本发明属于香气成分检测技术领域，具体涉及一种利用气相色谱-质谱同时定量测定铁观音茶叶杀青物中41种主要香气成分的含量的方法。
背景技术：
铁观音属于中国传统名茶中青茶的代表之一，原产于福建泉州市安溪县，由于其具有独特的清雅香韵而广受消费者的喜爱。铁观音茶叶加工工艺由采青、晒青、做青、杀青、包揉、烘干等工序组成，经过各个工序产生的香气物质组合，最终形成铁观音独特的产品风格。与铁观音茶叶相比，铁观音茶叶杀青物茶香、花香、清甜香更为突出，作为一种天然物质应用于食品、日化、烟用香精等领域具有非常广阔的前景(张峰,陈小明,范坚强,等.铁观音杀青物香料的开发及其在卷烟中的应用[j].香精香料化妆品,2016,12(6):16-20.)。
茶叶中已探明的成分非常丰富，包括醛、酮、酯、烷烃、多酚以及生物碱类等化合物，由于茶叶中香味物质含量较低且多属于易挥发性物质，在温度较高时容易发生聚合氧化等化学反应从而产生不良气味，对茶叶及茶叶制品的制备以及其香味物质含量的精确检测带来一定困扰(嵇伟彬,刘盼盼,许勇泉,等.几种乌龙茶香气成分比较研究[j].茶叶科学,2016,36(5):523-530；周玲.乌龙茶香气挥发性成分及其感官性质分析[d].重庆:西南大学,2006.)。
因此，开发一种同时定量测定铁观音杀青物中的主要香气成分的含量的精确、灵敏的新方法是十分必要的。
技术实现要素：
发明人经过一系列对于铁观音茶叶杀青物进行提取、分离和鉴定茶香特征成分的研究，初步鉴定了铁观音茶叶杀青物中存在41种主要香气成分，它们是正己醛、叶醇、2(5h)-呋喃酮、γ-丁内酯、苯甲醛、月桂烯、正己酸乙酯、α-水芹烯、α-萜品烯、对伞花烃、柠檬烯、苯甲醇、2-甲基丁酸丁酯、苯乙醛、(z)-丙酸-3-己烯酯、芳樟醇、苯乙醇、茶香酮、1-苯基-1,2-丙二酮、苯甲酸乙酯、4-萜烯醇、对甲基苯异丙醇、水杨酸甲酯、α-松油醇、癸醛、橙花醇、香叶醇、乙酸苯乙酯、柠檬醛、2-苯基巴豆醛、吲哚、γ-壬内酯、茉莉酮、丁酸苯乙酯、γ-癸内酯、可卡醛、橙花叔醇、二氢猕猴桃内酯、茉莉酸甲酯、氧化芳樟醇-吡喃型、氧化芳樟醇-呋喃型。
本发明提供了一种同时定量测定铁观音茶叶杀青物中41种香气成分的含量的方法，包括以下步骤：
(1)对茶叶杀青物水提物进行冷冻处理，将完全冷冻的样品进行干燥处理，准确称量冻干后的茶叶纯露样品，将样品转移到容量瓶中，加入内标储备液和丙酮溶液，震荡均匀，配制成含内标的样品溶液；
(2)采用气相色谱-质谱联用仪对步骤(1)的样品溶液进行检测，通过内标定量法检测出41种香气成分含量，其中，
所述41种香气成分分别为正己醛、叶醇、2(5h)-呋喃酮、γ-丁内酯、苯甲醛、月桂烯、正己酸乙酯、α-水芹烯、α-萜品烯、对伞花烃、柠檬烯、苯甲醇、2-甲基丁酸丁酯、苯乙醛、(z)-丙酸-3-己烯酯、芳樟醇、苯乙醇、茶香酮、1-苯基-1,2-丙二酮、苯甲酸乙酯、4-萜烯醇、对甲基苯异丙醇、水杨酸甲酯、α-松油醇、癸醛、橙花醇、香叶醇、乙酸苯乙酯、柠檬醛、2-苯基巴豆醛、吲哚、γ-壬内酯、茉莉酮、丁酸苯乙酯、γ-癸内酯、可卡醛、橙花叔醇、二氢猕猴桃内酯、茉莉酸甲酯、氧化芳樟醇-吡喃型、氧化芳樟醇-呋喃型；
所述气相色谱-质谱的具体条件为:
气相色谱条件：db-5ms(60m×0.25mm×0.25μm)；载气：he；柱流量：1ml/min；进样口温度：280℃；程序升温：50℃(0min),3℃/min→300℃(1min)；分流模式：不分流；
质谱条件：gc/ms传输线温度：280℃，ei离子源温度：230℃，四级杆温度：150℃；ei电离能量：70ev；扫描模式：选择离子扫描，根据保留时间划分时间段。
在某些实施方案中，所述铁观音茶叶杀青物水提物的量为100～500ml。
在某些实施方案中，所述内标为丙酸苏合香酯，内标储备液浓度为10mg/ml，内标储备液加入量为10～50ul。
在某些实施方案中，所述丙酮加入量为10～50ml。
在某些实施方案中，所述震荡时间为5～10min。
术语解释：
本发明中，如无特别说明，“杀青”是指采用一定温度，使鲜叶中的酶失去活性，或是将酶钝化的过程。杀青的方式包括：滚筒杀青、锅炒杀青、热风杀青、蒸汽杀青、微波杀青或蒸汽-热风混合式杀青等。“杀青物”是指经过杀青处理后的物质。
本发明中，术语“气相色谱”或“gc”是指将样品混合物蒸发并注射进通过包含固定相(由液体或颗粒固体组成)的柱运动的载气(如氮气或氦)流、并根据化合物对固定相的亲合力分离成其各组成化合物的一种色谱分离方法。
本发明中，术语“质谱法”或“ms”指通过化合物的质量鉴定化合物的分析技术。质谱的基本原理是使试样中各组分在离子源中发生电离，生成不同荷质比的带电荷的离子，经加速电场的作用，形成离子束，进入质量分析器。在质量分析器中，再利用电场和磁场使发生相反的速度色散，将它们分别聚焦而得到质谱图，从而确定其质量。ms技术通常包括(1)电离化合物以形成带电荷的化合物；和(2)检测带电荷的化合物的分子量和计算质荷比。化合物可被电离和通过任何适合的方法检测。“质谱仪”通常包括电离源和离子检测器。
有益效果：
本发明可同时定量测定铁观音茶叶杀青物中41种香气成分的含量，具有精确度高、灵敏度高、普适性好、选择性好的优点，特别适用于茶叶及茶叶制品水提物中香气成分的含量。
具体实施方式
下面通过实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的限定。
内标定量法
在内标定量法检测中，混合标准溶液中含有41中香气成分(其中5种有异构体)及1种内标标准物质，溶剂为丙酮；所述41种香气成分(其中5种有异构体)及内标的名称、定量离子和定性离子信息见下面表1。
表1.41种香气成分及内标名称、定量离子和定性离子信息
所有标准工作溶液中内标丙酸苏合香酯的浓度为10μg/ml，为了建立工作曲线，标准溶液中各标准物质的浓度见下面表2所示：
表2.工作标准溶液浓度表
铁观音茶叶杀青物中41种香气成分的工作曲线及相关系数如表3所示：
表3.铁观音茶叶杀青物中41种香气成分的工作曲线及相关系数
实施例1
本实施例同时定量测定铁观音茶叶杀青物中41种香气成分的含量，包括以下步骤：
(1)取100ml第一批次茶叶杀青物水提物于表面皿中，冷冻处理。将完全冷冻的样品放入冷冻干燥机中进行干燥处理。准确称量冻干后的茶叶纯露样品，将样品转移到容量瓶中，加入内标储备液10ul和丙酮溶液10ml，震荡5min，配制成含内标的样品溶液。
(2)采用gc/ms对步骤(1)所得样品溶液进行检测：
气相色谱条件为：db-5ms(60m×0.25mm×0.25μm)；载气：he；柱流量：1ml/min；进样口温度：280℃；程序升温：50℃(0min),3℃/min→300℃(1min)；分流模式：不分流；
质谱条件为：gc/ms传输线温度：280℃，ei离子源温度：230℃，四级杆温度：150℃；ei电离能量：70ev；扫描模式：选择离子扫描，根据保留时间划分时间段。
采用上述测试条件，对于本实施例的铁观音茶叶杀青物水提物的检测结果如下面表4所示。
实施例2
本实施例同时定量测定铁观音茶叶杀青物中41种香气成分的含量，包括以下步骤：
(1)取200ml第一批次茶叶杀青物水提物于表面皿中，冷冻处理。将完全冷冻的样品放入冷冻干燥机中进行干燥处理。准确称量冻干后的茶叶纯露样品，将样品转移到容量瓶中，加入内标储备液20ul和丙酮溶液20ml，震荡5min，配制成含内标的样品溶液。
(2)采用gc/ms对步骤(1)所得样品溶液进行检测：
气相色谱条件为：db-5ms(60m×0.25mm×0.25μm)；载气：he；柱流量：1ml/min；进样口温度：280℃；程序升温：50℃(0min),3℃/min→300℃(1min)；分流模式：不分流；
质谱条件为：gc/ms传输线温度：280℃，ei离子源温度：230℃，四级杆温度：150℃；ei电离能量：70ev；扫描模式：选择离子扫描，根据保留时间划分时间段。
采用上述测试条件，对于本实施例的铁观音茶叶杀青物中41种香气成分的检测结果如下面表4所示。
实施例3
本实施例同时定量测定铁观音茶叶杀青物中41种香气成分的含量，包括以下步骤：
(1)取500ml第一批次茶叶杀青物水提物于表面皿中，冷冻处理。将完全冷冻的样品放入冷冻干燥机中进行干燥处理。准确称量冻干后的茶叶纯露样品，将样品转移到容量瓶中，加入内标储备液50ul和丙酮溶液50ml，震荡10min，配制成含内标的样品溶液。
(2)采用gc/ms对步骤(1)所得样品溶液进行检测：
气相色谱条件为：db-5ms(60m×0.25mm×0.25μm)；载气：he；柱流量：1ml/min；进样口温度：280℃；程序升温：50℃(0min),3℃/min→300℃(1min)；分流模式：不分流；
质谱条件为：gc/ms传输线温度：280℃，ei离子源温度：230℃，四级杆温度：150℃；ei电离能量：70ev；扫描模式：选择离子扫描，根据保留时间划分时间段。
采用上述测试条件，对于本实施例的铁观音茶叶杀青物中41种香气成分的检测结果如下面表4所示。
表4.铁观音茶叶杀青物中41种香气成分的定量测定结果
对比例1
在气相色谱分离的操作条件中，色谱柱为db-wax(60m×0.25mm×0.25μm)，其余与实施例1相同。
结果发现：
定性检测出的成分的种类与实施例1的区别在于：采用外标法定性，定性结果没有差异
定量结果与实施例1的区别在于：db-wax为极性柱，部分成分的分离效果不好，存在较多的重叠峰，导致定量结果不准。
对比例2
在气相色谱的操作条件中，升温程序为：50℃(0min),5℃/min→300℃(1min)；。其余与实施例1相同。
结果发现：
定性检测出的成分的种类与实施例1的区别在于：无区别
定量结果与实施例1的区别在于：部分成分的分离效果不好，存在较多的重叠峰，导致定量结果不准。
对比例3
在气相色谱的操作条件中，分流模式为：1:10。其余与实施例1相同。
结果发现：
定性检测出的成分的种类与实施例1的区别在于：含量较低的物质，如α-水芹烯、α-萜品烯、对伞花烃、柠檬烯等，色谱图上不出峰，无法定性
定量结果与实施例1的区别在于：色谱图上不出峰的成分，无法进行定量分析。
对比例4
质谱的操作条件中，扫描模式为全扫描。其余与实施例1相同。
结果发现：
定性检测出的成分的种类与实施例1的区别在于：全扫描模式，干扰离子严重，导致谱图解析时匹配度降低。
定量结果与实施例1的区别在于：由于存在干扰离子，部分物质分离效果不好，存在肩峰、拖尾峰，定量不准。
最后应当说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制；尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者对部分技术特征进行等同替换；而不脱离本发明技术方案的精神，其均应涵盖在本发明请求保护的技术方案范围当中。
1.一种同时定量测定铁观音茶叶杀青物中41种香气成分的含量的方法，包括以下步骤：
(1)对茶叶杀青物水提物进行冷冻处理，将完全冷冻的样品进行干燥处理，准确称量冻干后的茶叶纯露样品，将样品转移到容量瓶中，加入内标储备液和丙酮溶液，震荡均匀，配制成含内标的样品溶液；
(2)采用气相色谱-质谱联用仪对步骤(1)的样品溶液进行检测，通过内标定量法检测出41种香气成分含量，其中，
所述41种香气成分分别为正己醛、叶醇、2(5h)-呋喃酮、γ-丁内酯、苯甲醛、月桂烯、正己酸乙酯、α-水芹烯、α-萜品烯、对伞花烃、柠檬烯、苯甲醇、2-甲基丁酸丁酯、苯乙醛、(z)-丙酸-3-己烯酯、芳樟醇、苯乙醇、茶香酮、1-苯基-1,2-丙二酮、苯甲酸乙酯、4-萜烯醇、对甲基苯异丙醇、水杨酸甲酯、α-松油醇、癸醛、橙花醇、香叶醇、乙酸苯乙酯、柠檬醛、2-苯基巴豆醛、吲哚、γ-壬内酯、茉莉酮、丁酸苯乙酯、γ-癸内酯、可卡醛、橙花叔醇、二氢猕猴桃内酯、茉莉酸甲酯、氧化芳樟醇-吡喃型、氧化芳樟醇-呋喃型；
所述气相色谱-质谱的具体条件为:
气相色谱条件：db-5ms(60m×0.25mm×0.25μm)；载气：he；柱流量：1ml/min；进样口温度：280℃；程序升温：50℃(0min),3℃/min→300℃(1min)；分流模式：不分流；
质谱条件：gc/ms传输线温度：280℃，ei离子源温度：230℃，四级杆温度：150℃；ei电离能量：70ev；扫描模式：选择离子扫描，根据保留时间划分时间段。
2.根据权利要求1所述的方法，所述铁观音茶叶杀青物水提物的量为100～500ml。
3.根据权利要求1所述的方法，所述内标为丙酸苏合香酯，内标储备液浓度为10mg/ml，内标储备液加入量为10～50ul。
4.根据权利要求1所述的方法，所述丙酮加入量为10～50ml。
5.根据权利要求1所述的方法，所述震荡时间为5～10min。
技术总结