本发明属于药物检测领域，具体涉及检测血液中5种精神药物和主要代谢产物的方法及试剂盒。
背景技术：
：精神疾病多属慢性病，目前精神疾病的治疗仍以药物治疗为主，多数患者需要长期甚至终身服药。如何选好、用好精神药物，达到疗效最好，不良反应最少目的，是精神疾病药物治疗所面临的一个重要问题。因此对精神药物进行治疗药物监测是调整用药剂量，优化治疗方案，实现精准治疗的重要手段。本发明提供一种能准确、便捷、快速测定血液样品中喹硫平、氯氮平、文拉法辛、度洛西汀、米氮平及其主要代谢产物的方法及试剂盒，且这五种药物是目前临床应用较为广泛的药物，且代谢物与疗效或副作用有关，对五种药物的同时检测可以满足临床工作对精神药物进行治疗药物监测的实际需求。现有技术中也存在基于ls-ms/ms的检测精神药物方法的方法，例如：中国专利申请(申请号201910058868)公开了一种“高效液质联用同时测定35种精神药物的方法及试剂盒”，其提供了一种利用高效液相色谱串联质谱方法同时测定35种精神药物，并采用外标方法。该方法的缺陷包括：1)其中35种药物并非都是临床常用药物，而且精神疾病患者一般使用1种药物治疗或2种药物联合治疗，35种药物同时检测造成不必要的浪费，2)该法利用外标法进行药物的检测，外标法不可以消除检测过程中的基质效应，不利于精准定量，目前公开的文献和专利大部分已经用内标法代替外标法。中国专利(专利号：201610730994.1，公开号cn106168610b)公开了一种：“高效液相质谱联用测定血浆中氯氮平浓度的方法”，其提供了一种利用高效液相色谱串联质谱方法，并采用利培酮做内标检测氯氮平精神药物的方法，但是该方法是专门针对特定的精神药物-氯氮平药物的方法，不适用于多种精神药物的同时测量，且其利用利培酮作为内标，并非同位素做内标，无法完全消除基质效应，不利于精准定量。综上所述，现有技术中关于精神药物检测的过程主要缺陷在于：第一，存在基质效应，部分方法仍采用外标法进行药物浓度检测，存在基质效应，不能精准定量，目前大多数lc-ms/ms的方法都采用同位素代替等内标用来校正基质效应等影响，外标法已经被逐渐淘汰。第二.检测药物种类不适用临床，检测药物种类单一或过多，由于精神疾病患者一般使用1种药物治疗或2种药物联合治疗，检测药物种类单一，通量低，不利于开展更多检测项目；检测药物种类过多，造成成本过高，形成资源浪费，都不易于大批量临床检测，因此要结合临床需求，开发合理的方法。第三，线性范围不适宜，现有技术的测量方法中多种药物的线性范围不合理，未经过临床样本的验证，不适合临床检验。第四，灵敏度低下，在同时检测多种药物的过程中，存在多种目标物难以完全色谱分离，共流出等问题，导致灵敏度相对较低，影响检测的准确度。因此，目前临床检验中，需要一种测试结果精准、适用于临床、线性范围合适、灵敏度高的精神药物及其主要代谢产物的检测方法。技术实现要素：本发明提供检测血液中5种精神药物和主要代谢产物的方法，该方法采用高效液相色谱-质谱检测，检测对象为：喹硫平及其主要代谢产物n-脱烷基喹硫平、氯氮平及其主要代谢产物n-去甲基氯氮平、文拉法辛及其主要代谢产物o-去甲基文拉法辛、度洛西汀、米氮平。本发明是通过以下技术方案实现的：一种检测血液中5种精神药物和主要代谢产物的方法，采用高效液相色谱-质谱检测；所述5种精神药物为：喹硫平、氯氮平、文拉法辛、度洛西汀、米氮平；所述主要代谢产物是：所述喹硫平的主要代谢产物：n-脱烷基喹硫平，所述氯氮平的主要代谢产物：n-去甲基氯氮平，所述文拉法辛的主要代谢产物：o-去甲基文拉法辛。在优选的实施方式中，所述方法包括：工作溶液配制步骤，以及高效液相色谱-质谱检测步骤；所述工作溶液包括：待测样品，混合内标工作液，混合标准品工作液，质控工作液。在优选的实施方式中，所述工作溶液配制步骤中，所述待测样品的配制方法包括：将试验样品与混合内标工作液按体积比1：(2-4)，优选为1：3混匀，离心后取上清，得到待测样品；优选地，所述试验样品为被测试对象的血浆或血清。在优选的实施方式中，所述混合内标工作液的配制方法包括：采用稀释液分别将喹硫平-d8、氯氮平-d4、文拉法辛-d6、度洛西汀-d7、米氮平-d3内标标准品稀释配置成浓度均为1μg/ml的五种内标中间工作液；然后利用所述五种内标中间工作液，采用体积比为(0-50)：(50-100)、优选为20：80的甲醇：乙腈混合液配制混合内标工作液；所述混合内标工作液中，所述喹硫平-d8的浓度为10-50ng/ml、氯氮平-d4的浓度为10-50ng/ml、文拉法辛-d6的浓度为10-50ng/ml、度洛西汀-d7的浓度为5-40ng/ml、米氮平-d3的浓度为2-8ng/ml；优选地，所述喹硫平-d8的浓度为30ng/ml、氯氮平-d4的浓度为30ng/ml、文拉法辛-d6的浓度为30ng/ml、度洛西汀-d7的浓度为20ng/ml、米氮平-d3的浓度为5ng/ml；优选地，所述稀释液是甲醇。在优选的实施方式中，所述混合标准品工作液的配制方法包括：用稀释液将喹硫平、n-脱烷基喹硫平、氯氮平、文拉法辛、o-去甲基文拉法辛、度洛西汀、米氮平标准品稀释以配制多种所述混合标准品工作液，每种所述混合标准品工作液中均同时含有喹硫平、n-脱烷基喹硫平、氯氮平、文拉法辛、o-去甲基文拉法辛、度洛西汀、米氮平；多种所述混合标准品工作液优选为八种，从第一种至第八种所述混合标准品工作液中喹硫平、n-脱烷基喹硫平、氯氮平、n-去甲基氯氮平、文拉法辛、o-去甲基文拉法辛、度洛西汀、米氮平的浓度均依次递增；优选地，从第一种至第八种所述混合标准品工作液中，喹硫平的浓度依次为80，160，320，800，1600，4000，8000ng/ml，n-脱烷基喹硫平的浓度依次为40，80，160，400，800，2000，4000ng/ml，氯氮平的浓度为100，200，400，1000，2000，5000，10000ng/ml，n-去甲基氯氮平的浓度为6000，3000，1200,，600，240，120，60ng/ml，文拉法辛的浓度依次为80，160，320，800，1600，4000，8000ng/ml，o-去甲基文拉法辛的浓度依次为80，160，320，800，1600，4000，8000ng/ml，度洛西汀的浓度依次为30，60，120，300，600，1500，3000ng/ml，米氮平的浓度依次为20，40，80，200，400，1000，2000ng/ml；优选地，所述稀释液为50vol％的甲醇水溶液；优选地，在进行所述高效液相色谱-质谱检测之前，将第一种至第八种各个浓度梯度的混合标准品工作液，用阴性血浆或阴性血清稀释为原体积的10倍。在优选的实施方式中，所述质控工作液的配制方法包括：用稀释液将喹硫平、n-脱烷基喹硫平、氯氮平、n-去甲基氯氮平、文拉法辛、o-去甲基文拉法辛、度洛西汀、米氮平标准品稀释以配制低、中、高三种质控工作液，每种所述质控工作液中均同时含有喹硫平、n-脱烷基喹硫平、氯氮平、n-去甲基氯氮平、文拉法辛、o-去甲基文拉法辛、度洛西汀、米氮平；低、中、高三种质控工作液中喹硫平、n-脱烷基喹硫平、氯氮平、n-去甲基氯氮平、文拉法辛、o-去甲基文拉法辛、度洛西汀、米氮平的浓度均依次递增；低、中、高三种所述质控工作液中，所述喹硫平的浓度依次为400，2000，6000ng/ml，n-脱烷基喹硫平的浓度依次为200，1000，3000ng/ml，氯氮平的浓度依次为500，2500，7500ng/ml，n-去甲基氯氮平的浓度依次为300，1500，4500ng/ml，文拉法辛的浓度依次为400，2000，6000ng/ml，o-去甲基文拉法辛的浓度依次为400，2000，6000ng/mlng/ml，度洛西汀的浓度依次为150，750，2250ng/ml，米氮平的浓度依次为100，500，1500ng/ml；所述稀释液为50vol％的甲醇水溶液；优选地，在进行所述高效液相色谱-质谱检测之前，将各个低、中、高三种所述质控工作液用阴性血浆或阴性血清稀释为原体积的10倍。在优选的实施方式中，高效液相色谱-质谱检测步骤中，色谱条件为：色谱柱：phenomenexphenyl-hexyl柱(50×4.6mm，2.6μm)；柱温：50℃；流动相a：以hplc级水为溶剂，所述流动相a中包括：终浓度为0.05mmol/l的甲酸铵，终浓度为体积百分比0.05％的甲酸；流动相b:乙腈；采用梯度洗脱；洗脱条件为：0-2.4min期间，流动相b的比例为15％-95％；2.5-3.4min期间，流动相b的比例为95％；3.5-4.5min期间，流动相b的比例为15％；流速：0.6ml/min；进样体积：1μl。在优选的实施方式中，高效液相色谱-质谱检测步骤中，质谱条件为：离子源：电喷雾离子源；扫描模式：正离子多反应监测；气帘气体压力40psi；喷雾器电压5000v；温度550℃；gas155psi，gas250psi；碰撞气：medium；入口电压10v；碰撞池退出电压10v；优选地，q1为母离子，q3为子离子，所述精神药物和主要代谢产物的q1/q3的值分别优选为：喹硫平：384.3/253.1，n-脱烷基喹硫平：296.2/253.0，喹硫平-d8：392.5/253.0，氯氮平：327.3/270.0，n-去甲基氯氮平：313.0/269.9，氯氮平-d4：331.4/272.1，文拉法辛：278.2/215.0，o-去甲基文拉法辛：264.2/107.1，文拉法辛-d6：284.4/221.1，度洛西汀：298.1/154.1，度洛西汀-d7：305.3/154.0，米氮平：266.2/195.1，米氮平-d3：269.3/195.0。检测血液中5种精神药物和主要代谢产物的方法及试剂盒，所述5种精神药物为：喹硫平、氯氮平、n-去甲基氯氮平、文拉法辛、度洛西汀、米氮平；所述主要代谢产品是所述喹硫平的主要代谢产物：n-脱烷基喹硫平，和所述文拉法辛的主要代谢产物：o-去甲基文拉法辛；所述试剂盒包括：喹硫平、n-脱烷基喹硫平、氯氮平、n-去甲基氯氮平、文拉法辛、o-去甲基文拉法辛、度洛西汀、以及米氮平标准品；喹硫平-d8、氯氮平-d4、文拉法辛-d6、度洛西汀-d7、以及米氮平-d3内标标准品；稀释液：50vol％的甲醇水溶液，甲醇；优选地，所述试剂盒还包括：阴性血浆或阴性血清。在优选的实施方式中，所述5种精神药物为：喹硫平、氯氮平、文拉法辛、度洛西汀、米氮平；所述主要代谢产品是所述喹硫平的主要代谢产物：n-脱烷基喹硫平，所述氯氮平的主要代谢产物：n-去甲基氯氮平，和所述文拉法辛的主要代谢产物：o-去甲基文拉法辛；所述试剂盒包括：上述混合标准品工作液，上述质控工作液，上述混合内标工作液；优选地，每个所述混合标准品工作液、每个所述质控液、所述内标工作液的体积比为4：5：600。上述试剂盒在同时检测血液中5种精神药物和主要代谢产物浓度方面的应用，所述5种精神药物为：喹硫平、氯氮平、文拉法辛、度洛西汀、米氮平；所述主要代谢产品是包括：所述喹硫平的主要代谢产物n-脱烷基喹硫平，所述氯氮平的主要代谢产物n-去甲基氯氮平，和所述文拉法辛的主要代谢产物o-去甲基文拉法辛。相比现有技术，本发明具有如下有益效果：1、本发明通过对样本前处理方法和高效液相色谱-质谱(hplc-ms/ms)条件的优化，建立了一种检测血液样品中喹硫平及其代谢产物n-脱烷基喹硫平、氯氮平及其主要代谢产物n-去甲基氯氮平、文拉法辛及其代谢产物o-去甲基文拉法辛、度洛西汀、米氮平的方法。本发明中的前处理方法为采用甲醇/乙腈混合溶剂进行蛋白沉淀，操作简单快捷，基本消除基质效应。2、本发明针对每一检测物质，分别选择一对定量离子对，以其相对保留时间作为定性依据，以标准品制作标准曲线定量。同时，本发明应用低、中、高三个水平的质控品考察方法的准确性、有效性，避免检测结果失真。同时，本发明采用内标工作液用于校正，可以避免基质效应，准确定量。3、本发明的线性范围设置合理，能够有效针对临床样本浓度分布，更加符合临床需求，保证临床检测结果稳定、可靠。4、本发明采用高效液相色谱-质谱检测，能够快速、准确、客观，可以对精神药物进行治疗药物监测提供有效依据。5、本发明首次实现了应用高效液相色谱-质谱方法精确检测血液样品中喹硫平、n-脱烷基喹硫平、氯氮平、n-去甲基氯氮平、文拉法辛、o-去甲基文拉法辛、度洛西汀、米氮平含量，用特征离子对进行定性和定量，保证了检测物质的特异性和准确性，降低了干扰物影响。6、本发明操作简单快速，通量高成本低，可应用于精神科临床工作对精神药物进行治疗药物监测。附图说明图1为实施例1总色谱图。图2-图14为实施例1的5种精神药物、其中3种药物的代谢物、每种药物的内标物的色谱图。具体实施方式应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属
技术领域：
的普通技术人员通常理解的相同含义。需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而且非意图限制根据本发明的示例性实施方法。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、部件和/或他们的组合。第一方面，本发明提供检测血液中5种精神药物和主要代谢产物的方法。本发明采用高效液相色谱-质谱的检测方法；检测5种精神药物(母药)为：喹硫平(quetiapine)、氯氮平(clozapine)、文拉法辛(venlafaxine)、度洛西汀(duloxetine)、米氮平(mirtazapine)；其中，喹硫平、氯氮平、文拉法辛的主要代谢产物分别为：n-脱烷基喹硫平(n-desalkylquetiapine)，n-去甲基氯氮平(n-desmethylclozapine)，o-去甲基文拉法(o-desmethylvenlafaxine)。本发明的检测优势之一就是在检测结果的色谱图中能将上述母药和代谢物在色谱柱上分开，使它们之间互相不影响，保证检测结果准确、清楚地呈现。本发明的检测方法包括以下步骤：步骤一、用于hplc-ms/ms的工作溶液的配制，包括待测样品、标准工作液、质控液的配制。(一)待测样品的配制，即血液样品预处理：将血浆样品和内标工作液混匀，离心后取上清液，得到待测样品。优选地，上述血浆样品和内标工作液的体积比为1：(2-4)(例如1：2、1：2.5、1：3.5、1：4)，优选为1：3。上述内标工作液的配制方法包括：s1：分别准确称量适量的喹硫平-d8(quetiapine-d8)、氯氮平-d4(clozapine-d4)、文拉法辛-d6(venlafaxine-d8)、度洛西汀-d7(duloxetine-d6)、米氮平-d3(mirtazapine-d3)的标准品，优选用纯有机溶剂如甲醇分别配置成质量浓度为1mg/ml的内标物储备液溶液(又名内标储备液)。上述喹硫平、文拉法辛的母药和代谢物(母药和代谢物结构很接近)共用同一个内标物，这样最符合检测的实际需求，无需采用过多种内标物造成浪费。s2：准确移取适量的上述内标储备液，优选用甲醇作为稀释液分别稀释成质量浓度为1-5μg/ml，优选为1μg/ml的内标中间工作液。s3：分别精密移取适量的上述内标中间工作液，采用体积比为(0-50)：(50-100)，优选为20：80的甲醇：乙腈混合溶液，配制得到内标工作液；该内标工作液中同时包括：喹硫平-d8的浓度为10-50ng/ml、氯氮平-d4的浓度为10-50ng/ml、文拉法辛-d6的浓度为10-50ng/ml、度洛西汀-d7的浓度为5-40ng/ml、米氮平-d3的浓度为2-20ng/ml；在优选的实施方式中，所述喹硫平-d8的浓度为30ng/ml、氯氮平-d4的浓度为30ng/ml、文拉法辛-d6的浓度为30ng/ml、度洛西汀-d7的浓度为20ng/ml、米氮平-d3的浓度为5ng/ml。将该内标工作液分装于30ml棕色瓶中，于-20℃储存备用。上述内标工作液选用有机溶剂甲醇和乙腈来配制，是将二者作为生物样品血浆或血清的蛋白沉淀剂，该内标工作液中不能加入水。本步骤中采用上述浓度的内标物的信号强度适中，能被准确检测到且信号不会远超被检测物质。(二)混合标准品工作液(即：标准溶液、混合标准品工作溶液)的配制：s1：分别准确称量适量的喹硫平、n-脱烷基喹硫平、氯氮平、n-去甲基氯氮平、文拉法辛、o-去甲基文拉法辛、度洛西汀、米氮平标准品，用纯有机溶剂(优选甲醇)溶解并分别配置成质量浓度为1mg/ml的标准品储备液溶液。s2：准确移取适量的上述各个标准品储备液，使用50vol％的甲醇水溶液作为稀释液，分别配制成标准品中间工作液；在各个中间工作液中，喹硫平、n-脱烷基喹硫平、氯氮平、n-去甲基氯氮平、文拉法辛、o-去甲基文拉法辛、度洛西汀、米氮平的浓度分别为80、40、100、60、80、80、30、20μg/ml。s3：准确吸取一定体积的上述标准品中间工作液，使用50vol％的甲醇水溶液作为稀释液，分别配制成7个梯度的混合标准品工作溶液(其中包含上述5种精神药物、其中的3种的相应代谢物)，在7个梯度的混合标准品工作溶液中，自梯度1至梯度7的混合标准品工作溶液的喹硫平的浓度为8，16，32，80，160，400，800ng/ml，自梯度1至梯度7的混合标准品工作溶液的n-脱烷基喹硫平的浓度为4，8，16，40，80，200，400ng/ml，自梯度1至梯度7的混合标准品工作溶液的氯氮平的浓度为10，20，40，100，200，500，1000ng/ml，自梯度1至梯度7的混合标准品工作溶液的n-去甲基氯氮平的浓度为6，12，24，60，120，300，600ng/ml，自梯度1至梯度7的混合标准品工作溶液的文拉法辛的浓度为8，16，32，80，160，400，800ng/ml，自梯度1至梯度7的混合标准品工作溶液的o-去甲基文拉法辛的浓度为8，16，32，80，160，400，800ng/ml，自梯度1至梯度7的混合标准品工作溶液的度洛西汀的浓度为3，6，12，30，60，150，300ng/ml，自梯度1至梯度7的混合标准品工作溶液的米氮平的浓度为2，4，8，20，40，100，200ng/ml。该混合标准品工作溶液按浓度分为7个梯度(如表1)，每个梯度的溶液分别置于不同容器中。将上述各个梯度的混合标准品工作溶液分装于30ml棕色瓶中，于-20℃储存备用。上述各个混合标准品工作溶液中，根据不同检测物质的标准曲线线性范围与该内标的质谱响应强度不同，将各种物质的浓度设置为不同的梯度1-7，这样既能让内标浓度处于对应检测物质的浓度分布内，响应合适保证检测方法稳定。表1：混合标准工作液的7个浓度梯度上述每种母药及其代谢产物在样本中的含量均不同，上述梯度1-7的设置方式能够保证大部分临床样本浓度都能在线性之内。上述各个梯度、各种物质的混合标准工作液需要在步骤二的hplc-ms/ms检测之前，用阴性血浆或血清稀释至原体积的10倍，现配现用。(三)质控品工作液(即：质控溶液、质控液)的配制：准确称取一定质量的上述5种精神药物和其中的3种的主要代谢产物的标准品，先用纯有机溶剂(优选甲醇)溶解，再用稀释液(优选为50vol％的甲醇水溶液)逐级稀释，配制成高、中、低3个浓度梯度的质控溶液(每个梯度的质控溶液中均包含上述5种精神药物和3种相应的代谢产物)。从低到高浓度梯度的3种质控溶液中，喹硫平的浓度为400，2000，6000ng/ml，n-脱烷基喹硫平的浓度为200，1000，3000ng/ml，氯氮平的浓度为500，2500，7500ng/ml，n-去甲基氯氮平的浓度为300，1500，4500ng/ml，文拉法辛的浓度为400，2000，6000ng/ml，o-去甲基文拉法辛的浓度为400，2000，6000ng/ml，度洛西汀的浓度为150，750，2250ng/ml，米氮平的浓度为100，500，1500ng/ml。该质控溶液按浓度分为3个梯度，如表2，每个梯度的溶液分别置于不同容器中。将上述各个梯度的不同的质控品工作液分装于1.5ml棕色小瓶中，于-20℃储存备用。表2：质控溶液的低、中、高三个梯度低浓度ng/ml中浓度ng/ml高浓度ng/ml喹硫平40020006000n-脱烷基喹硫平20010003000氯氮平50025007500n-去甲基氯氮平30015004500文拉法辛40020006000o-去甲基文拉法辛40020006000度洛西汀1507502250米氮平1005001500上述各个梯度、各种物质的质控溶液需要在步骤二的hplc-ms/ms检测之前，用阴性血浆或血清稀释至原体积的10倍，现配现用。在上述混合标准品工作液和质控品工作液的配制中，第一步固体标准品溶解，考虑到其化合物的溶解度(性)，需要采用纯有机溶剂使其溶解，得到储备液；在后续的进一步稀释过程，就是配制工作液的过程，因为在工作液的配制过程中，储备液的浓度逐渐降低，所以就可以采用含有适当比例水的稀释液(比如50％vol甲醇水溶液)来稀释。这样操作既能保证稀释过程中不会有化合物析出，也能避免稀释液中的有机溶剂挥发过快。步骤二、进样样品制备：1、待测样品进样液的制备，如步骤一所述。2、标准品进样液的制备：将阴性血浆或血清稀释后的各种药物、各个梯度的混合标准品工作液，加入2-4倍，优选3倍体积的内标工作液，混匀，离心取上清，准备进样。3、质控品进样液的制备：将阴性血浆或血清稀释后的各种药物、各个梯度的质控品工作液，加入2-4倍，优选3倍体积的内标工作液，混匀，离心取上清，准备进样。步骤三、高效液相色谱-串联质谱(hplc-ms/ms)检测：优选为相同体积的上述待测样品进样液、混合标准品进样液、质控品进样液进样检测。本步骤采用的仪器为：sciex4500md三重四级杆质谱仪(美国，sciex公司)，岛津高效液相色谱系统(日本，shimadzuscientific公司)。上述hplc-ms/ms的条件为：a、色谱条件：色谱柱：phenomenexphenyl-hexyl柱(50×4.6mm，2.6m)；柱温：50℃；流动相a：含5mm甲酸铵-0.05％-甲酸的hplc级水，即为：以hplc级水位溶剂，该流动相a中甲酸铵的终浓度为0.05mmol/l，甲酸在该流动相a中的体积百分比为0.05％；流动相b:乙腈；采用梯度洗脱，洗脱条件为：0-2.4min期间，b相的比例为15％-95％、流动相a的比例为85％-5％；2.5-3.4min期间，b相的比例为95％、流动相a的比例为5％；3.5-4.5min期间，b相的比例为15％，流动相a的比例为85％；此段所述比例为体积比例。流速：0.6ml/min；进样体积：1μl。上述色谱条件适用于检测上述5种母药和其中的3种的主要代谢产物，能够保证色谱峰分离效果好，且在适宜时间出峰。b、质谱条件：离子源：电喷雾离子源；扫描模式：正离子多反应监测；气帘气体压力40psi；碰撞气：medium；喷雾器电压5000v；温度550℃；gas155psi，gas250psi。入口电压10v；碰撞池退出电压10v。上述质谱参数能够保证检测中信号的强度。第二方面，本发明提供第一方面所述的5种精神药物及其主要代谢产物的hplc-ms/ms检测方法所采用的试剂盒。该试剂盒包括：上述7个不同浓度梯度的混合标准品工作液，上述高、中、低3个浓度梯度质控溶液，上述内标工作液(即：混合内标溶液)，还包括有阴性血浆或阴性血清。其中，每个浓度梯度的混合标准品工作液的体积优选相同，每个高、中、低浓度梯度质控溶液的体积优选相同，某一浓度梯度的混合标准品工作液、某一浓度梯度的质控溶液与内标工作液的体积比优选为4：5：600，例如：每个浓度梯度的混合标准溶液200μl、每个浓度梯度的高、中、低质控溶液250μl、内标工作液30ml。下面结合实例对本发明作进一步的说明。实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。应理解，这些实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的范围。对外应理解，在阅读了本发明的内容之后，本领域技术人员对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实施例1本实施例为检测血液中5种精神药物及其主要代谢产物的方法，包括以下步骤：1、血液样品预处理：精密移取血浆或血清样品100μl于1.5mlep管中，再加入300μl内标工作液(配制方法见下文3)，涡旋混匀1min。于4℃，14000rpm离心10min，取100-200μl上清液用于上样，获得待测样本(即待测样品进样液)。2、混合标准品工作液的配制：(1)分别准确称量适量的喹硫平、n-脱烷基喹硫平、氯氮平、n-去甲基氯氮平、文拉法辛、o-去甲基文拉法辛、度洛西汀、米氮平，用甲醇分别配置成质量浓度为1mg/ml的标准品储备液溶液。(2)准确移取适量的标准品储备液，用50vol％的甲醇水溶液分别配制成标准品中间工作液，在中间工作液中，喹硫平、n-脱烷基喹硫平、氯氮平、n-去甲基氯氮平、文拉法辛、o-去甲基文拉法辛、度洛西汀、米氮平的浓度分别为80、40、100、60、80、80、30、20μg/ml。(3)准确吸取一定体积的标准品中间工作液，用50vol％的甲醇水溶液配制成7个浓度的混合标准品工作溶液，在混合标准品工作溶液中，喹硫平的浓度为80，160，320，800，1600，4000，8000ng/ml，n-脱烷基喹硫平的浓度为40，80，160，400，800，2000，4000ng/ml，氯氮平的浓度为100，200，400，1000，2000，5000，10000ng/ml，n-去甲基氯氮平的浓度为6000，3000，1200,，600，240，120，60ng/ml，文拉法辛的浓度为80，160，320，800，1600，4000，8000ng/ml，o-去甲基文拉法辛的浓度为80，160，320，800，1600，4000，8000ng/ml，度洛西汀的浓度为30，60，120，300，600，1500，3000ng/ml，米氮平的浓度为20，40，80，200，400，1000，2000ng/ml。标准工作液分装于1.5ml棕色小瓶中，-20℃备用。3、内标工作液的配制方法：(1)分别准确称量适量的喹硫平-d8、氯氮平-d4、文拉法辛-d6、度洛西汀-d7、米氮平-d3，用甲醇分别配置成质量浓度为1mg/ml的内标物储备液溶液。(2)准确移取适量的内标储备液，用甲醇分别稀释成质量浓度为1μg/ml的内标中间工作液。(3)分别精密移取适量的上述内标中间工作液，用甲醇：乙腈(v/v＝20:80)的配制混和内标溶液，在混和内标溶液中，喹硫平-d8、氯氮平-d4、文拉法辛-d6、度洛西汀-d7、米氮平-d3的浓度分别为30，30，30，20，5ng/ml；内标工作液分装于30ml棕色瓶中，-20℃备用。4、混合质控品工作液的配制方法：准确称取一定质量的上述5种精神药物和主要代谢产物的标准品，先用甲醇溶解，再用50vol％的甲醇水溶液逐级稀释，配制成高、中、低3个浓度的质控溶液。其中，喹硫平的浓度为400，2000，6000ng/ml，n-脱烷基喹硫平的浓度为200，1000，3000ng/ml，氯氮平的浓度为500，2500，7500ng/ml，n-去甲基氯氮平的浓度为300，1500，4500ng/ml，文拉法辛的浓度为400，2000，6000ng/ml，o-去甲基文拉法辛的浓度为400，2000，6000ng/ml，度洛西汀的浓度为150，750，2250ng/ml，米氮平的浓度为100，500，1500ng/ml。将上述各个质控工作液分装于1.5ml棕色小瓶中，于-20℃储存备用。5、混合标准品校准曲线样本的制备精密吸取阴性血浆90μl，分别加入7个浓度混合标准品工作溶液各10μl，涡旋混匀1min，使其得到混合校准品校准曲线样本。样品中喹硫平的浓度为8，16，32，80，160，400，800ng/ml，n-脱烷基喹硫平的浓度为4，8，16，40，80，200，400ng/ml，氯氮平的浓度为10，20，40，100，200，500，1000ng/ml，n-去甲基氯氮平的浓度为6，12，24，60，120，300，600ng/ml，文拉法辛的浓度为8，16，32，80，160，400，800ng/ml，o-去甲基文拉法辛的浓度为8，16，32，80，160，400，800ng/ml，度洛西汀的浓度为3，6，12，30，60，150，300ng/ml，米氮平的浓度为2，4，8，20，40，100，200ng/ml。上述样本现配现用。6、混合质控品的制备精密吸取阴性血浆90μl，分别加入3个浓度混合质控品工作溶液各10μl，涡旋混匀1min，使其得到混合质控品。样品中喹硫平的浓度为40，200，600ng/ml，n-脱烷基喹硫平的浓度为20，100，300ng/ml，氯氮平的浓度为50，250，750ng/ml，n-去甲基氯氮平的浓度为30，150，450ng/ml，文拉法辛的浓度为40，200，600ng/ml，o-去甲基文拉法辛的浓度为40，200，600ng/mlng/ml，度洛西汀的浓度为15，75，225ng/ml，米氮平的浓度为10，50，150ng/ml。上述样本现配现用。7、进样准备：待测样品：如步骤1所述。标准品进样液：取步骤5的各个混合校准品校准曲线样本100μl，加入300μl内标工作液，涡旋混匀1min；于4℃，14000rpm离心10min，取100-200μl上清液到进样管中，获得混合标准品；准备进样。质控品进样液：取步骤6的各个混合质控品100μl，加入300μl内标工作液，涡旋混匀1min；于4℃，14000rpm离心10min，取100-200μl上清液到进样管中，获得质控品；准备进样。8、hplc-ms/ms检测：取相同体积的上述待测样品、混合标准品、质控品分别进行检测，其条件设为一致。色谱条件：含5mm甲酸铵-0.05％甲酸水溶液，流动相b为乙腈。梯度洗脱程序为0-2.4min，15％-95％的b相梯度洗脱；2.5-3.4min，95％的b相等度洗脱；3.5-4.5min，15％的b相等度洗脱。色谱柱为phenomenexphenyl-hexyl柱(50×4.6mm，2.6μm)，柱温为50℃，进样体积为1μl，流速为0.6ml/min，总的分析时间为4.5min。表3为梯度洗脱条件时间表。此流动相梯度可以使所有化合物在色谱柱上保留的同时进行完全分离。其中0-2.4min随着有机相浓度逐渐增加，可以根据化合物极性不同，将化合物逐一分离，根据时间先后，分别洗脱出：o-去甲基文拉法辛(1.90min)、米氮平(2.11min)、文拉法辛(2.20min)、n-脱烷基喹硫平(2.36min)、n-去甲基氯氮平(2.33min)、氯氮平(2.38min)、喹硫平(2.40min)、度洛西汀(2.56min)；2.5-3.5min为高浓度有机相，可以将样本中残留在色谱柱中的杂质洗脱；3.5-4.5min为平衡时间，使流动相恢复初始状态，即流动相b的比例恢复为15％，为下一次分析做准备。表3：梯度洗脱条件时间表质谱条件：离子源为esi源，源参数设置为气帘气体压力40psi，碰撞气：medium，喷雾器电压5000v，温度550℃，gas155psi，gas250psi。入口电压(ep)10v，碰撞池退出电压(cxp)10v。正离子方式检测，扫描模式为mrm，各个离子对具体扫描参数如下表2：表2：8种待测物质与5种内标物质的mrm扫描参数上述mrm扫描参数特别适用于检测本实施例的5种母药和其中3种的代谢产物。上表中，q1和q3分别是母离子和子离子，两者组成离子对，对于特定物质有特定离子对，可以增加检测方法的特异性和灵敏度；上述离子对选择得十分合适，响应强、干扰少、信号稳定，增加了检测方法的灵敏度和稳定性。在进行色谱-质谱过程中，混合标准工作液、质控工作液以及待测样品的检测条件均一致。9、计算结果(1)采用analyst软件采集数据，采用multiquant对色谱峰进行积分，计算，处理；以混合标准工作液中某一药物或某一代谢产物和相应内标峰面积比为纵坐标(y)，浓度为横坐标(x)，用加权进行曲线回归运算，回归方程为：y＝ax b。将待测样品中的相应待测物和内标峰面积比代入标准曲线方程，计算血浆样品中各种物质的浓度。本实施例的8种待测物质的线性范围，回归方程，线性系数，检出限和定量限如表4。表4：8种待测物质的计算结果(2)本实施例连续检测了3批待测样品，精密度(precision)和准确度(accuracy)数据较好，精密度控制在15％以内，准确度控制在100％±15％以内，所以建立的方法比较稳定。上述精密度和准确度是通过对于质控品计算得到的，精密度：通过高中低三水平质控的平行制备6份平行样本(即在这3批待测样品中，每一批的每个水平上都制备6个样本)，测试6份平行样本浓度的离散程度，用rsd表示；准确度：用上述精密度数据，考察实测浓度与理论浓度差异，用re表示。本实施例的3批待测样品，其精密度与准确度的数据如表5。表5：3批待测样品的精密度和准确度图1为总色谱图，图2为喹硫平的色谱图，图3为n-脱烷基喹硫平的色谱图，图4为喹硫平-d8的色谱图，图5为氯氮平的色谱图，图6为去甲氯氮平的色谱图，图7为氯氮平-d4的色谱图，图8为文拉法辛的色谱图，图9为o-去甲基文拉法辛的色谱图，图10为文拉法辛-d6的色谱图，图11为度洛西汀的色谱图，图12为度洛西汀-d7的色谱图，图13为米氮平的色谱图，图14为米氮平-d3的色谱图。当前第1页1 2 3
技术特征：1.检测血液中5种精神药物和主要代谢产物的方法，其特征在于：所述方法采用高效液相色谱-质谱检测；所述5种精神药物为：喹硫平、氯氮平、文拉法辛、度洛西汀、米氮平；
所述主要代谢产物是：所述喹硫平的主要代谢产物：n-脱烷基喹硫平，所述氯氮平的主要代谢产物：n-去甲基氯氮平，所述文拉法辛的主要代谢产物：o-去甲基文拉法辛。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于：所述方法包括：工作溶液配制步骤，以及高效液相色谱-质谱检测步骤；所述工作溶液包括：待测样品，混合内标工作液，混合标准品工作液，质控工作液。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于：所述工作溶液配制步骤中，所述待测样品的配制方法包括：将试验样品与混合内标工作液按体积比1：(2-4)，优选为1：3混匀，离心后取上清，得到待测样品；
优选地，所述试验样品为被测试对象的血浆或血清。
4.根据权利要求3所述方法，其特征在于：
所述混合内标工作液的配制方法包括：采用稀释液分别将喹硫平-d8、氯氮平-d4、文拉法辛-d6、度洛西汀-d7、米氮平-d3内标标准品稀释配置成浓度均为1μg/ml的五种内标中间工作液；然后利用所述五种内标中间工作液，采用体积比为(0-50)：(50-100)、优选为20：80的甲醇：乙腈混合液配制混合内标工作液，
所述混合内标工作液中，所述喹硫平-d8的浓度为10-50ng/ml、氯氮平-d4的浓度为10-50ng/ml、文拉法辛-d6的浓度为10-50ng/ml、度洛西汀-d7的浓度为5-40ng/ml、米氮平-d3的浓度为2-8ng/ml；
优选地，所述喹硫平-d8的浓度为30ng/ml、氯氮平-d4的浓度为30ng/ml、文拉法辛-d6的浓度为30ng/ml、度洛西汀-d7的浓度为20ng/ml、米氮平-d3的浓度为5ng/ml；
优选地，所述稀释液是甲醇。
5.根据权利要求3所述方法，其特征在于：
所述混合标准品工作液的配制方法包括：用稀释液将喹硫平、n-脱烷基喹硫平、氯氮平、文拉法辛、o-去甲基文拉法辛、度洛西汀、米氮平标准品稀释以配制多种所述混合标准品工作液，每种所述混合标准品工作液中均同时含有喹硫平、n-脱烷基喹硫平、氯氮平、文拉法辛、o-去甲基文拉法辛、度洛西汀、米氮平；
多种所述混合标准品工作液优选为八种，从第一种至第八种所述混合标准品工作液中喹硫平、n-脱烷基喹硫平、氯氮平、n-去甲基氯氮平、文拉法辛、o-去甲基文拉法辛、度洛西汀、米氮平的浓度均依次递增；
优选地，从第一种至第八种所述混合标准品工作液中，喹硫平的浓度依次为80，160，320，800，1600，4000，8000ng/ml，n-脱烷基喹硫平的浓度依次为40，80，160，400，800，2000，4000ng/ml，氯氮平的浓度为100，200，400，1000，2000，5000，10000ng/ml，n-去甲基氯氮平的浓度为6000，3000，1200,，600，240，120，60ng/ml，文拉法辛的浓度依次为80，160，320，800，1600，4000，8000ng/ml，o-去甲基文拉法辛的浓度依次为80，160，320，800，1600，4000，8000ng/ml，度洛西汀的浓度依次为30，60，120，300，600，1500，3000ng/ml，米氮平的浓度依次为20，40，80，200，400，1000，2000ng/ml；
优选地，所述稀释液为50vol％的甲醇水溶液；
优选地，在进行所述高效液相色谱-质谱检测之前，将第一种至第八种各个浓度梯度的混合标准品工作液，用阴性血浆或阴性血清稀释为原体积的10倍。
6.根据权利要求3所述方法，其特征在于：
所述质控工作液的配制方法包括：用稀释液将喹硫平、n-脱烷基喹硫平、氯氮平、n-去甲基氯氮平、文拉法辛、o-去甲基文拉法辛、度洛西汀、米氮平标准品稀释以配制低、中、高三种质控工作液，每种所述质控工作液中均同时含有喹硫平、n-脱烷基喹硫平、氯氮平、n-去甲基氯氮平、文拉法辛、o-去甲基文拉法辛、度洛西汀、米氮平；
低、中、高三种质控工作液中喹硫平、n-脱烷基喹硫平、氯氮平、n-去甲基氯氮平、文拉法辛、o-去甲基文拉法辛、度洛西汀、米氮平的浓度均依次递增；
低、中、高三种所述质控工作液中，所述喹硫平的浓度依次为400，2000，6000ng/ml，n-脱烷基喹硫平的浓度依次为200，1000，3000ng/ml，氯氮平的浓度依次为500，2500，7500ng/ml，n-去甲基氯氮平的浓度依次为300，1500，4500ng/ml，文拉法辛的浓度依次为400，2000，6000ng/ml，o-去甲基文拉法辛的浓度依次为400，2000，6000ng/mlng/ml，度洛西汀的浓度依次为150，750，2250ng/ml，米氮平的浓度依次为100，500，1500ng/ml；
所述稀释液为50vol％的甲醇水溶液；
优选地，在进行所述高效液相色谱-质谱检测之前，将各个低、中、高三种所述质控工作液用阴性血浆或阴性血清稀释为原体积的10倍。
7.根据权利要求3所述方法，其特征在于：高效液相色谱-质谱检测步骤中，色谱条件为：色谱柱：phenomenexphenyl-hexyl柱(50×4.6mm，2.6μm)；
柱温：50℃；
流动相a：以hplc级水为溶剂，所述流动相a中包括：终浓度为0.05mmol/l的甲酸铵，终浓度为体积百分比0.05％的甲酸；
流动相b:乙腈；采用梯度洗脱；
洗脱条件为：
0-2.4min期间，流动相b的比例为15％-95％；2.5-3.4min期间，流动相b的比例为95％；3.5-4.5min期间，流动相b的比例为15％；
流速：0.6ml/min；
进样体积：1μl；
优选地，高效液相色谱-质谱检测步骤中，质谱条件为：
离子源：电喷雾离子源；
扫描模式：正离子多反应监测；
气帘气体压力40psi；
喷雾器电压5000v；
温度550℃；
gas155psi，
gas250psi；
碰撞气：medium；
入口电压10v；
碰撞池退出电压10v；
优选地，q1为母离子，q3为子离子，所述精神药物和主要代谢产物的q1/q3的值分别优选为：
喹硫平：384.3/253.1，n-脱烷基喹硫平：296.2/253.0，
喹硫平-d8：392.5/253.0，氯氮平：327.3/270.0，
n-去甲基氯氮平：313.0/269.9，氯氮平-d4：331.4/272.1，
文拉法辛：278.2/215.0，o-去甲基文拉法辛：264.2/107.1，
文拉法辛-d6：284.4/221.1，度洛西汀：298.1/154.1，
度洛西汀-d7：305.3/154.0，米氮平：266.2/195.1，米氮平-d3：269.3/195.0。
8.检测血液中5种精神药物和主要代谢产物的试剂盒，所述5种精神药物为：喹硫平、氯氮平、n-去甲基氯氮平、文拉法辛、度洛西汀、米氮平；所述主要代谢产品是所述喹硫平的主要代谢产物：n-脱烷基喹硫平，和所述文拉法辛的主要代谢产物：o-去甲基文拉法辛；
其特征在于：
所述试剂盒包括：
喹硫平、n-脱烷基喹硫平、氯氮平、n-去甲基氯氮平、文拉法辛、o-去甲基文拉法辛、度洛西汀、以及米氮平标准品；
喹硫平-d8、氯氮平-d4、文拉法辛-d6、度洛西汀-d7、以及米氮平-d3内标标准品；
稀释液：50vol％的甲醇水溶液，甲醇；
优选地，所述试剂盒还包括：阴性血浆或阴性血清。
9.检测血液中5种精神药物和主要代谢产物的方法，所述5种精神药物为：喹硫平、氯氮平、文拉法辛、度洛西汀、米氮平；所述主要代谢产品是所述喹硫平的主要代谢产物：n-脱烷基喹硫平，所述氯氮平的主要代谢产物：n-去甲基氯氮平，和所述文拉法辛的主要代谢产物：o-去甲基文拉法辛；
其特征在于：
所述试剂盒包括：
权利要求5所述混合标准品工作液，权利要求6所述质控工作液，权利要求4所述混合内标工作液；
优选地，每个所述混合标准品工作液、每个所述质控液、所述内标工作液的体积比为4：5：600。
10.权利要求8或9所述试剂盒在同时检测血液中5种精神药物和主要代谢产物浓度方面的应用，所述5种精神药物为：喹硫平、氯氮平、文拉法辛、度洛西汀、米氮平；所述主要代谢产品是包括：所述喹硫平的主要代谢产物n-脱烷基喹硫平，所述氯氮平的主要代谢产物n-去甲基氯氮平，和所述文拉法辛的主要代谢产物o-去甲基文拉法辛。
技术总结本发明属于药物检测领域，具体涉及检测血液中5种精神药物和主要代谢产物的方法及试剂盒。所述5种精神药物及其主要代谢产物为：喹硫平、N‑脱烷基喹硫平、氯氮平、N‑去甲基氯氮平、文拉法辛、O‑去甲基文拉法辛、度洛西汀、米氮平。本发明针对每一检测物质，分别选择一对定量离子对，以其对应保留时间作为定性依据，以标准品制作标准曲线定量；并且应用低、中、高三个水平的质控品考察方法的准确性、有效性，避免检测结果失真；同时采用内标工作液用于校正，可以避免基质效应，准确定量。本发明操作简单快速，通量高成本低，可应用于精神科临床工作对精神药物进行治疗药物监测。
技术研发人员：杨甫德;安会梅;谭云龙;栗琳;陆开智;王黎辉;谭淑平;陈松;姚尚武;齐思远;梁伟业;白璐源;马泊涛;王永前;武红梅;刘枫;蔡博伦;王冬;倪伟;丁建军;李彩霞
受保护的技术使用者：北京回龙观医院(北京心理危机研究与干预中心);江苏豪思生物科技有限公司
技术研发日：2019.12.31
技术公布日：2020.06.09
