一种动物油脂中喹诺酮药物残留的测定方法与流程

本发明属于食品检测
技术领域：
，具体涉及一种动物油脂中喹诺酮药物残留的测定方法。
背景技术：
：喹诺酮类药物是一种人工合成的广谱抗菌药。因其具有性质稳定、价格便宜、抗菌谱广、抗菌活性强等优点，常作为饲料添加剂来预防和治疗动物疾病。但喹诺酮类药物是会在动物体内产生残留，严重危害人体健康。欧盟、美国、日本等国相继制定了喹诺酮类在动物组织中的最高残留限量。2002年中国农业部235号公告规定了牛、羊脂肪中的达氟沙星、二氟沙星、恩诺沙星的农药最大残留限量值为100μg/kg。2016年中国农业农村部2292号公告中禁止在动物食品中使用洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星。禽畜产品中喹诺酮类药物的残留情况作为继瘦肉精之后的又一个重点予以监控，建立高效可靠的喹诺酮残留检测的方法势在必行。当前，喹诺酮类药物的检测方法有毛细管电泳法、免疫法(酶联免疫法和免疫亲和色谱法)、光谱法、高效液相色谱及液质联用技术。这些方法及国家标准方法针对的基质主要是动物肌肉组织。喹诺酮类药物经过食物链富集作用主要积聚于动物的肌肉和脂肪，而针对动物油脂中喹诺酮类药物的检测，相关的国家标准方法和文献都较少。因此，有必要提供改进的技术方案以克服现有技术中存在的技术问题。技术实现要素：为解决现有技术存在的问题，本发明提供一种动物油脂中喹诺酮药物残留的测定方法，减少了现有技术存在的对动物油脂类样品提取效率差，测量准确性差等问题。本发明提供一种动物油脂中喹诺酮药物残留的测定方法，包括：步骤一、称取0.9～2g的动物油脂，加入5～10ml正己烷涡旋溶解，得到预溶液i；步骤二、在步骤一得到的预溶液i中，加入9～20ml的含乙腈的溶液涡旋5～10min，得到预溶液ii；步骤三、将所述的预溶液ii进行超声溶解10～40min，得到待检测溶液i，然后进行检测前的净化预处理，得到待检测溶液ii；步骤四、将所述的待检测溶液ii经过0.22μm滤膜后，进行液相色谱串联质谱仪检测。通过上述技术方案，能有效提取动物油脂样品中喹诺酮类药物残留，使提取效率达到50％左右，样品回收率达到50％左右。优选地，在如前所述的测定方法中，所述的含乙腈的溶液为含75～85％乙腈的水溶液。通过上述技术方案，能有效提取动物油脂样品中喹诺酮类药物残留，使提取效率达到80％以上，回收率达到80％以上。优选地，在如前所述的测定方法中，所述的含乙腈的溶液为酸化乙腈溶液；所述的酸化乙腈溶液包括甲酸和乙腈，甲酸和乙腈的体积比为1：99。通过上述技术方案，可提供解决的技术问题是能有效提取动物油脂样品中喹诺酮类药物残留，使提取效率达到60％左右，达到的技术效果为：样品回收率60％左右。优选地，在如前所述的测定方法中，所述的检测前的净化预处理包括：将所述的待检测溶液i进行3500～4500r/min离心5～10min，然后取下层乙腈水层上样primehlb小柱，得到滤出液(待检测溶液ii)。通过上述技术方案，可提供解决的技术问题是净化提取液，使样液在质谱上的检测信号更稳定，准确，达到的技术效果为：样品回收率在90％以上110％以下。优选地，在如前所述的测定方法中，步骤三还包括：将所述的预溶液ii进行超声溶解的时间为30～40min，得到待检测溶液i。通过上述技术方案，可使样品的提取更充分，提取回收率在90％以上。优选地，在如前所述的测定方法中，所述的检测前的净化预处理包括：吸取所述的待检测溶液i的乙腈层于150ml旋转瓶中，再向残渣中加入10ml的1％酸化乙腈，重复提取一次，合并乙腈层，于40℃旋转蒸发仪蒸发至液体含量不高于1％，加入5ml的15％甲醇水溶液溶解残渣，得到待净化液；将hlb固相萃取小柱预先用5ml甲醇、5ml水活化，处理完毕后，加入所述的待净化液，再用5ml水淋洗小柱，最后用5ml甲醇洗脱小柱，收集洗脱液，氮吹至液体含量不高于1％，用15％甲醇水定容至0.5ml，得到待检测溶液ii。通过上述技术方案，能有效提取和净化动物油脂样品中喹诺酮类药物残留，使提取效率达到60％左右，样品回收率在60％左右。优选地，在如前所述的测定方法中，所述的液相色谱串联质谱仪的检测参数具体如下：1)色谱柱：beh，c18，2.1*50mm，1.7um；2)流动相：a甲醇，b0.1％甲酸 2mmol/l甲酸铵水；3)流速：0.35ml/min；4)进样量：5ul；5)色谱柱温度：30℃；6)梯度洗脱程序如表1所示；7)离子源：电喷雾离子源；8)扫描模式：mrm；9)气帘气：25psi；10)碰撞气：medium；11)离子化电压：5500v；12)离子源温度：600℃；13)喷雾气：60psi；14)辅助加热气：50psi；15)母离子，子离子及去簇电压,碰撞能量如表2所述。通过上述技术方案，可在短时间内，准确检测喹诺酮类的含量，实现5分钟时间内完成对11种喹诺酮类化合物的定性和定量测定。本发明还提供一种所述的测定方法在生物、食品或医疗领域上的应用。本发明创造的有益效果：本发明提供一种动物油脂中喹诺酮药物残留的测定方法，通过采用用正己烷溶解油脂，然后用含乙腈的溶液进行提取，建立了针对油脂类样品的提取前处理实验方法。同时，采用了primehlb柱和hlb柱两种净化柱作净化，对于此提取液进行净化。检测仪器的分析检测时间很短，检测时间由传统的20多分钟缩短到5分钟以内。具体实施方式下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照国家标准测定。若没有相应的国家标准，则按照通用的国际标准、常规条件、或按照制造厂商所建议的条件进行。可对本发明提到的特征或实施例提到的特征进行组合。本说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。在本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有技术特征以及优选特征可以相互组合形成新的技术方案。为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明，但本发明包括但不限于这些实施例。液相色谱-串联质谱仪(购自waters公司，h-class型液相，配ab公司api-5500triplequad型串联质谱检测器)；bs-210s型分析天平(购自北京赛多利斯天平有限公司)；zfq-85a型旋转蒸发仪(购自上海医疗器械厂)；超纯水系统(购自美国millipore公司)；mf-80型离心机(购自hanil科学仪器有限公司)；ms-1型旋涡振荡器(购自广州仪科实验室技术有限公司)；凝胶渗透色谱仪(购自上海磐合科学仪器有限公司)；氮吹仪(购自上海安谱公司)；其余设备和试剂均为市售常见产品。对比例1、一种动物油脂中喹诺酮药物残留的测定方法称取2.0g试样，用10ml乙腈振荡30min提取，加入萃取盐并漩涡1min，试样4000r/min离心5min,取出上清液加入净化管中并漩涡1min，试样7000r/min离心5min，取上清液过0.22μm滤膜后供lc-ms/ms分析。对比例2、一种动物油脂中喹诺酮药物残留的测定方法称取0.5g试样，加入10ml环己烷：乙酸乙酯(1:1)溶解，取5ml上样至凝胶渗透色谱仪，整个过程45分钟，收集馏分时间为28～45min。将收集好的溶液倒入150ml平底烧瓶中，40℃水浴下旋转蒸发至近干，用0.5ml15％甲醇水定容，过0.22μm滤膜后供lc-ms/ms分析。实施例1、一种动物油脂中喹诺酮药物残留的测定方法本实施例主要描述了一种动物油脂中喹诺酮药物残留的测定方法，包括以下步骤：步骤一、称取1.0g试样于离心管中加入9ml正己烷涡旋溶解；步骤二、加入10ml的1％酸化乙腈(甲酸 乙腈＝1 99v/v)涡旋6min，超声30min；步骤三、吸取乙腈层(下层)于150ml旋转瓶中，再向残渣中加入10ml1％酸化乙腈，重复提取一次，合并乙腈层，于40℃旋转蒸发仪蒸发至近干(液体含量不高于1％)，加入5ml的15％甲醇水溶液溶解残渣，得到待净化液；步骤四、将hlb固相萃取小柱预先用5ml甲醇、5ml水活化，处理完毕后，加入待净化液，再用5ml水淋洗小柱，最后用5ml甲醇洗脱小柱，收集洗脱液，氮吹至近干，用15％甲醇水定容至0.5ml，过0.22μm滤膜后供液相色谱串联质谱仪(lc-ms/ms)检测。对于液相色谱串联质谱仪的检测，其检测参数具体如下：1)色谱柱：behc18,2.1*50mm,1.7um；2)流动相：a甲醇，b0.1％甲酸 2mmol/l甲酸铵水；3)流速：0.35ml/min；4)进样量：5ul；5)色谱柱温度：30℃；6)梯度洗脱程序如表1所示；表1.梯度洗脱程序时间(min)a(％)b(％)010900.510901.530703.090104.090104.0110905.010907)离子源：电喷雾离子源；8)扫描模式：mrm；9)气帘气：25psi；10)碰撞气：medium；11)离子化电压：5500v；12)离子源温度：600℃；13)喷雾气：60psi；14)辅助加热气：50psi；15)母离子,子离子及去簇电压,碰撞能量如表2所述。表2.液相色谱串联质谱测定喹诺酮类兽药的技术采纳数表实施例2、一种动物油脂中喹诺酮药物残留的测定方法本实施例主要描述了一种动物油脂中喹诺酮药物残留的测定方法，包括以下步骤：步骤一、称取1.0g试样于离心管中，加入7ml正己烷涡旋溶解；步骤二、加入10ml的80％乙腈水(乙腈 水＝80 20v/v)溶液涡旋6min，超声12min；步骤三、4000r/min离心7min，取下层乙腈水层上样primehlb小柱，滤出液过0.22μm滤膜后供液相色谱串联质谱仪(lc-ms/ms)检测。液相色谱串联质谱仪的检测条件，和实施例1相同。实施例3、喹诺酮类药物的液相色谱-串联质谱法的标准曲线的绘制对于液相色谱-串联质谱法，根据每种化合物的响应强弱，配制不同浓度的基质标准溶液，以各化合物峰面积(y)对其浓度(x，μg/l)绘制标准曲线，结果表明每个化合物在各自的浓度范围内具有良好的线性关系，其相关系数r均不低于0.999(表3)。表3.液相色谱-串联质谱法11种喹诺酮标准曲线实施例4、不同样品的喹诺酮类药物的液相色谱-串联质谱法的检测以动物油脂为样品，加入标准溶液，分别按照实施例1～2和对比例1～2中所述方法进行处理，依照不同倍数稀释，通过lc-ms/ms进行检测，以信噪比(s/n)≥10为界限，确定其最低检出限，以称样量1.0g计，得最低检出限(见表4)。表4.lc-ms/ms法进行喹诺酮类兽药最低检出限的测定化合物最低检出限(ug/kg)恩诺沙星0.5诺氟沙星0.5培氟沙星0.5环丙沙星0.5氧氟沙星0.5沙拉沙星0.5洛美沙星0.5恶喹酸0.5氟甲喹0.5二氟沙星0.5达氟沙星0.5以猪油、鸡油、鱼油为样品，加入标准溶液，加标量值分别为1倍检出限、2倍检出限、10倍检出限，按照实施例1和2所述的方法，以及对比例1和2所述的方法，分别进行处理，通过lc-ms/ms分析，比较四种前处理方法对回收率和重现性的影响。表5.猪油1倍检出限加标回收率由表5可见，采用实施例1和2的所述方法各喹诺酮组分回收率为90.6％～100.0％，相对标准偏差为0.38％～5.98％；采用对比例1所述的方法各喹诺酮组分回收率为44.1％～98.3％,相对标准偏差为23.1％～44.8％；采用对比例2所述的方法各喹诺酮组分回收率为38.6％～91.8％，相对标准偏差为0.71％～13.0％。表6.猪油2倍检出限加标回收率由表6可见，采用实施例1和2的所述方法各喹诺酮组分回收率为90.1％～99.8％，相对标准偏差为0.26％～5.94％；采用对比例1的所述方法各喹诺酮组分回收率为41.5％～89.6％,相对标准偏差为27.8％～48.2％；采用对比例2的所述方法各喹诺酮组分回收率为33.8％～98.8％，相对标准偏差为0.70％～14.8％。表7.猪油10倍检出限加标回收率由表7可见，采用实施例1和2的所述方法各喹诺酮组分回收率为90.9％～99.5％，相对标准偏差为0.22％～5.98％；采用对比例1的所述方法各喹诺酮组分回收率为41.7％～99.5％,相对标准偏差为21.0％～44.8％；采用对比例2的所述方法各喹诺酮组分回收率为42.2％～97.8％，相对标准偏差为0.78％～14.8％。表8.鸡油1倍检出限加标回收率由表8可见，采用实施例1和2的所述方法各喹诺酮组分回收率为90.3％～98.7％，相对标准偏差为0.16％～5.93％；采用对比例1的所述方法各喹诺酮组分回收率为57.8％～96.8％,相对标准偏差为22.7％～47.0％；采用对比例2的所述方法各喹诺酮组分回收率为33.5％～99.0％，相对标准偏差为02.06％～13.8％。表9.鸡油2倍检出限加标回收率由表9可见，采用实施例1和2的所述方法各喹诺酮组分回收率为91.9％～98.8％，相对标准偏差为0.31％～5.81％；采用对比例1的所述方法各喹诺酮组分回收率为46.9％～97.7％,相对标准偏差为24.2％～49.3％；采用对比例2的所述方法各喹诺酮组分回收率为25.3％～96.6％，相对标准偏差为14.40％～16.5％。表10鸡油10倍检出限加标回收率由表10可见，采用实施例1和2的所述方法各喹诺酮组分回收率为90.2％～99.6％，相对标准偏差为0.31％～5.91％；采用对比例1的所述方法各喹诺酮组分回收率为42.7％～86.0％,相对标准偏差为24.2％～48.6％；采用对比例2的所述方法各喹诺酮组分回收率为36.6％～98.8％，相对标准偏差为0.40％～15.7％。表11鱼油1倍检出限加标回收率由表11可见，采用实施例1和2的所述方法各喹诺酮组分回收率为90.2％～99.4％，相对标准偏差为0.80％～5.69％；采用对比例1的所述方法各喹诺酮组分回收率为43.8％～89.2％,相对标准偏差为21.1％～45.7％；采用对比例2的所述方法各喹诺酮组分回收率为33.3％～92.7％，相对标准偏差为2.28％～14.2％。表12鱼油2倍检出限加标回收率由表12可见，采用实施例1和2的所述方法各喹诺酮组分回收率为90.1％～98.7％，相对标准偏差为0.33％～5.98％；采用对比例1的所述方法各喹诺酮组分回收率为48.7％～83.7％,相对标准偏差为23.4％～49.1％；采用对比例2的所述方法各喹诺酮组分回收率为36.4％～88.0％，相对标准偏差为0.85％～15.3％。表13鱼油10倍检出限加标回收率由表13可见，采用实施例1和2的所述方法各喹诺酮组分回收率为90.2％～99.1％，相对标准偏差为0.09％～5.82％；采用对比例1的所述方法各喹诺酮组分回收率为44.1％～96.2％,相对标准偏差为20.9％～41.2％；采用对比例2的所述方法各喹诺酮组分回收率为35.8％～98.3％，相对标准偏差为0.32％～13.3％。由回收率及重现性数据可见，固相萃取柱法的吸附型柱和通过型柱作为前处理的样品中喹诺酮药物的回收率都在90％-100％之间，相对标准偏差都小于6％。两种前处理对动物油脂中喹诺酮类的提取效率都是满意的。quechers法作为前处理的样品中喹诺酮类药物的回收率40％～100％之间，相对标准偏差均大于20％，说明提取的重现性太差，提取效果不稳定，quechers法不适合作为动物油脂中喹诺酮类药物的提取。凝胶渗透色谱法作为前处理的样品中喹诺酮类药物的回收率在25％～100％之间，相对标准偏差都小于20％，回收率偏低的喹诺酮为恩诺沙星,沙拉沙星,达氟沙星，其余8个喹诺酮的回收率在70％～100％之间，说明凝胶渗透色谱法对于这三个喹诺酮药物不是很适用，其余8个是满足检测要求得。相较于quechers法和凝胶渗透色谱法，固相萃取柱法更适合作为动物油脂中11种喹诺酮类药物残留检测的前处理方法。比较吸附型spe柱法和通过型spe柱法，通过型spe法处理过程时间短，价格便宜，步骤简单，可控性更强，经济效益更高，对实验人员的要求也相对低点，人为误差几率比较低。故而通过型spe法相较于吸附型spe法更适用于实验室的动物油脂类样品大批量的处理。而且现在商业化的spe柱很成熟，稳定性也很高，很合适商业实验室的推广使用。实施例5、一种动物油脂中喹诺酮药物残留的测定方法本实施例主要描述了一种动物油脂中喹诺酮药物残留的测定方法，包括以下步骤：步骤一、称取0.9g猪油于离心管中加入5ml正己烷涡旋溶解，得到预溶液i；步骤二、在预溶液i中加入9ml的1％酸化乙腈(甲酸 乙腈＝1 99v/v)涡旋5min，得到预溶液ii；然后超声40min，得到待检测溶液i；步骤三、将待检测溶液i进行检测前的净化预处理：吸取待检测溶液i的乙腈层(下层)于150ml旋转瓶中，再向残渣中加入10ml的1％酸化乙腈，重复提取一次，合并乙腈层，于40℃旋转蒸发仪蒸发至近干(液体含量不高于1％)，加入5ml的15％甲醇水溶液溶解残渣，得到待净化液；将hlb固相萃取小柱预先用5ml甲醇、5ml水活化，处理完毕后，加入所述的待净化液，再用5ml水淋洗小柱，最后用5ml甲醇洗脱小柱，收集洗脱液，氮吹至近干，用15％甲醇水定容至0.5ml，，得到待检测溶液ii；步骤四、将待检测溶液ii，过0.22μm滤膜后供液相色谱串联质谱仪(lc-ms/ms)检测。其中，对于液相色谱串联质谱仪的检测，其检测参数具体如下：1)色谱柱：behc18,2.1*50mm,1.7um；2)流动相：a甲醇，b0.1％甲酸 2mmol/l甲酸铵水；3)流速：0.35ml/min；4)进样量：5ul；5)色谱柱温度：30℃；6)梯度洗脱程序如表1所示；7)离子源：电喷雾离子源；8)扫描模式：mrm；9)气帘气：25psi；10)碰撞气：medium；11)离子化电压：5500v；12)离子源温度：600℃；13)喷雾气：60psi；14)辅助加热气：50psi；15)母离子,子离子及去簇电压,碰撞能量如表2所述。实施例6、一种动物油脂中喹诺酮药物残留的测定方法本实施例主要描述了一种动物油脂中喹诺酮药物残留的测定方法，与实施例5的不同之处仅仅在于以下步骤：步骤一、称取2g鸡油于离心管中加入10ml正己烷涡旋溶解，得到预溶液i；步骤二、在预溶液i中加入20ml的1％酸化乙腈(甲酸 乙腈＝1 99v/v)涡旋10min，得到预溶液ii；然后超声10min，得到待检测溶液i。实施例7、一种动物油脂中喹诺酮药物残留的测定方法本实施例主要描述了一种动物油脂中喹诺酮药物残留的测定方法，与实施例5的不同之处在于：所述的1％酸化乙腈更换为含75％乙腈的水溶液。实施例8、一种动物油脂中喹诺酮药物残留的测定方法本实施例主要描述了一种动物油脂中喹诺酮药物残留的测定方法，与实施例5的不同之处在于：所述的1％酸化乙腈更换为含85％乙腈的水溶液。实施例9、一种动物油脂中喹诺酮药物残留的测定方法本实施例主要描述了一种动物油脂中喹诺酮药物残留的测定方法，与实施例6的不同之处在于：所述的1％酸化乙腈更换为含80％乙腈的水溶液。实施例10、一种动物油脂中喹诺酮药物残留的测定方法本实施例主要描述了一种动物油脂中喹诺酮药物残留的测定方法，包括以下步骤：本实施例主要描述了一种动物油脂中喹诺酮药物残留的测定方法，包括以下步骤：步骤一、称取0.9g鸡油于离心管中，加入7ml正己烷涡旋溶解；步骤二、加入5ml的75％乙腈水(乙腈 水＝75 25v/v)溶液涡旋5min，超声10min；步骤三、3500r/min离心5min，取下层乙腈水层上样primehlb小柱，滤出液过0.22μm滤膜后供液相色谱串联质谱仪(lc-ms/ms)检测。液相色谱串联质谱仪的检测条件，和实施例1相同。实施例11、一种动物油脂中喹诺酮药物残留的测定方法本实施例主要描述了一种动物油脂中喹诺酮药物残留的测定方法，包括以下步骤：本实施例主要描述了一种动物油脂中喹诺酮药物残留的测定方法，包括以下步骤：步骤一、称取2g鸡油于离心管中，加入7ml正己烷涡旋溶解；步骤二、加入10ml的85％乙腈水(乙腈 水＝85 15v/v)溶液涡旋10min，超声40min；步骤三、4500r/min离心10min，取下层乙腈水层上样primehlb小柱，滤出液过0.22μm滤膜后供液相色谱串联质谱仪(lc-ms/ms)检测。液相色谱串联质谱仪的检测条件，和实施例1相同。实施例12、一种动物油脂中喹诺酮药物残留的测定方法本实施例主要描述了一种动物油脂中喹诺酮药物残留的测定方法，与实施例10的不同之处在于：所述的超声时间为15min。实施例13、一种动物油脂中喹诺酮药物残留的测定方法本实施例主要描述了一种动物油脂中喹诺酮药物残留的测定方法，与实施例10的不同之处在于：所述的鸡油替换为鱼油。实施例14、一种动物油脂中喹诺酮药物残留的测定方法本实施例主要描述了一种动物油脂中喹诺酮药物残留的测定方法，与实施例13的不同之处在于：所述的鸡油替换为鱼油，所述的75％乙腈水替换为75％乙腈水和1％酸化乙腈以3：2的体积进行混合。经发明人检测发现，该技术方案可提高15％的样品提取效率，使样品的检测结果回收率能提高15％。在本实施例中，所述的鱼油包括但不限于深海鱼油。进一步地，发明人分别采用实施例5至14对应的实验方法进行表4至13对应的性能试验，都能得到如表4至13相近的实验结果。这表明，本发明采用的动物油脂中喹诺酮药物残留的测定方法是一种切实可行的检测方法。实施例15、一种动物油脂中喹诺酮药物残留的测定方法本实施例主要描述了一种动物油脂中喹诺酮药物残留的测定方法，与实施例1的不同之处在于：所述的正己烷替换为丙酮、甲醇和正己烷的混合物；在所述的丙酮、甲醇和正己烷的混合物中，丙酮、甲醇和正己烷的体积比为50：2～5：45～48，在该比值范围内，可提高12％的回收率，大幅度地提高检测的准确性，使样品的检测结果回收率在90％以上。实施例16-26:一种动物油脂中喹诺酮药物残留的测定方法实施例16-26只是分别将实施例2、实施例5-14中所述的正己烷替换为丙酮、甲醇和正己烷的混合物形成新的实施例；在所述的丙酮、甲醇和正己烷的混合物中，丙酮、甲醇和正己烷的体积比为50：2～5：45～48。实施例27:一种动物油脂中喹诺酮药物残留的测定方法采用实施例16-26所述的测定方法进行方法性能的评判，实验结果显示，实施例16-26所述的测定方法的性能评判方面的实验数据和实施例15的实验结果相近，在此不再列出。以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。当前第1页1 2 3 
技术特征：

1.一种动物油脂中喹诺酮药物残留的测定方法，其特征在于，包括：

步骤一、称取0.9～2g的动物油脂，加入5～10ml正己烷涡旋溶解，得到预溶液i；

步骤二、在步骤一得到的预溶液i中，加入9～20ml的含乙腈的溶液涡旋5～10min，得到预溶液ii；

步骤三、将所述的预溶液ii进行超声溶解10～40min，得到待检测溶液i，然后进行检测前的净化预处理，得到待检测溶液ii；

步骤四、将所述的待检测溶液ii经过0.22μm滤膜后，进行液相色谱串联质谱仪检测。

2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述的含乙腈的溶液为含75～85％乙腈的水溶液。

3.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述的含乙腈的溶液为酸化乙腈溶液；所述的酸化乙腈溶液包括甲酸和乙腈，甲酸和乙腈的体积比为1：99。

4.根据权利要求2所述的测定方法，其特征在于，所述的检测前的净化预处理包括：将所述的待检测溶液i进行3500～4500r/min离心5～10min，然后取下层乙腈水层上样primehlb小柱，得到滤出液(待检测溶液ii)。

5.根据权利要求3所述的测定方法，其特征在于，步骤三还包括：将所述的预溶液ii进行超声溶解的时间为30～40min，得到待检测溶液i。

6.根据权利要求5所述的测定方法，其特征在于，所述的检测前的净化预处理包括：吸取所述的待检测溶液i的乙腈层于150ml旋转瓶中，再向残渣中加入10ml的1％酸化乙腈，重复提取一次，合并乙腈层，于40℃旋转蒸发仪蒸发至液体含量不高于1％，加入5ml的15％甲醇水溶液溶解残渣，得到待净化液；将hlb固相萃取小柱预先用5ml甲醇、5ml水活化，处理完毕后，加入所述的待净化液，再用5ml水淋洗小柱，最后用5ml甲醇洗脱小柱，收集洗脱液，氮吹至液体含量不高于1％，用15％甲醇水定容至0.5ml，得到待检测溶液ii。

7.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述的液相色谱串联质谱仪的检测参数具体如下：

1)色谱柱：beh，c18，2.1*50mm，1.7um；

2)流动相：a甲醇，b0.1％甲酸 2mmol/l甲酸铵水；

3)流速：0.35ml/min；

4)进样量：5ul；

5)色谱柱温度：30℃；

6)梯度洗脱程序如表1所示；

表1.梯度洗脱程序

时间(min)a(％)b(％)010900.510901.530703.090104.090104.0110905.01090

7)离子源：电喷雾离子源；

8)扫描模式：mrm；

9)气帘气：25psi；

10)碰撞气：medium；

11)离子化电压：5500v；

12)离子源温度：600℃；

13)喷雾气：60psi；

14)辅助加热气：50psi；

15)母离子，子离子及去簇电压,碰撞能量如表2所述；

表2.液相色谱串联质谱测定喹诺酮类兽药的技术采纳数表

8.根据权利要求1至7任一权相所述的测定方法在生物、食品或医疗领域上的应用。

技术总结
本发明提供一种动物油脂中喹诺酮药物残留的测定方法，包括以下步骤：步骤一、称取0.9～2g的动物油脂，加入5～10mL正己烷涡旋溶解，得到预溶液I；步骤二、在步骤一得到的预溶液I中，加入9～20mL的含乙腈的溶液涡旋5～10min，得到预溶液II；步骤三、将所述的预溶液II进行超声溶解10～40min，得到待检测溶液I，然后进行检测前的净化预处理，得到待检测溶液II；步骤四、将所述的待检测溶液II经过0.22μm滤膜后，进行液相色谱串联质谱仪检测。

技术研发人员：董昕;戴辉;王佳杰;闫蕊;王佳佳
受保护的技术使用者：品测(上海)检测科技有限公司
技术研发日：2020.03.02
技术公布日：2020.06.09