本发明属于医药领域，涉及中药材活性成分的检测技术，具体涉及天麻及其提取物和含天麻制剂中八种活性成分的快速定性以及定量方法。
背景技术：
2015版的《中国药典》规定，天麻为兰科植物天麻(gastrodiaelatabi.)的干燥块茎【参见：中国药典[s].一部.2015】。在我国，主要分布在四川、云南、贵州、陕西等地，黑龙江、吉林也有少量分布。目前对于天麻中活性成分的研究表明天麻具有以下药理作用，镇静【参见：zoun,jian-taolv,xuery,etal.effectsofgastrodinonsedationandhypnosisofmice[j].lishizhenmedicine&materiamedicaresearch,2011,22(4):807-809.caohz,chimh,qianyr.effectsofgastrodiaelataontheexpressionthanddbhmrnainhypothalamusandadrenalglandofrats[j].medicaljournalofchinesepeopleshealth,2012.】、抗惊厥【参见：hajh,leedu,leejt,etal.4-hydroxybenzaldehydefromgastrodiaelatab1.isactiveintheantioxidationandgabaergicneuromodulationoftheratbrain.[j].journalofethnopharmacology,2000,73(1):329-333.】、抗焦虑和抗抑郁【参见：jungjw,yoonbh,ohhr,etal.anxiolytic-likeeffectsofgastrodiaelataanditsphenolicconstituentsinmice[j].biological&pharmaceuticalbulletin,2006,29(2):261.zhoubh,lixj,lium,etal.antidepressant-likeactivityofthegastrodiaelataethanolextractinmice.[j].fitoterapia,2006,77(7):592-594】、神经保护【参见：kimhj,leesr,moonkd.etherfractionofmethanolextractsofgastrodiaelata,medicinalherbprotectsagainstneuronalcelldamageaftertransientglobalischemiaingerbils[j].phytotherapyresearchptr,2003,17(8):909.leegh,kimhr,hansy,etal.gastrodiaelatablumeanditspurecompoundsprotectbv-2microglial-derivedcelllinesagainstβ-amyloid:theinvolvementofgrp78andchop[j].biologicalresearch,2012,45(4):403.leeyk,woomh,kimch,etal.twonewbenzofuransfromgastrodiaelataandtheirdnatopoisomerasesiandiiinhibitoryactivities.[j].plantamedica,2007,73(12):1287-1291.】等作用。在疾病治疗的过程中，并不是某一种成分起作用，而是多种活性成分协同作用于疾病，从而达到治疗作用。此外，产地不同、批次不同导致中药成分含量不一的情况也很普遍，药典中仅用一种或两种指标成分作为质量标准并不能真正反映该药材的质量。另外，在许多经典名方、汤剂和复方制剂中，天麻也是常见的药材之一【参见：熊兴江,王阶.论半夏白术天麻汤在高血压病中的运用[j].中华中医药杂志,2012(11):2862-2865.kailanhe,zhangp,liux.tianmainjectioninthetreatmentofvertebralbasilararteryinsufficiencyrandomizedparallelgroupstudy[j].journalofpracticaltraditionalchineseinternalmedicine,2014.】。因此，同时测定天麻中的多种活性成分可对于该药材的质量控制和应用提供参考依据，同时也为含有天麻的真伪品和复方制剂提供鉴别参考依据。目前，国内对于天麻成分测定主要采用hplc法对于天麻素进行检测【参见：jiaoh.determinationofgastrodincontentsinwildandcultivatedgastrodiaelatafromdifferentregionsofchongqingbyrp-hplc[j].medicinalplant,2012(5).】，该方法具有用时长，有机溶液耗损多等缺点，因此，建立一种可以快速，稳定，环境友好并能适用于不同产地天麻及其提取物或含有天麻的复方制剂的定性定量分析研究的天麻检测方法是本领域的重要课题。目前缺乏完善且高效的天麻药材质量评价体系，难以达到对天麻质量的有效控制。
技术实现要素：
本发明的任务之一是提供一种快速检测天麻及天麻提取物和含天麻制剂中多种成分的方法，该方法能快速同时测定天麻及其提取物和含天麻制剂中多种活性成分的含量，以及检测制剂中的天麻成分。
实现本发明的技术方案是：
本发明提供的快速检测天麻及天麻提取物和含天麻制剂中多种成分的方法，包括以下步骤：
步骤一：制备待测样品溶液：取天麻药材或天麻提取物或含天麻制剂的粉末，加入乙醇，超声提取，过滤得到样品溶液；
步骤二：超高效液相色谱仪检测(uplc)：取步骤一得到的样品溶液1μl进样分析，记录色谱图，测得待检测成分的峰面积，所述的待检测成分是根据混合标准品对照图谱的八种成分的保留时间确定为天麻素、对羟基苯甲醇(天麻苷元)、巴利森苷e、巴利森苷b、巴利森苷c、巴利森苷a、对羟基苯甲醛、香草醛中的一种或两种以上或全部；
步骤三：将步骤二得到的待测成分的峰面积(y)代入下列与所检测成分相对应的标准方程并计算各对应化合物的浓度(x，μg·ml-1)，即得到所检测的天麻中活性成分的含量：
各式中：y为峰面积；x为各各对应化合物的浓度。
上述步骤一所述的取天麻药材或天麻提取物或含天麻制剂的粉末，加入乙醇，超声提取，过滤得到样品溶液的具体方法是：精密称取已过3号筛的天麻药材或天麻提取物或含天麻制剂的粉末0.2g，用体积分数为70％的乙醇定容至10ml，称重；250w、53khz超声提取60min，用体积分数为70％的乙醇补足至原重，摇匀，用0.22μm的有机滤膜过滤即得到样品溶液。
上述步骤二中高效液相色谱仪的条件为：采用色谱柱lunac18-hst，规格为2.5μm，100×3.0mm；流动相：流动相a为ch3cn，流动相b为h2o和0.05％h3po4，梯度洗脱；洗脱比例0-2min，体积分数为97-90％b；2-5min，体积分数为90-78％b；5-6min，体积分数为78-76％b；6-6.5min，体积分数为76-72％；6.5-10min，体积分数为72-60％b；检测波长：220nm；柱温：35℃；流速0.4ml·min-1；进样量1μl；分析时间10min。
在上述步骤二中，超高效液相色谱仪(uplc)检测分析的物质按照出峰时间排列依次为天麻素、对羟基苯甲醇(天麻苷元)、巴利森苷e、巴利森苷b、巴利森苷c、巴利森苷a、对羟基苯甲醛、香草醛。各成分达到基线分离，线性关系良好。平均加样回收率在99.79％～101.45％之间，rsd在1.10％～1.75％之间。实验结果表明该方法稳定、快速、可靠，可适用于不同产地天麻、及其提取物或含有天麻的复方制剂的定性定量检测。
本发明的另一目的是提供一种天麻药材指纹图谱的建立方法，包括以下步骤：
s1：制备天麻药材供试品溶液：取不同批次和/或不同产地的天麻药材，分别称取mg不同批次和/或的天麻药材供试品置于容器中，向容器中加入体积分数为40％-80％乙醇，优选体积分数为70％的乙醇，定容至vml，满足m:v＝0.2:10-0.4:10，优选m＝0.2，v＝10，然后超声提取、过滤，取滤液即得不同批次的天麻药材供试品溶液；参照峰的溶液为已知质量的天麻素、对羟基苯甲醇(天麻苷元)、对羟基苯甲醛、巴利森苷e、巴利森苷b、巴利森苷c、巴利森苷a和香草醛混合物的乙醇溶液；
s2：分别精密吸取参照峰的溶液和各供试品溶液，注入超高效液相色谱仪，记录色谱图；
s3：将步骤s2中获得的天麻药材指纹图谱导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统；将不同批次天麻药材的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰；用平均值计算法生成天麻药材的对照指纹图谱；计算各共有峰的相对保留时间、相对峰面积。
步骤s1中所述超声提时间为15min以上，优选为60min，进一步优选为用250w、53khz的超声设备超声提取60min。
步骤s1中所述过滤为用0.22μm的有机滤膜过滤。
在步骤s2具体为：分别精密吸取参照峰溶液和各供试品溶液1μl，注入超高效液相色谱仪，记录10分钟的色谱图。其中超高效液相色谱条件为：采用色谱柱lunac18-hst，规格为2.5μm，100×3.0mm；流动相：流动相a为ch3cn，流动相b为h2o和0.05％h3po4，梯度洗脱；洗脱比例0-2min，体积分数为97-90％b；2-5min，体积分数为90-78％b；5-6min，体积分数为78-76％b；6-6.5min，体积分数为76-72％；6.5-10min，体积分数为72-60％b；检测波长：220nm；柱温：30℃-40℃，优选为35℃；流速0.4ml·min-1；进样量1μl；分析时间10min。
本发明的又一个目的是提供了一种天麻药材指纹图谱，图谱如附图5所示，共有8个特征峰，依次对应的有效成分和保留时间如下：
1号峰天麻素：3.9-4.1min
2号峰对羟基苯甲醇：5.2-5.4min；
3号峰巴利森苷e：5.9-6.1min
4号峰巴利森苷b：6.9-7.1min
5号峰巴利森苷c：7.2-7.4min
6号峰巴利森苷a：7.9-8.1min
7号峰对羟基苯甲醛：8.0-8.2min
8号峰香草醛：8.8-9.0min。
本发明提供了一种建立指纹图谱的方法，提供了天麻的指纹图谱，通过指纹图谱中共有峰的有无，可对天麻药材的质量进行评价，保证药材质量的稳定性及临床用药的有效性与安全性。本发明同时提供了一个快速、稳定、可靠的检测天麻药材及其真伪品以及复方制剂的方法。该方法可在10min内对于天麻药材、及其提取物或含天麻制剂中的8种活性成分进行定性定量分析。通过方法学验证，该方法稳定性、重复性、精密度良好，可为天麻药材、天麻提取物和含天麻的复方制剂中8种成分的定性定量检测提供参考依据，可快速检测复方制剂中是否加入天麻。
附图说明
图1：为标准品色谱图，其中1-天麻素，2-对羟基苯甲醇，3-巴利森苷e，4-巴利森苷b，5-巴利森苷c，6-巴利森苷a，7-对羟基苯甲醛，8-香草醛。
图2：为g6a天麻药材色谱图，其中1-天麻素，2-对羟基苯甲醇，3-巴利森苷e，4-巴利森苷b，5-巴利森苷c，6-巴利森苷a，7-对羟基苯甲醛，8-香草醛。
图3：为自制天麻提取物色谱图，其中1-天麻素，2-对羟基苯甲醇，3-巴利森苷e，4-巴利森苷b，5-巴利森苷c，6-巴利森苷a，7-对羟基苯甲醛，8-香草醛。
图4：为含天麻头痛片色谱图，其中1-天麻素，2-对羟基苯甲醇，3-巴利森苷e，4-巴利森苷b，5-巴利森苷c，6-巴利森苷a，7-对羟基苯甲醛，8-香草醛。
图5：本发明所提供的天麻药材指纹图谱，有1-8个峰，其中1-天麻素，2-对羟基苯甲醇，3-巴利森苷e，4-巴利森苷b，5-巴利森苷c，6-巴利森苷a，7-对羟基苯甲醛，8-香草醛。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
实施例1
1材料
1.1药材来源
从不同的产地、采购地购买的天麻药材经华中科技大学同济医学院药学院尹春萍副教授鉴定为兰科植物天麻(gastrodiaelatabi.)的干燥块茎。将不同产地、采购地和批号的天麻由收集时间先后顺序编号，ab代表同一厂家不同批号的药材，具体如表1-1所示。另实验室乙醇回流大孔树脂纯化自制提取物一批，以及市场上购买的一批天麻复方制剂天麻头痛片。
表1-1天麻药材来源
tab.1-1theherbssourceofgastrodiaelatabi.
1.2主要试验仪器
1.3试验试剂
2实验方法与结果
2.1分析方法的建立
为了达到分析要求，本实验从检测波长、色谱柱、流动相、柱温等条件进行了分析方法的优化，最终建立了以下分析方法：
采用色谱柱lunac18-hst(2.5μm，100×3.0mm)；流动相：流动相a(ch3cn)-流动相b(h2o 0.05％h3po4)，梯度洗脱；洗脱比例0-2min，97-90％b；2-5min，90-78％b；5-6min，78-76％b；6-6.5min，76-72％；6.5-10min，72-60％b；检测波长：220nm；柱温35℃；流速0.4ml·min-1；进样量1μl；分析时间10min。
分析的物质按照出峰时间排列依次为天麻素、对羟基苯甲醇(天麻苷元)、巴利森苷e、巴利森苷b、巴利森苷c、巴利森苷a、对羟基苯甲醛、香草醛。具体洗脱梯度如表1-2。
表1-2梯度洗脱程序
tab.1-2thegradientelutionprogram
2.2样品前处理
选取提取溶剂，超声时间和药材量三个方面进行考察。在选择提取溶剂时，考察了水、体积分数为40％、50％、60％、70％、80％的乙醇作为提取溶剂溶剂时的提取效果，最终选择70％乙醇作为提取溶剂。在选择超声时间时，考察了药材在超声时间为15min、30min、45min、60min时的提取效果。结果表明，超声时间越长药材的提取效果越好，当超声时间为60min时，天麻各类成分达到峰值，考虑到时间效益关系，故优选60min作为天麻前处理的超声时间。
天麻超声时间的选择
在选择制备样品溶液的药材量时，考查了在称取0.2g、0.3g、0.4g不同重量的药材时的对药材图谱以及峰面积的影响效果。药材量在0.2g时，各目标成分峰面积适宜，杂志峰干扰较少，峰面积较小或无；药材量在0.3g、0.4g时，虽然目标成分峰面积有所增加，但是杂质峰较多，干扰目标成分色谱图。故优选0.2g作为供试溶液药材制备量。超高效液相色谱中柱温的确定：依照范氏方程，柱温会在一定程度上影响柱效率、分离度及色谱柱的稳定性等。本实验中，本实验中测试了30℃、35℃、40℃时的分离情况如图所示。30℃时各成分色谱峰相比于35度较为紧凑，40℃时各成分保留时间整体后移，考虑到色谱柱的使用寿命，最终将柱温优选为35℃。
2.3溶液的制备
对照品储备溶液的制备：分别称取天麻素2.71mg、对羟基苯甲醇(天麻苷元)1.11mg、对羟基苯甲醛1.23mg、巴丽森苷e2.2mg、巴利森苷b2.28mg、巴利森苷c1.49mg、巴利森苷a2.94mg、香草醛1.08mg。于10ml容量瓶中；加入10ml的70％乙醇，超声溶解至澄清，用0.22μm的有机滤膜过滤即得。
药材供试溶液的制备：精密称取已过3号筛的编号为g1的天麻药粉末材0.2g于10ml容量瓶中，加入70％乙醇，称重；超声提取60min，补足至原重，摇匀即得。
2.4方法验证
本实验将按照ich分析验证的程序对该方法进行验证。
2.4.1溶液的稳定性
将供试液用0.22μm的有机滤膜过滤，按照“2.1”项下的色谱条件，进样1μl分析，即为0h峰面积。室温放置1、2、4、8、12、24h时分别取1μl进样，各成分天麻素、对羟基苯甲醇、巴丽森苷e、巴利森苷b、巴利森苷c、巴利森苷a、对羟基苯甲醛、香草醛峰面积的rsd分别为1.1％、1.3％、1.3％、0.88％、0.87％、1.2％、1.7％、1.8％，均小于2.0％。说明样品溶液在室温下放置24h是稳定的。
2.4.2专属性
取1μl的空白溶剂(体积分数为70％乙醇溶液)、对照溶液和供试液依次过滤进样，平行3次，记录色谱图。详见图1，图2，说明溶剂对于测定成分未造成干扰。
2.4.3线性、定量限和检测限
将对照品储备液稀释2、5、10、25、50、100、250、625倍，用0.22μm的有机滤膜过滤，按照“2.1”项下的色谱条件，分别取1μl进样，记录色谱图。以峰面积对化合物浓度(μg·ml-1)进行线性回归，得回归方程，实验结果见表1-8。结果表明，在试验确定的线性范围内，8种目标成分的线性关系良好。8种成分的检测限、定量限的信噪比(s/n)结果分别在3:1和10:1以上。
2.4.4精密度
连续3天，按“2.3”项下方法制备供试液，平行3份。分别取1μl进样，记录色谱图和峰面积，计算日内和日间精密度。
表1-10日内和日间精密度
tab.1-10theresultsoftheintra-andinter-dayprecision
2.4.5重复性实验
精密称取已过60目筛编号为g1的天麻药材粉末0.2g，按照“2.3”项下方法制备供试液，平行6份，再按照“2.1”项下的色谱条件，分别取1μl进样分析，记录色谱图和峰面积。计算得各目标成分峰面积的rsd值均小于2.0％，表明所建立的方法重复性良好。
2.4.6加样回收率
精密称取已过60目筛编号为g1的天麻药材粉末0.1g，共9份，3份为1组。按“2.3”项下制备供试液。每组分别精密加入相当于已知对照品量80％、100％、120％的单一对照品溶液，每一质量浓度取3份，用0.22μm微孔滤膜滤过，得到天麻样品溶液。按照“2.1”项下的色谱条件，进样1μl分析，记录色谱图，计算各成分的平均回收率。(注：加样回收率＝(检测量–样品中含量)/加入对照品量)*100％。计算各目标成分的加样回收率。如表1-11、表1-12所示，天麻平均加样回收率在99.79％～101.45％之间，rsd在1.10％～1.75％之间。实验证明，该方法回收率良好。(注：回收率＝(检测量-药液中含量)/加入对照品量*100％)
表1-12天麻加样回收率
tab.1-12therecoveryofgastrodiaelatabi
2.5样品含量测定
取21批产地不同的已过筛天麻药材粉末和四批产地不同已过筛的小天麻粉末以及自制提取物和天麻制剂，分别按2.3项下制备方法制备，平行3份。过滤后分别取1μl进样，记录色谱图见图2、图3、图4。25批不同产地的天麻和小天麻的测定结果如下表。结果表明，不同产地、不同批次的天麻含量差异较大。总的来说，云南产地的天麻各成分含量较高。
表1-14不同地区天麻各目标成分含量(n＝25)
tab.1-14thecontentsofgastrodiaelatabifromdifferenthabitats(n＝25)
注：“-”表示检测时低于定量限。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
1.一种天麻药材uplc指纹图谱的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：
s1：制备天麻药材供试品溶液：取不同批次和/或不同产地的天麻药材，分别称取mg不同批次和/或的天麻药材供试品置于容器中，向所述容器中加入体积分数为40％-80％乙醇，定容至vml，满足m:v＝0.2:10-0.4:10，然后超声提取、过滤，取滤液即得不同批次的天麻药材供试品溶液；参照峰的溶液为已知质量的天麻素、对羟基苯甲醇、对羟基苯甲醛、巴利森苷e、巴利森苷b、巴利森苷c、巴利森苷a和香草醛混合物的乙醇溶液；
s2：分别精密吸取参照峰的溶液和各供试品溶液，注入超高效液相色谱仪，记录色谱图；
s3：将步骤s2中获得的天麻药材指纹图谱导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统；将不同批次天麻药材的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰；用平均值计算法生成天麻药材的对照指纹图谱；计算各共有峰的相对保留时间、相对峰面积。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，s1中所加入的乙醇为体积分数为70％的乙醇。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，s1中所述m＝0.2，v＝10。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述超声提时间为15min以上，优选为60min，进一步优选为用250w、53khz的超声设备超声提取60min。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述超声提时间为60min。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述超声为用250w、53khz的超声设备进行超声。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述过滤为用0.22μm的有机滤膜过滤。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤s2为：分别精密吸取参照峰溶液和各供试品溶液1μl，注入超高效液相色谱仪，记录10分钟的色谱图。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤s2中天麻药材指纹图谱的超高效液相色谱条件为：采用色谱柱lunac18-hst，规格为2.5μm，100×3.0mm；流动相：流动相a为ch3cn，流动相b为h2o和体积分数为0.05％的h3po4，梯度洗脱；洗脱比例：0-2min，体积分数为97-90％b；2-5min，体积分数为90-78％b；5-6min，体积分数为78-76％b；6-6.5min，体积分数为76-72％；6.5-10min，体积分数为72-60％b；检测波长：220nm；柱温：30℃-40℃，优选为35℃；流速0.4ml·min-1；进样量1μl；分析时间10min。
10.一种天麻药材uplc指纹图谱，其特征在于，共有8个特征峰，依次对应的有效成分和保留时间如下：
1号峰天麻素：3.9-4.1min
2号峰对羟基苯甲醇：5.2-5.4min；
3号峰巴利森苷e：5.9-6.1min
4号峰巴利森苷b：6.9-7.1min
5号峰巴利森苷c：7.2-7.4min
6号峰巴利森苷a：7.9-8.1min
7号峰对羟基苯甲醛：8.0-8.2min
8号峰香草醛：8.8-9.0min。
技术总结