本发明涉及中药指纹图谱技术领域，具体涉及一种川芎地上部位的指纹图谱检测方法。
背景技术：
川芎为伞形科植物川芎lingusticumchuanxionghort.的干燥根茎，具有活血行气，祛瘀止痛的功效。其主要含有挥发油、生物碱、酚酸类、内酯类、萜烯类、苯酞衍生物、多糖类及无机元素等。目前对川芎的研究和应用都集中在地下根茎，对川芎地上部位的研究和利用非常少。川芎地上部位资源丰富，占全株鲜重的75％，但多废弃，造成资源的极大浪费。川芎地上部位可以疏风、平肝，祛脑中风寒。主治风眩、惊风、风眼流泪、头风头痛，多涕唾。《神农本草经》记载“主咳逆，定惊气，辟邪恶，除蛊毒、鬼痊，去三虫，久服通神。”《名医别录》记载其“主身中老风，头中久风风眩。”现代研究表明川芎地上部位水煎液明显延长小鼠出血凝血时间，延长氨水致小鼠咳嗽潜伏期，减少氨水致小鼠咳嗽次数，具有一定的活血和镇咳作用。
目前已有对川芎地上部位单一或几种化学成分的研究报道，并作为评价川芎地上部位质量的方法，但单个成分含量水平难以达到川芎地上部位质量控制评价的目的。指纹图谱作为中药材单味药和复方全成分及其提取物的质量控制方法，能够较为全面地反映中药全化学谱，已经成为国际公认的控制评价中药和天然药物质量的有效手段。川芎地上部位中各类化学成分性质、极性等差异极大，现有单一成分检测很难反映其全貌，难以对川芎地上部位进行整体质量控制。而目前还没有关于川芎地上部位指纹图谱的研究报道。
技术实现要素：
为解决上述问题，本发明提供了一种川芎地上部位的指纹图谱检测方法，它是采用高效液相色谱法检测，包括如下步骤：
1)供试品溶液制备：取川芎地上部位粉碎，加甲醇提取，过滤，取续滤液即得；
2)分别吸取供试品溶液注入高效液相色谱仪，记录色谱图；色谱条件如下：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：以0.05～0.2％磷酸溶液为流动相a；以乙腈为流动相b；梯度洗脱程序如下：
进一步地，步骤1)所述提取为超声提取，超声提取时间30min。
进一步地，步骤1)所述川芎地上部位与甲醇质量体积比为1～10g：10ml，优选2g：10ml。
进一步地，步骤2)所述色谱条件中色谱柱为kromasilc18，规格4.6×250mm，5μm；流动相a磷酸溶液浓度为0.1％。
进一步地，步骤2)所述色谱条件中流速1.0ml/min，进样量20μl，柱温35℃，检测波长254nm。
进一步地，所述检测方法还包括如下步骤：分别取藁本内酯和丁烯基苯酞对照品，加甲醇溶解，得对照品溶液，吸取对照品溶液注入高效液相色谱仪，按照步骤2)色谱条件检测。
更进一步地，所述对照品溶液每1ml含藁本内酯0.1～0.5mg/ml，丁烯基苯酞0.01～0.08mg/ml。
进一步地，所述川芎地上部位指纹图谱应有20个共有特征峰，与藁本内酯参照物相应的峰为峰16，与丁烯基苯酞参照物相应的峰为峰17，计算各特征峰与峰17的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±5％范围之内；规定值为：峰1：0.2446，峰2：0.2631，峰3：0.4306，峰4：0.5600，峰5：0.6588，峰6：0.6962，峰7：0.7567，峰8：0.7703，峰9：0.8191，峰10：0.8226，峰11：0.8447，峰12：0.8877，峰13：0.9269，峰14：0.9657，峰15：0.9814，峰16：0.9921，峰17：1.0000，峰18：1.1425，峰19：1.1856，峰20：1.3283。
本发明川芎地上部位(茎叶)的指纹图谱检测方法，填补了川芎地上部位质量检测的空白，为川芎地上部位建立了规范的质控体系。本发明川芎地上部位的指纹图谱，标定了20个共有峰，指认出了藁本内酯与丁烯基苯酞两个成分。与对照图谱相比，不同批次的川芎地上部位药材的指纹图谱相似度在0.942～0.990，相似度良好，表明不同产地川芎地上部位的化学成分具有很好的一致性，能用于川芎地上部位的质量控制。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1川芎地上部位hplc对照图谱
图2川芎地上部位hplc指纹图谱
图3川芎地上部位样品聚类分析图
具体实施方式
本发明具体实施方式中使用的试剂、试药、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。
实施例1本发明川芎地上部位的指纹图谱检测
1)供试品溶液的制备：取川芎地上部位样品粉末(过六号筛)2.0g，精密称定，置50ml具塞锥形瓶中，精密加入甲醇10ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，补足失重，摇匀，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液，即得；
2)对照品溶液的制备
取藁本内酯对照品10mg，精密称定，于10ml容量瓶中，加甲醇溶解至刻度，摇匀，即得浓度为1.0780mg/ml的藁本内酯对照品储备液。精密量取储备液1.0ml，于5ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得到浓度为0.2156mg/ml的藁本内酯对照品；
取丁烯基苯酞对照品约10mg，精密称定，于25ml容量瓶中，加甲醇溶解至刻度，摇匀，即得浓度为0.4300mg/ml的丁烯基苯酞对照品储备液。精密量取储备液1.0ml，于10ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得到浓度为0.0430mg/ml的丁烯基苯酞对照品；
3)分别吸取供试品溶液和对照品溶液注入高效液相色谱仪，记录色谱图；色谱条件如下：
色谱柱：kromasilc18(250×4.6mm,5μm)；检测波长：254nm；进样体积为20ul，流速为1.0ml/min，柱温为35℃；流动相：以0.1％磷酸水溶液为流动相a，以乙腈为流动相b；梯度洗脱程序如下：
4)川芎地上部位指纹图谱有20个共有特征峰，与藁本内酯参照物相应的峰为峰16，与丁烯基苯酞参照物相应的峰为峰17，计算各特征峰与峰17的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±5％范围之内；规定值为：峰1：0.2446，峰2：0.2631，峰3：0.4306，峰4：0.5600，峰5：0.6588，峰6：0.6962，峰7：0.7567，峰8：0.7703，峰9：0.8191，峰10：0.8226，峰11：0.8447，峰12：0.8877，峰13：0.9269，峰14：0.9657，峰15：0.9814，峰16：0.9921，峰17：1.0000，峰18：1.1425，峰19：1.1856，峰20：1.3283。
以下通过实验例来说明本发明的有益效果：
实验例1
1仪器与试药
1.1仪器
hplc-dad3000型高效液相色谱仪(赛默飞世尔科技有限公司)；色谱柱kromasilc18(250×4.6mm，5μm)；fa2004n型电子天平(上海民桥精密科学仪器有限公司)；ups-11-20l型超纯水机(四川优普超纯科技有限公司),kq5200e型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。
1.2试剂与药材
丁烯基苯酞(bp0061，成都普瑞法科技开发有限公司)；藁本内酯(ddyj0412-08，成都叮当时代医药科技有限公司)；乙腈(色谱纯，sigma-alorich)；磷酸(ar，成都市科隆化学品有限公司)；甲醇(色谱纯，sigma-alorich)；甲醇(ar，成都市科隆化学品有限公司)；超纯水。11批来自四川不同产地的川芎地上部位，样品信息及编号见表1。
表1样品信息
2方法与结果
2.1指纹图谱的建立
2.1.1色谱条件
色谱柱kromasilc18(250×4.6mm,5μm)，0.1％磷酸水溶液(a)-乙腈(b)为流动相，梯度洗脱(0～1min，10％b；1～9min，10％→16％b；9～10min，16％→20％b；10～21min，20％b；21～27min，20％→60％b；27～39min，60％b；39～40min，60％→90％b；40～50min，90％b；50～51min，90％→100％b；51～60min，100％b；60min后,100％b洗脱30min基本无峰，故未加入色谱条件)，流速为1.0ml/min，进样量20μl，柱温35℃，254nm检测。
2.1.2对照品溶液的制备
取藁本内酯对照品约10mg，精密称定，于10ml容量瓶中，加甲醇溶解至刻度，摇匀，即得浓度为1.0780mg/ml的藁本内酯对照品储备液。精密量取储备液1.0ml，于5ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得到浓度为0.2156mg/ml的藁本内酯对照品。
取丁烯基苯酞对照品约10mg，精密称定，于25ml容量瓶中，加甲醇溶解至刻度，摇匀，即得浓度为0.4300mg/ml的丁烯基苯酞对照品储备液。精密量取储备液1.0ml，于10ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得到浓度为0.0430mg/ml的丁烯基苯酞对照品。
2.1.3供试品溶液的制备
取川芎地上部位样品粉末(过六号筛)约2.0g，精密称定，置50ml具塞锥形瓶中，精密加入甲醇10ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，补足失重，摇匀，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液，即得。
2.1.4精密度考察
取s8样品按“2.1.3项”下方法制备供试品，按“2.1.1项”下色谱条件连续进样6次，记录各色谱峰的保留时间和峰面积。结果显示，20个共有峰相对保留时间的rsd值在0.01％～0.07％之间，相对峰面积的rsd值在0.42％～2.69％之间，表明仪器精密度良好。
2.1.5重复性考察
取s8样品6份按“2.1.3项”下方法制备供试品，分别按“2.1.1项”下色谱条件进样，记录各色谱峰的保留时间和峰面积。结果显示，20个共有峰相对保留时间的rsd值在0.00％～0.12％之间，相对峰面积的rsd值在0.44％～4.65％之间，表明该方法重复性良好。
2.1.6稳定性考察
取s8样品按“2.1.3项”下方法制备供试品，分别于制备后0、3、6、9、12、24h时，按“2.1.1项”下色谱条件进样，记录各色谱峰的保留时间和峰面积。结果显示，20个共有峰相对保留时间的rsd值在0.00％-0.13％之间，相对峰面积的rsd值在0.47％～4.58％之间，表明该样品在24h内稳定性良好。
2.1.7共有峰的确定
取11批川芎地上部位样品，分别按“2.1.3项”下方法制备供试品，按“2.1.1项”下色谱条件进样，记录色谱图。将各地上部位样品5min后色谱图导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)”软件，以s1样品色谱图为参照图谱，采用“中位数”法，“时间宽度”设为0.1，经色谱峰多点校正，标定了20个共有峰，对11批川芎地上部分样品指纹图谱色谱峰进行自动匹配生成对照图谱，作为川芎地上部位的指纹图谱，见图1，指纹图谱叠加图见图2。通过与对照品的保留时间和紫外光谱比对确认了2个共有峰，即16号与17号峰，如图3所示，分别为藁本内酯和丁烯基苯酞。根据指纹图谱参照峰选定的技术原则，为便于指纹图谱的辨认，选取主要活性成分17号-丁烯基苯酞峰为参照峰。把参照峰的保留时间和峰面积定为基准1，分别计算11批川芎地上部位样品共有峰的相对保留时间和相对峰面积，并使用归一化法计算单个共有峰的峰面积百分比，见表2和表3。
结果显示，不同批次川芎地上部位样品共有峰相对保留时间的rsd值在0.00％～0.33％之间，而相对峰面积的rsd在8.13％～88.12％之间；共有峰中1号峰和4号峰所占百分比较大，在10％～15％之间，3号峰和16、17号峰所占百分比在5％～10％之间，其余峰所占百分比均小于2％。
2.1.8相似度评价
采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)”软件对11批川芎地上部分样品指纹图谱进行相似度计算，结果见表4。与对照图谱相比，11批川芎地上部分样品的相似度在0.942-0.990之间，相似度良好，表明不同产地的川芎地上样品的化学成分具有很好的一致性。分析11批样品之间的相似性发现：除s4样品外，其余10批样品彼此间的相似度均大于0.9；s4与s2、s3、s5和s8的相似度在0.843-0.866之间，相似度较低，但与其余几批样品的相似度均超过了0.9，可能与产地有关，还需要进一步分析。
表411批次川芎地上部位指纹图谱相似度
2.1.9聚类分析
采用spss22.0软件，以20个共有峰的峰面积为变量，采用组间联接法、欧式平方距离对11批川芎地上部位样品进行了聚类分析，结果如图3所示。11批川芎地上部位样品可以分为两类：第i类为s4；其它样品为第ii类。样品s4与其他10批样品的相似度较低，与指纹图谱得出的结论基本一致。
3、结论
本发明以11批不同产地的川芎地上部位样品为基础，首次建立了川芎地上部位的指纹图谱色谱方法。将各样品色谱图导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)”软件建立了川芎地上部位的指纹图谱，标定了20个共有峰，指认出了藁本内酯与丁烯基苯酞两个成分。与对照图谱相比，不同批次的川芎地上部位药材的指纹图谱相似度在0.942～0.990，相似度良好，表明不同产地川芎地上部位的化学成分具有很好的一致性。但部分共有峰相对峰面积的rsd较大，可能与不同产地的土壤条件、耕种方式以及施肥技术有关。
综上，本发明川芎地上部位(茎叶)的指纹图谱检测方法，填补了川芎地上部位系统的质量检测的空白，为川芎地上部位建立了规范的质控体系。本发明川芎地上部位的指纹图谱，标定了20个共有峰，指认出了藁本内酯与丁烯基苯酞两个成分，相似度良好，表明本发明能用于不同产地川芎地上部位的质量控制，具备实际推广应用价值。
1.一种川芎地上部位的指纹图谱检测方法，其特征在于：它是采用高效液相色谱法检测，包括如下步骤：
1)供试品溶液制备：取川芎地上部位粉碎，加甲醇提取，过滤，取续滤液即得；
2)吸取供试品溶液注入高效液相色谱仪，记录色谱图；色谱条件如下：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：以0.05～0.2％磷酸溶液为流动相a；以乙腈为流动相b；梯度洗脱程序如下：
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤1)所述提取为超声提取，超声提取时间30min。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤1)所述川芎地上部位与甲醇质量体积比为1～10g：10ml，优选2g：10ml。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤2)所述色谱条件中色谱柱为kromasilc18，规格4.6×250mm，5μm；流动相a磷酸溶液浓度为0.1％。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤2)所述色谱条件中流速1.0ml/min，进样量20μl，柱温35℃，检测波长254nm。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述检测方法还包括如下步骤：
分别取藁本内酯和丁烯基苯酞对照品，加甲醇溶解，得对照品溶液，吸取对照品溶液注入高效液相色谱仪，按照步骤2)色谱条件检测。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于：所述对照品溶液每1ml含藁本内酯0.1～0.5mg/ml，丁烯基苯酞0.01～0.08mg/ml。
8.根据权利要求1～7任意一项所述的检测方法，其特征在于：所述川芎地上部位指纹图谱应有20个共有特征峰，与藁本内酯参照物相应的峰为峰16，与丁烯基苯酞参照物相应的峰为峰17，计算各特征峰与峰17的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±5％范围之内；规定值为：峰1：0.2446，峰2：0.2631，峰3：0.4306，峰4：0.5600，峰5：0.6588，峰6：0.6962，峰7：0.7567，峰8：0.7703，峰9：0.8191，峰10：0.8226，峰11：0.8447，峰12：0.8877，峰13：0.9269，峰14：0.9657，峰15：0.9814，峰16：0.9921，峰17：1.0000，峰18：1.1425，峰19：1.1856，峰20：1.3283。
技术总结