本发明属于色谱检测领域，涉及一种红心鸭蛋中类胡萝卜素含量的测定方法，具体涉及一种红心鸭蛋中类胡萝卜素含量的高效液相色谱测定方法。
背景技术：
随着人们生活水平的不断提高，人们对食品的要求不仅仅停留在营养的需求方面，对视觉的需求方面也有了更高的追求。蛋黄着色是一个天然的过程，类胡萝卜素是形成蛋黄色泽主要的着色因素，由于禽类本身不能合成这些类胡萝卜素，需要从所摄食的食物中获取，并沉积到蛋黄中，因此，在饲料中加入不同比例的该类色素，能使蛋黄颜色发生改变，以此吸引消费者。但由于使用类胡萝卜素仍会存在安全风险，且近些年来的研究表明角黄素有一定的肝损伤性，而且大量摄入的角黄素可能会在视网膜蓄积，从而影响视力。目前我国还未有针对蛋类中类胡萝卜素含量的检测标准，监管难度大。
从结构上来说，类胡萝卜素是聚异戊二烯化合物。由于类胡萝卜素的性质不稳定，易受光、热、酸、碱等环境影响，给鸭蛋中类胡萝卜素含量的测定增加了难度。目前，类胡萝卜素的主要分析方法是采用高效液相色谱法(hplc)，但未见能同时测定蛋中多种类胡萝卜素方法的报道，并且国内对类胡萝卜素的检测方法主要通过柱层析、有机试剂提取、皂化等手段进行样品前处理，步骤繁琐，且需要用到大量丙酮、石油醚、氯仿、乙酸乙酯等易挥发的有毒试剂，对检测人员危害较大。本发明申请将建立一种可同时测定红心鸭蛋中辣椒红素、虾青素、叶黄素、玉米黄素和角黄素等5种类胡萝卜素的高效液相色谱法，为红心鸭蛋的质量安全监控提供技术保障。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种红心鸭蛋中类胡萝卜素含量的测定方法，其是一种能够同时测定红心鸭蛋中辣椒红素、虾青素、叶黄素、玉米黄素、角黄素5种类胡萝卜素含量的高效液相色谱法。
为了达到以上技术效果，本发明采用如下技术方案：
本发明提供的一种红心鸭蛋中类胡萝卜素含量的测定方法，包括如下步骤：
(1)绘制标准曲线：
将辣椒红素、玉米黄素、叶黄素、虾青素和角黄素标准品，在有机溶剂中混合配制成一系列类胡萝卜素标准储备液，随后进行高效液相色谱测试，绘制类胡萝卜素各组分的标准曲线，以最终制备相应的线性回归方程；
具体为，精密称取辣椒红素、玉米黄素、叶黄素、虾青素和角黄素标准品10mg分别置于不同的100ml容量瓶中，用少量二氯甲烷溶解，再用乙腈定容至刻度，配制成浓度为100μg/ml的标准储备液，-20℃保存。用时用乙腈稀释成浓度为1mg/l、2mg/l、5mg/l、10mg/l、20mg/l的标准序列溶液随后进行高效液相色谱测试，绘制类胡萝卜素各组分的标准曲线，以最终制备相应的线性回归方程。
(2)红心鸭蛋中类胡萝卜素含量的测定：
利用有机溶剂对红心鸭蛋样品进行超声提取，随后旋转蒸发浓缩、离心脱脂，得到待测样品溶液；
将所述待测样品溶液进行高效液相色谱测试，并分别记录辣椒红素、玉米黄素、叶黄素、虾青素和角黄素对应的峰面积；
将所述辣椒红素、玉米黄素、叶黄素、虾青素和角黄素的峰面积分别代入相应的由步骤(1)得到的线性回归方程中，计算得到相应的所述类胡萝卜素各组分的含量。
优选的，所述有机溶剂为乙腈。
优选的，所述色谱测试条件为：所述高效液相色谱的仪器型号为agilent1260hplc，二极管阵列检测器的检测波长为471nm，及采用agilentporoshell120ec-c18色谱柱分离，并以乙酸铵和乙腈作为流动相进行梯度洗脱。
优选的，所述色谱柱的规格参数为：4.6mm×100mm，填料直径为4μm；且所述色谱柱的柱温为35℃，进样量为5μl。
优选的，所述流动相为20mmol/l乙酸铵溶液和乙腈组成的混合溶液，且流动相流速为1.0ml/min，分析时间为25min。
优选的，所述步骤(2)中的超声提取步骤：在红心鸭蛋待测样品中加入乙腈和无水硫酸钠后超声提取10min，随后离心、移取乙腈相，并用乙腈重复提取两次，合并乙腈相，随后加入正丙醇旋转蒸发浓缩，以及用乙腈溶解后加入正己烷离心过滤，即得待测样品溶液。
优选的，每次提取加入乙腈的量为20ml，且加入5g无水硫酸钠、5ml正丙醇及3ml正己烷。
优选的，所述离心过滤参数：离心时间为5min，离心转速为4000r/min，滤膜的膜孔为0.22μm。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供的一种红心鸭蛋中类胡萝卜素含量的测定方法，具有如下优异效果：
本发明通过将样品经乙腈提取，浓缩后用正己烷脱脂，并采用agilentporoshell120ec-c18(4μm，4.6mm×100mm)色谱柱分离，以20mmol/l乙酸铵和乙腈作为流动相进行梯度洗脱，且控制流动相的流速为1.0ml/min，二极管阵列检测器的检测波长为471nm，在25min时长完成红心鸭蛋中类胡萝卜素含量的测定。红心鸭蛋中辣椒红素、虾青素、叶黄素、玉米黄素、角黄素5种类胡萝卜素不仅可以实现基线分离，线性关系良好，相关系数均在0.999以上，而且样品在3个浓度水平的加标回收率为84.39％～93.42％(n＝6)。本发明公开保护的方法简便、快捷、准确，可用于红心鸭蛋中5种类胡萝卜素的测定，为红心鸭蛋的质量安全监控提供技术障碍。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例，下面将对实施例中所需要使用的附图做简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可根据提供的附图获得其他的附图。
图1是本发明不同色谱柱的分离效果图。其中，1为辣椒红素，2为虾青素，3为叶黄素，4为玉米黄素，5为角黄素。
图2为本发明5种类胡萝卜素混合标准溶液色谱图。其中，1为辣椒红素，2为虾青素，3为叶黄素，4为玉米黄素，5为角黄素。
图3为本发明待测样品溶液色谱图。其中，1为虾青素，2为叶黄素，3为玉米黄素，4为角黄素。
图4为本发明5种类胡萝卜素紫外吸收光谱图。其中，1为角黄素，2为虾青素，3为辣椒红素，4为叶黄素，5为玉米黄素。
图5为本发明5种类胡萝卜素的标准曲线图。其中，图(a)为辣椒红素，图(b)为虾青素，图(c)为叶黄素，图(d)为玉米黄素，图(e)为角黄素。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例及说明书附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明公开保护一种红心鸭蛋中类胡萝卜素含量的测定方法，具体包括如下步骤：
步骤1：绘制标准曲线：
将辣椒红素、玉米黄素、叶黄素、虾青素和角黄素标准品，在有机溶剂中混合配制成一系列类胡萝卜素标准储备液，随后进行高效液相色谱测试，绘制类胡萝卜素各组分的标准曲线，以最终制备相应的线性回归方程；
步骤2：红心鸭蛋中类胡萝卜素含量的测定：
利用有机溶剂对红心鸭蛋样品进行超声提取，随后旋转蒸发浓缩、离心脱脂，得到待测样品溶液；
将所述待测样品溶液进行高效液相色谱测试，并分别记录辣椒红素、玉米黄素、叶黄素、虾青素和角黄素对应的峰面积；
将所述辣椒红素、玉米黄素、叶黄素、虾青素和角黄素的峰面积分别代入相应的由步骤(1)得到的线性回归方程中，计算得到相应的所述类胡萝卜素各组分的含量。
为了进一步优化上述技术方案，有机溶剂为乙腈。
为了进一步优化上述技术方案，色谱测试条件为：高效液相色谱的仪器型号为agilent1260hplc，二极管阵列检测器的检测波长为471nm，及采用agilentporoshell120ec-c18色谱柱分离，并以乙酸铵和乙腈作为流动相进行梯度洗脱。
需要说明的是，本发明以a:20mmol/l乙酸铵溶液和b:乙腈作为流动相进行梯度洗脱，其中洗脱程序为：0～12min，b：85％；12～15min，b：85％～100％；15～20min，b：100％；20～25min，b：100％～85％。且利用梯度洗脱可实现5种类胡萝卜素的有效分离，有利于准确定性与定量。
为了进一步优化上述技术方案，色谱柱的规格参数为：4.6mm×100mm，填料直径为4μm；且色谱柱的柱温为35℃，进样量为5μl。
为了进一步优化上述技术方案，流动相为20mmol/l乙酸铵溶液和乙腈组成的混合溶液，且流动相流速为1.0ml/min，分析时间为25min。
为了进一步优化上述技术方案，步骤(2)中的超声提取步骤：在红心鸭蛋待测样品中加入乙腈和无水硫酸钠后超声提取10min，随后离心、移取乙腈相，并用乙腈重复提取两次，合并乙腈相，随后加入正丙醇旋转蒸发浓缩，以及用乙腈溶解后加入正己烷离心过滤，即得待测样品溶液。
为了进一步优化上述技术方案，每次提取加入乙腈的量为20ml，且加入5g无水硫酸钠、5ml正丙醇及3ml正己烷。
为了进一步优化上述技术方案，离心过滤参数：离心时间为5min，离心转速为4000r/min，滤膜的膜孔为0.22μm。
下面结合具体实施例进一步阐述本发明的技术方案和有益效果，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实验例。
(1)仪器、试剂与材料
agilent1260高效液相色谱仪(配二级阵列管检测器，美国安捷伦公司)；kq-400de数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；sigma3-18k高速冷冻离心机(德国sigma公司)；r-300旋转蒸发仪(瑞士步琦公司)；milli-qintegral10超纯水机(美国millipore公司)。
辣椒红素(95％，加拿大trc公司)、玉米黄素(89.6％，美国stanfordchemicals公司)、叶黄素(89.1％，美国stanfordchemicals公司、虾青素(98.1％，德国dr.ehrenstorfer公司)、角黄素(98.3％，德国dr.ehrenstorfer公司)。
乙腈(色谱纯，美国tedia公司)、二氯甲烷(色谱纯，美国tedia公司)、正己烷(色谱纯，美国tedia公司)、正丙醇(分析纯，广东光华科技股份有限公司)、无水硫酸钠(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)，实验用水由milli-qintegral10超纯水机制备。
(2)绘制标准曲线
精密称取辣椒红素、玉米黄素、叶黄素、虾青素和角黄素标准品10mg分别置于不同的100ml容量瓶中，用少量二氯甲烷溶解，再用乙腈定容至刻度，配制成浓度为100μg/ml的标准储备液，且于-20℃保存，备用。用时根据具体情况用乙腈稀释成适当浓度的系列标准工作溶液。
对上述系列标准工作溶液进行高效液相色谱测试，绘制类胡萝卜素各组分的标准曲线(如图5所示)，以最终制备相应的线性回归方程，其中色谱测试条件如下所示：
色谱柱：agilentporoshell120ec-c18(4.6mm×100mm)色谱柱；柱温35℃；进样量为5μl；且二极管阵列检测器的检测波长为471nm；流动相a：20mmol/l乙酸铵，流动相b：乙腈；流速为1.0ml/min的梯度洗脱程序如表1。
表1梯度洗脱程序
(3)红心鸭蛋中类胡萝卜素含量的测定
①样品前处理
准确称取均质样品5.0g(精确至0.01g)于50ml离心管中，加入20ml乙腈及5g无水硫酸钠后，涡旋混匀1min，超声提取10min，再以4000r/min离心5min，将上清液转移至100ml旋转蒸发瓶中。对离心管中的残渣每次用20ml乙腈再重复提取两次，合并三次收集的乙腈相，加入5ml正丙醇，于40℃旋转蒸发浓缩至干，用5ml乙腈溶解并转移至15ml离心管中，加入3ml正己烷，涡旋1min，以4000r/min离心5min，弃去上层正己烷相，下层乙腈相过0.22μm滤膜后，上机分析。
②工艺参数的优化选择
i提取条件的选择
类胡萝卜素属于弱极性化合物，可溶于大部分有机溶剂中，不溶于水，因此参考相关文献，选择石油醚、二氯甲烷、乙腈、丙酮等有机溶剂作为提取试剂进行考察。石油醚由于极性太低，提取的效率较差。丙酮由于挥发性较大，在减压浓缩中极易暴沸，难以操作。二氯甲烷和乙腈的提取效率较高，但二氯甲烷的沸点低，在实验过程中对人员和环境的危害大。鸭蛋中存在大量的蛋白质和脂肪，用乙腈作为提取试剂可具有使蛋白质变性、减少脂肪进入提取液的优点，并加入无水硫酸钠吸收样液中的水分，提高提取效果。在减压蒸发中加入正丙醇，可有效防止溶剂暴沸。最后使用正己烷对样液进一步脱脂，减少杂质的干扰，有利于上机分析。
ii色谱条件优化
本发明申请比较了agilentzorbaxsb-c8(5μm，4.6×250mm)、agilentzorbaxsb-c18(5μm，4.6×250mm)和agilentporoshell120ec-c18(4μm,4.6×100mm)色谱柱对5种类胡萝卜素的分离效果。在相同条件下，zorbaxsb-c8色谱柱出峰过早，辣椒红素和虾青素在相同时间出峰，无法分开。zorbaxsb-c18色谱柱能对5种类胡萝卜素达到完全分离，但整体出峰时间较晚，影响检测效率，且角黄素的峰型拖尾严重。使用poroshell120ec-c18色谱柱时，5种类胡萝卜素整体出峰较快，分离度较好，峰型尖锐，如附图1。
此外，本发明申请还比较了乙腈-甲醇-二氯甲烷、乙腈-乙酸乙酯、甲醇-水、乙腈-水、20mmol/l乙酸铵-乙腈体系对5种类胡萝卜素的分离效果。叶黄素和玉米黄素均为带有羟基的类胡萝卜素，互为同分异构体，仅有一个双键位置不同。由于结构上及其相似，用乙腈-甲醇-二氯甲烷、乙腈-乙酸乙酯和甲醇-水体系均无法实现叶黄素和玉米黄素的有效分离。用乙腈-水可以实现5种组分的完全分离，但虾青素的峰型有拖尾情况，在水相中添加20mmol/l的乙酸铵后，发现5种组分整体的信号响应值有所提高，虾青素的拖尾情况也得到改善，其中5种类胡萝卜素混合标准溶液色谱图见附图2，5种类胡萝卜素组分峰型尖锐，分离度好，样品的色谱图见附图3，样品中目标化合物的峰型尖锐，无干扰，与标准溶液中对应组分的保留时间接近，可准确进行定性与定量。
iii二极管阵列检测器波长的优化
由于类胡萝卜素分子内存在共轭多烯及几种助色基团，所以通常在400～600nm范围内有最大吸收。用二极管阵列检测器对5种类胡萝卜素在350nm～600nm的波长范围内进行扫描，结果如图4所示，辣椒红素、虾青素和角黄素在471nm左右的波长下有最大吸收，叶黄素和玉米黄素在450nm和471nm均有较大吸收，在471nm波长下测定5种类胡萝卜素，均显示出较好分离效果和响应信号，因此选用471nm波长。
综上所述，由所述测定方法的工艺参数的优化结果可知，本发明优选将样品经乙腈提取，浓缩后用正己烷脱脂，并采用agilentporoshell120ec-c18(4μm，4.6mm×100mm)色谱柱分离，以20mmol/l乙酸铵和乙腈作为流动相进行梯度洗脱，且控制流动相的流速为1.0ml/min，二极管阵列检测器的检测波长为471nm，在25min时长完成红心鸭蛋中类胡萝卜素含量的测定。
进一步的，为验证本发明公开利用高效液相色谱测定红心鸭蛋中类胡萝卜素含量的精准度及具体应用，发明人还进行了如下试验：
(1)标准曲线与检出限
取浓度分别为0.5mg/l、1mg/l、2mg/l、5mg/l、10mg/l、20mg/l的标准序列溶液，以峰面积(y)为纵坐标，以浓度(x)为横坐标作图，绘制标准曲线(如图5所示)。通过逐渐降低样品中所添加的标准溶液的浓度，当各化合物信噪比(s/n)为3时，其质量浓度定义为方法检出限(lod)。各化合物线性方程、相关系数、检出限结果见表2。
表2各化合物的线性方程、相关系数和检出限
(2)加标回收率和精密度
红心鸭蛋中添加3个浓度水平的标准混合溶液，按照上述方法进行前处理，每个加标水平平行测定6次。由表3可见，3种不同浓度水平的加标回收率在84.39％～93.42％之间，相对标准偏差在1.07％～3.02之间，说明方法的回收率好、精密度高。
表3方法的回收率和精密度(n＝6)
(3)实际样品检测结果
采集当地市场上销售的21份红心鸭蛋样品进行检测，结果见表4。21份样品均未检出辣椒红素，有3份样品检出虾青素，含量在1.41mg/kg～63.2mg/kg之间，样品中均含有叶黄素、玉米黄素和角黄素，含量分别在1.78mg/kg～30.5mg/kg、3.92mg/kg～32.9mg/kg和1.15mg/kg～17.9mg/kg范围内。
表4样品中5种类胡萝卜素含量
注：“nd”为未检出。
综上所述，本发明申请建立了红心鸭蛋中5种类胡萝卜素的高效液相色谱测定方法。样品用乙腈提取后，经旋转蒸发浓缩，正己烷脱脂后上机测定。结果表明：本方法操作简单、分离度好、灵敏度高且准确性好，为测定红心鸭蛋中的类胡萝卜素提供方法参考。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
1.一种红心鸭蛋中类胡萝卜素含量的测定方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)绘制标准曲线：
将辣椒红素、玉米黄素、叶黄素、虾青素和角黄素标准品，在有机溶剂中混合配制成一系列类胡萝卜素标准储备液，随后进行高效液相色谱测试，绘制类胡萝卜素各组分的标准曲线，以最终制备相应的线性回归方程；
(2)红心鸭蛋中类胡萝卜素含量的测定：
利用有机溶剂对红心鸭蛋样品进行超声提取，随后旋转蒸发浓缩、离心脱脂，得到待测样品溶液；
将所述待测样品溶液进行高效液相色谱测试，并分别记录辣椒红素、玉米黄素、叶黄素、虾青素和角黄素对应的峰面积；
将所述辣椒红素、玉米黄素、叶黄素、虾青素和角黄素的峰面积分别代入相应的由步骤(1)得到的线性回归方程中，计算得到相应的所述类胡萝卜素各组分的含量。
2.根据权利要求1所述的一种红心鸭蛋中类胡萝卜素含量的测定方法，其特征在于，所述有机溶剂为乙腈。
3.根据权利要求1所述的一种红心鸭蛋中类胡萝卜素含量的测定方法，其特征在于，所述色谱测试条件为：所述高效液相色谱的仪器型号为agilent1260hplc，二极管阵列检测器的检测波长为471nm，及采用agilentporoshell120ec-c18色谱柱分离，并以乙酸铵和乙腈作为流动相进行梯度洗脱。
4.根据权利要求3所述的一种红心鸭蛋中类胡萝卜素含量的测定方法，其特征在于，所述色谱柱的规格参数为：4.6mm×100mm，填料直径为4μm；且所述色谱柱的柱温为35℃，进样量为5μl。
5.根据权利要求3所述的一种红心鸭蛋中类胡萝卜素含量的测定方法，其特征在于，所述流动相为20mmol/l乙酸铵溶液和乙腈组成的混合溶液，且流动相流速为1.0ml/min，分析时间为25min。
6.根据权利要求1所述的一种红心鸭蛋中类胡萝卜素含量的测定方法，其特征在于，所述步骤(2)中的超声提取步骤：在红心鸭蛋待测样品中加入乙腈和无水硫酸钠后超声提取10min，随后离心、移取乙腈相，并用乙腈重复提取两次，合并乙腈相，随后加入正丙醇旋转蒸发浓缩，以及用乙腈溶解后加入正己烷离心过滤，即得待测样品溶液。
7.根据权利要求6所述的一种红心鸭蛋中类胡萝卜素含量的测定方法，其特征在于，每次提取加入乙腈的量为20ml，且加入5g无水硫酸钠、5ml正丙醇及3ml正己烷。
8.根据权利要求6所述的一种红心鸭蛋中类胡萝卜素含量的测定方法，其特征在于，所述离心过滤参数：离心时间为5min，离心转速为4000r/min，滤膜的膜孔为0.22μm。
技术总结