙烯酰胺内标定量离子对的标准质量色谱图的色谱峰面积比为纵坐标，以标准工作溶液中丙烯酰胺的相应浓度值为横坐标作图，得线性回归方程；
(4)定性分析
试样用超高效液相色谱-串联质谱联用仪进行检测，获得试样质量色谱图；若试样质量色谱图中存在与标准质量色谱图中的色谱峰相应的色谱峰；则表明试样中含有丙烯酰胺；
(5)定量计算
采用同位素内标法定量：根据试样中丙烯酰胺定量离子对和13c3丙烯酰胺内标定量离子对色谱峰的面积，采用步骤(3)的回归方程，计算得到丙烯酰胺的浓度。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述凝胶渗透色谱净化柱:labtech高效不锈钢净化柱,id20×300mm,填料:bio-beadss-x3200-400目，22g；所述凝胶渗透色谱流动相:乙酸乙酯－环己烷(1:1,v:v)，凝胶渗透色谱净化程序为:0～22min弃去流分，收集22～30min流分，30～35min冲洗gpc柱；进样量5ml；泵流速5.0ml/min。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述atlantist3，柱长150mm，柱内径2.1mm，填料粒径5μm；所述超高效液相色谱的流动相：a：甲醇，b：0.1％甲酸水溶液；洗脱条件为：柱温：25℃，进样体积：5μl；梯度条件见表a：
表a液相色谱梯度条件
“梯度变化曲线为6”是指梯度变化曲线为直线。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的质谱条件为：离子源:电喷雾离子源(h-esi)；离子化模式:正离子模式(esi )；喷雾电压:3500v；离子传输管温度:350℃；喷雾器温度:300℃；鞘气流速:45arb；辅助气流速:10arb；吹扫气流速:1arb；扫描方式：多反应监测(mrm)；丙烯酰胺及同位素定性离子定量离子对及质谱参数见表b；
表b丙烯酰胺质谱参数
*为定量离子。
技术总结本发明公开了一种食用油中丙烯酰胺的测定方法，包括以下步骤：(1)前处理；(2)标准溶液的配制；(3)获得液相色谱图、回归方程；(4)定性分析；(5)定量计算，采用稳定同位素内标法定量：根据试样中丙烯酰胺定量离子对和13C3丙烯酰胺内标定量离子对色谱峰的面积，采用步骤(3)的回归方程，计算得到丙烯酰胺的浓度；本发明前处理操作简单高效，自动化程度高，凝胶色谱在线净化，克服丙烯酰胺在前处理中易损失问题，方法回收率好，灵敏度高，定性定量准确。
技术研发人员：张艳侠;刘艳明;徐向军;孙珊珊;赵慧男;祝建华;李晓;宿书芳;薛霞;郑文静
受保护的技术使用者：山东省食品药品检验研究院
技术研发日：2020.02.13
技术公布日：2020.06.09
