本发明属于水产品中农药残留量检测技术领域，具体涉及一种内标法并结合高效液相色谱-四级杆串联质谱和高分辨质谱定性定量检测贝类中三嗪类除草剂及其代谢产物的方法。
背景技术：
三嗪类除草剂是一种在农业生产和水产养殖中使用较多的选择性除草剂，用于控制杂草和藻类的生长。因其高效的除草效果，在世界范围内得到广泛和过度使用，且化学性质稳定、难降解，导致其在土壤和水中迅速地累积。通过地表径流和排放进入环境系统，已然成为生态环境污染的主要来源。由于三嗪类除草剂半衰期长、毒性大，对水生生态系统和非靶标生物的安全造成严重威胁，美国和欧盟等已将其列入内分泌干扰物名单。研究表明，长期接触三嗪类除草剂会危害人体健康。三嗪类家族中，阿特拉津(莠去津)及其代谢产物可能会干扰内分泌系统，导致生殖异常，并具有致癌性，已被列为人类致癌物。因此，需要建立高灵敏且具有选择性的分析方法来测定不同样品基质中三嗪类除草剂及其代谢产物残留量。
生物体基质复杂且自然环境暴露下代谢产物的含量较低。因此，贝类体内三嗪类除草剂及其代谢产物的快速筛查及定性定量分析需要更为精确的分析技术和高通量检测方法。固相萃取(spe)，固相微萃取(spme)、液液萃取(lle)和基质固相分散萃取是常用的富集净化技术，在这些前处理方法中，spe由于高回收率、可重复性和操作便捷成为生物样品中有机污染物检测的有效前处理技术。色谱与质谱联用技术具有可靠性强、灵敏度高、基质干扰小等优势。目前，国内外基本通过lc-ms外标法或基质校正外标法对三嗪类除草剂进行定量。外标法回收率难以保证，准确度不高，基质校正外标法不能消除前处理过程的影响，同时需要针对不同基质分别校正，操作复杂。
技术实现要素：
针对现有技术中存在的不足，本发明的目的在于提供一种贝类中三嗪类除草剂及其代谢产物的检测方法，采用乙腈-氢氧化钠提取，无水硫酸钠干燥，并结合中性氧化铝柱净化，完成了贝类中三嗪类除草剂的高效前处理。同时，选用多个内标对贝类中三嗪类除草剂及其代谢产物的含量进行校正。通过高效液相色谱-四级杆串联质谱(hplc-ms/ms)准确定量，结合高分辨质谱(qexactiveorbitrapms)的结构解析和精准识别能力，进行贝类样品中三嗪类除草剂及其代谢产物的快速定量和准确定性分析。
为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种贝类中三嗪类除草剂及其代谢产物的检测方法，是对待检测贝类样品进行高效前处理；再引入内标法并结合高效液相色谱--四级杆串联质谱和高分辨质谱，对贝类样品中三嗪类除草剂及其代谢产物的快速定量和准确定性分析。
在上述方案的基础上，所述样品的高效前处理是将贝类样品匀浆后加入内标；再加入氢氧化钠溶液混匀，使用乙腈超声辅助提取，提取的上清液加入无水硫酸钠涡旋离心，离心后的上清液干燥后复溶，并结合中性氧化铝柱净化，待测。
在上述方案的基础上，所述的三嗪类除草剂为西草净、西玛津、莠灭净、莠去津、扑草净、特丁净、特丁津中的至少一种；所述三嗪类代谢产物为：2-羟基去双异丙基扑草净、去双异丙基扑草净、去异丙基扑草净、2-羟基扑草净、去乙基去异丙基莠去津、去异丙基莠去津中的至少一种。
在上述方案的基础上，所述内标物为d5-莠去津、d6-扑草净、d5-特丁津中的至少一种。
在上述方案的基础上，所述检测过程中，
液相条件：kinetexxbc18色谱柱(4μm，2.1mm×150mm)；进样量:10μl；流速0.25ml/min；流动相：a为0.1％甲酸水溶液，b为乙腈；洗脱梯度：0min＝5％b,3.01min＝95％b，6.31min＝5％b，8.00min＝5％b；
质谱条件：
四级杆串联质谱：电子轰击源，多反应监测扫描模式；正离子扫描，喷雾电压为3500v；
其他相关四级杆串联质谱条件如下：
注：*定量离子。
高分辨质谱：加热电喷雾离子源，正离子模式；喷雾电压:3.0kv；毛细管温度320℃；扫描模式：fullms-ddms2；采集范围m/z80～1000；一级全扫描分辨率为70000fwhm，二级子离子扫描分辨率为17500fwhm。
在上述方案的基础上，所述贝类样品为牡蛎、扇贝、贻贝、菲律宾蛤仔中的任一种。
本发明技术方案的优点
(1)引进内标法定量，通过多个内标校正定量，并结合质谱分析，实现了贝类样品中三嗪类除草剂及其代谢产物的同时定性和定量分析。
(2)本发明方法结合了四级杆串联质谱的准确定量优势和四级杆/静电场轨道阱高分辨质谱(qexactiveorbitrapms)的进一步定性定量分析，可实现阳性样品的准确定性和快速定量。
(3)本发明通过优化提取溶液和固相萃取小柱，确定采用添加naoh的乙腈提取，中性氧化铝柱(1g/6ml)净化用于贝类中三嗪类除草剂及其代谢产物的样品前处理，可快速去除样品中大量脂肪类干扰，方法操作简单，易于重现。
附图说明
图1为标准溶液外标法、基质加标外标法和内标校正方法对目标物的回收率比较；
图2为贝类阳性样品的四级杆串联质谱mrm图；
图3为dip-扑草净高分辨质谱fullms-ddms2谱图，其中a为标准溶液中dip-扑草净fullms-ddms2二级谱图，b为样品中dip-扑草净fullms-ddms2二级谱图；
图4为2-oh-扑草净高分辨质谱fullms-ddms2谱图，其中a为标准溶液中2-oh-扑草净fullms-ddms2二级谱图，b为样品中2-oh-扑草净fullms-ddms2二级谱图。
具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
本发明所述技术方案中的仪器和试材如下：
thermotsqendura液相色谱－串联质谱仪(美国thermofisherscientific公司)。q-exactive四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱系统及dionexultimate3000超高效液相色谱系统(美国thermofisherscientific公司)，talboys型涡旋混合器(上海安谱科学仪器有限公司)，bt224s分析天平(法国sartorius公司)，n-evaptm112型氮气吹扫仪(美国organomation公司)，milli-q型超纯水仪(美国millipore公司)。
三嗪类除草剂：西草净、西玛津、莠灭净、莠去津、扑草净、特丁净以及特丁津。三嗪类代谢产物：2-羟基去双异丙基扑草净(2-ohddip-扑草净)、去双异丙基扑草净(ddip-扑草净)、去异丙基扑草净(dip-扑草净)、2-羟基扑草净(2-oh-扑草净)、去乙基去异丙基莠去津(dedip-莠去津)以及去异丙基莠去津(dip-莠去津)。内标物：d5-莠去津、d6-扑草净、d5-特丁津。以上药品均购于德国dr.ehrenstorfergmbh公司。
甲醇、二氯甲烷(hplc级，merk公司)，其他试剂皆为分析纯。
实施例1
(1)工作液的制备
称取适量的三嗪类除草剂、代谢产物和内标标准品，用甲醇稀释定容，分别配制成1.0mg/ml的标准储备液，-18℃避光保存。然后分别准确吸取一定量标准储备溶液，用甲醇稀释分别配成1μg/ml的混合标准外标工作液和内标工作液，4℃冷藏保存。
(2)高效前处理
将贝类样品去壳取可食部分匀浆。称取试样2.0g，加入50μl内标(1ppm)，再加入400μl1.5mol/lnaoh溶液混匀，使用5ml乙腈提取，涡旋混匀后超声2min，4500r/min离心5min，提取上清液，剩余残渣加入5ml乙腈重复提取一次，合并2次上清液，加入约5.0g无水硫酸钠，涡旋，4500r/min离心5min，提取上清液于40℃氮气吹干，用5ml二氯甲烷复溶，待净化。
相比于传统提取方法，本发明通过添加naoh调节ph值改变目标物存在形态，有效降低了杂质干扰，比较了纯乙腈、纯乙酸乙酯、乙腈 naoh分别作为提取溶液的效果，发现乙酸乙酯对于特丁津的实际回收率低于50％，影响检测灵敏度。因此，确定添加naoh的乙腈作为提取溶液。
中性氧化铝柱(1g/6ml)提前用3ml二氯甲烷进行活化，取上述复溶液过柱，收集流出液，再用5ml二氯甲烷进行洗脱，同时收集洗脱液，合并于40℃氮气吹干，1ml初始流动相进行复溶，过膜，供液相色谱-质谱测定。
(3)高效液相色谱--四级杆串联质谱和高分辨质谱检测
具体参数条件如下：
液相条件：kinetexxbc18色谱柱(美国phenomenex公司，4μm，2.1mm×150mm)；进样量:10μl；流速0.25ml/min；流动相：a为0.1％甲酸水溶液，b为乙腈；洗脱梯度：0min＝5％b,3.01min＝95％b，6.31min＝5％b，8.00min＝5％b。
四级杆串联质谱条件：电子轰击源(esi)，多反应监测扫描模式(mrm)；正离子扫描，喷雾电压为3500v。其他相关质谱条件见表1。
高分辨质谱(qexactiveorbitrapms)条件：加热电喷雾离子源(hesi)，正离子模式；喷雾电压:3.0kv；毛细管温度320℃；扫描模式：fullms-ddms2；采集范围m/z80～1000；一级全扫描(fullms)分辨率为70000fwhm，二级子离子扫描(ddms2)分辨率为17500fwhm。
内标物选择需要与对应目标物的响应相当，同时消除操作过程对分析结果的影响，保证目标物的回收率结果在70％～120％。试验过程中出于成本和操作需要，针对多个目标物在满足回收率条件下，尽量减少内标物的数量。本发明通过试验筛选出满足条件的三个内标物。在优化过程中发现用d6-扑草净和d5-莠去津作为内标校正特丁津时，回收率皆低于50％，说明二者的响应高于特丁津，不适合作其内标，而选择d5-特丁津做其内标可以将回收率做到70％以上。表1列出优化后每个化合物对应的内标物。
其中西草净、西玛津、莠去津、去乙基去异丙基莠去津(dedip-莠去津)以及去异丙基莠去津(dip-莠去津)以d5-莠去津为内标，莠灭净、扑草净、特丁净、2-羟基去双异丙基扑草净(2-ohddip-扑草净)、去双异丙基扑草净(ddip-扑草净)、去异丙基扑草净(dip-扑草净)和2-羟基扑草净(2-oh-扑草净)以d6-扑草净为内标，特丁津以d5-特丁津为内标。
表1三嗪类除草剂及其代谢产物的相关四级杆串联质谱参数
注：*定量离子。
(4)检出限、回收率和精密度
用甲醇配置系列浓度的标准溶液，同时含有混合标准外标和内标的溶液，每个溶液中内标浓度相同，外标浓度成梯度浓度分别为0.10ng/ml、0.50ng/ml、1.00ng/ml、5.00ng/ml、10.0ng/ml、50.0ng/ml、100ng/ml和200ng/ml。按照步骤(2)和步骤(3)的方法通过高效液相色谱-四级杆串联质谱(hplc-ms/ms)内标法准确定量，以目标物定量离子与内标物定量离子峰面积比为纵坐标，质量浓度为横坐标，制作标准曲线。
在线性范围内通过向空白贝类样品中同时添加7种三嗪类除草剂和6种代谢产物标准溶液按照步骤(2)和步骤(3)的方法得到回收率和精密度。贝类样品中三嗪类除草剂及其代谢产物的添加回收实验(n＝6)，如表2所示：
表2贝类样品中三嗪类除草剂及其代谢产物的添加回收实验(n＝6)
结果表明，本发明方法针对7种三嗪类除草剂和6种代谢产物的最低检出限(lod)为0.1μg/kg(s/n>3)，定量限(loq)为0.3μg/kg(s/n>10)，同时选用三个不同浓度的加标实验，回收率均在70.0％～120％之间，相对标准偏差皆小于12％。图1为标准溶液外标法、基质加标外标法和内标校正方法对目标物的回收率比较。
对于串联质谱得到的阳性样品，结合高分辨质谱的fullms-ddms2扫描模式，通过一级全扫描获得精确质量数及二级扫描获得碎片离子信息(一级全扫描精确质量数作为定量离子，二级子离子扫描中1个丰度较高的特征离子作为定性离子)，进一步针对复杂基质阳性样品进行定性，同时提高了高分辨质谱的定量能力，实现一次进样同时高通量定性筛查和高灵敏定量检测。本发明方法中，贝类阳性样品的四级杆串联质谱多反应监测扫描(mrm)和高分辨质谱fullms-ddms2谱图分别见图2、图3和图4。
结果表明，本发明技术方案具有较高的准确性和灵敏度，且重现性好，操作简便、高效，易于普及，适合于贝类样品中三嗪类除草剂及其代谢产物的同时定性定量检测。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
1.一种贝类中三嗪类除草剂及其代谢产物的检测方法，其特征在于，对待检测贝类样品进行高效前处理；再引入内标法并结合高效液相色谱--四级杆串联质谱和高分辨质谱，对贝类样品中三嗪类除草剂及其代谢产物快速定量和准确定性分析；
所述样品的高效前处理是将贝类样品匀浆后加入内标；再加入氢氧化钠溶液混匀，使用乙腈超声辅助提取，提取的上清液加入无水硫酸钠涡旋离心，离心后的上清液干燥后复溶，并结合中性氧化铝柱净化，待测。
2.根据权利要求1所述贝类中三嗪类除草剂及其代谢产物的检测方法，其特征在于，所述的三嗪类除草剂为西草净、西玛津、莠灭净、莠去津、扑草净、特丁净、特丁津中的至少一种；所述三嗪类代谢产物为：2-羟基去双异丙基扑草净、去双异丙基扑草净、去异丙基扑草净、2-羟基扑草净、去乙基去异丙基莠去津、去异丙基莠去津中的至少一种。
3.根据权利要求1或2所述贝类中三嗪类除草剂及其代谢产物的检测方法，其特征在于，所述内标物为d5-莠去津、d6-扑草净、d5-特丁津中的至少一种。
4.根据权利要求3所述贝类中三嗪类除草剂及其代谢产物的检测方法，其特征在于，所述检测过程中，
液相条件：kinetexxbc18色谱柱(4μm，2.1mm×150mm)；进样量:10μl；流速0.25ml/min；流动相：a为0.1％甲酸水溶液，b为乙腈；洗脱梯度：0min＝5％b,3.01min＝95％b，6.31min＝5％b，8.00min＝5％b；
质谱条件：
四级杆串联质谱：电子轰击源，多反应监测扫描模式；正离子扫描，喷雾电压为3500v；
其他相关四级杆串联质谱条件如下：
注：*定量离子
高分辨质谱：加热电喷雾离子源，正离子模式；喷雾电压:3.0kv；毛细管温度320℃；扫描模式：fullms-ddms2；采集范围m/z80～1000；一级全扫描分辨率为70000fwhm，二级子离子扫描分辨率为17500fwhm。
5.根据权利要求1～4任一项所述贝类中三嗪类除草剂及其代谢产物的检测方法，其特征在于，所述贝类样品为牡蛎、扇贝、贻贝、菲律宾蛤仔中的任一种。
技术总结