本发明涉及检测领域，具体涉及一种检测硝酸盐和亚硝酸盐的方法。
背景技术：
硝酸盐和亚硝酸盐可作为护色剂和防腐剂被添加到肉制品中，有助于改善肉色，抑制微生物的生长和繁殖，延长肉制品的货架期。但亚硝酸盐会将人体的血红蛋白转化为高铁血红蛋白，使血液失去携氧功能，并且具有致癌、致畸作用，过量甚至危及生命。
我国已批准使用的硝酸盐及亚硝酸盐仅有4种，包括硝酸钠、硝酸钾、亚硝酸钠、亚硝酸钾，其中硝酸钠和亚硝酸钠应用比较广泛。《gb2760-2014食品添加剂使用标准》中规定了腌腊肉制品、酱卤肉制品、西式肉制品等各种熟肉制品中硝酸盐的最大使用量为0.5g/kg，残留量≤30mg/kg(以no3-计)；亚硝酸盐的最大使用量为0.15g/kg，残留量≤30mg/kg(以no2-计)。由于硝酸盐和亚硝酸盐的安全性问题，如何测定和降低其残留量一直备受人们的关注，因此检测畜禽肉制品中其含量具有重要意义。
目前，食品中硝酸盐及亚硝酸盐的检测方法主要有离子色谱法、分光光度法、化学发光法、液相色谱法、气相色谱法等。其中离子色谱法已被列为国家标准检验方法之一，因其操作简便、回收率稳定，常被广泛应用于肉制品的检测。
当前有效的检测方法gb5009.33-2016前处理操作较繁琐，耗时较长，回收率偏低，精密度差。因此，目前亟需建立一种回收率高、精密度良好、结果准确可靠的畜禽肉及其制品中硝酸盐和亚硝酸盐的检测方法。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种回收率高、精密度良好、结果准确可靠的畜禽肉及其制品中硝酸盐和亚硝酸盐的检测方法。
本发明提供一种畜禽肉及其制品中硝酸盐和亚硝酸盐的检测方法，其包含以下步骤：
(1)样品前处理：称取畜禽肉的均质样品，加水超声萃取，水浴加热，取出后冷却至室温，加入有机溶剂，充分混合后静置，离心，取上清液依次过0.22μm滤膜、rp柱和na柱，待用；
(2)标准曲线的制作：将硝酸根及亚硝酸根离子的标准系列工作液分别注入离子色谱仪中，得到各浓度标准工作液色谱图，测定相应的峰面积，以硝酸根及亚硝酸根离子质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制硝酸根及亚硝酸根离子的标准曲线；
(3)待测溶液的含量测定：将空白溶液和待测溶液注入离子色谱仪中，得到空白和试样溶液的峰面积，根据标准曲线计算待测溶液中硝酸盐和亚硝酸盐的含量；
其中，步骤(2)和(3)中离子色谱条件为：色谱柱选择阴离子分析色谱柱，柱温为25-40℃；流速为0.5-5ml/min；淋洗液为氢氧化钾溶液。
优选的，所述步骤(1)中的畜禽肉选自猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉或鸭肉。
优选的，所述步骤(1)中超声萃取的温度为30-50℃；更优选的，温度为40℃。
优选的，所述步骤(1)中超声萃取时间为20-40min；更优选的，超声萃取时间为30min。
优选的，所述步骤(1)中水浴加热温度为60-80℃；更优选的，水浴加热温度为75℃。
优选的，所述步骤(1)中水浴加热时间为2-10min；更优选的，水浴加热时间为5min。
优选的，所述步骤(1)中的有机溶剂选自二氯甲烷、丙酮、乙腈或其组合。
更优选的，所述有机溶剂为二氯甲烷。
优选的，所述步骤(1)中均质样品与有机溶剂的质量体积比为1g：1-10ml，更优选为1g：5ml。
优选的，所述步骤(2)中硝酸根和亚硝酸根的定量限分别为0.3mg/kg和0.2mg/kg，检出限分别为0.09mg/kg和0.06mg/kg。
优选的，所述步骤(2)中硝酸根在0.2-2.0mg/kg范围内均呈良好的线性关系。
优选的，所述步骤(2)中亚硝酸根在0.02-0.2mg/kg范围内均呈良好的线性关系。
优选的，所述步骤(2)和(3)中阴离子分析色谱柱为dionexionpactmas11-hcrfictmanalytical型离子色谱分析柱。
优选的，所述步骤(2)和(3)中的柱温为30℃。
优选的，所述步骤(2)和(3)中的淋洗液流速为1ml/min。
优选的，所述步骤(2)和(3)中氢氧化钾淋洗液的洗脱梯度为：①5mmol/l，40-50min；②60mmol/l，5-15min；③5mmol/l，5-15min。
优选的，所述步骤(2)和(3)中氢氧化钾淋洗液的洗脱梯度为：①5mmol/l，45-50min；②60mmol/l，10min；③5mmol/l，10min。
更优选的，所述步骤(2)和(3)中氢氧化钾淋洗液的洗脱梯度为：
本发明具有积极有益的效果：
通过优化前处理方法和仪器检测条件，本发明的检测方法弥补了国标方法检测的缺陷，具有操作简单、试验周期短、损耗低、回收率高、精密度良好等优点，可有效降低杂质对硝酸盐与亚硝酸盐检测的干扰，适用于肉类及其制品中硝酸盐和亚硝酸盐的快速测定。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作更进一步的说明，但本发明的实施方式不限于此。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
试验例1本发明方法检测畜禽肉中硝酸盐和亚硝酸盐含量
1、试验材料与试剂
(1)试验材料：供试材料包括各种畜禽肉及其制品，如猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉、鸭肉、腌腊肉制品、肉干制品、西式肉制品等样品，均购自南京农贸市场和超市。
(2)试剂：硝酸盐标准液、亚硝酸盐标准液(均为200mg·kg-1，以各硝酸根离子浓度计)，均购自北京海岸鸿蒙标准物质技术有限责任公司；二氯甲烷(分析纯)、甲醇(分析纯)、氢氧化钾(分析纯)，均购自国药集团化学试剂有限公司。所有溶液均采用超纯去离子水配制。
2、仪器与设备
离子色谱仪(ics5000型，配有电导检测器，aers型抑制器，cr-tc捕获柱)、rp柱和na柱，均购自美国thermofisher公司；高速冷冻离心机(d-16c)、分析天平(cpa224s)，均购自德国sartorius公司；水浴锅(tw20)，购自德国julabo公司；超声波清洗器(x025-12dtd)，购自南京先欧仪器公司；各种量程微量移液器均购自德国eppendorf公司。
3、实验方法
(1)样品前处理
本发明方法：称取2g均质样品(精确至0.0001g)，置于50ml离心管中，加入30ml超纯水，40℃超声萃取30min，每隔5min振摇1次；75℃水浴加热5min，取出后冷却至室温，加入10ml二氯甲烷，摇晃、分层、静置，5000r·min-1离心10min；取上清液依次过0.22μm滤膜、rp柱和na柱，弃去前3ml上清液，待上机检测。除不称取样品外，按照上述操作同时完成对应的空白对照实验。
国标方法：按照《食品安全国家标准食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》(gb5009.33-2016)中第一法规定的前处理方法进行操作。
(2)过滤柱和滤膜活化
过滤柱和滤膜萃取使用前需要进行活化，其活化过程为：rp柱依次用5ml甲醇、10ml超纯水通过，静置活化30min；0.22μm滤膜用10ml超纯水通过，静置活化30min。
(3)色谱条件的建立
色谱柱：使用dionexionpactmas11-hcrfictmanalytical型离子色谱分析柱(4mm×250mm)，配备dionexionpactmag11-hcrfictmguard型保护柱(4mm×50mm)。
检测条件为：柱温，30℃；抑制器电流，149ma；流速，1.0ml·min-1；进样量，100μl；氢氧化钾淋洗液，淋洗条件见表1。
表1梯度淋洗条件
(4)标准曲线的制作及检出限、定量限的确定
根据以上试验确定的最佳检测条件，将硝酸盐、亚硝酸盐配制成系列浓度混合标准工作溶液，其中硝酸根离子浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0mg/kg，亚硝酸根离子浓度为0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.15、0.2mg/kg，上机检测。以硝酸根及亚硝酸根离子质量浓度(mg/kg)为横坐标(x)，峰面积(μs×min)为纵坐标(y)绘制标准曲线，以此确定最佳线性范围以及相关系数。以3倍信噪比计算检测限(limitofdetection，lod)，10倍信噪比计算定量限(limitofquantitation，loq)。
(5)精密度和加标回收率实验
将猪、牛、羊、鸡、鸭五种畜禽肉搅碎后，分别添加低、中、高3个浓度水平的硝酸盐及亚硝酸盐的混合标准溶液。按前述方法进行前处理，对同一浓度的标准样品重复进样6次，计算其加标回收率和精密度(relativestandarddeviation，rsd)。
4、数据分析
使用美国thermofisherscientific公司的chromeleonclientprogram程序软件分析数据，使用microcalorigin7.5(microcalsoftware公司)软件制图。加标回收实验平行测定6次，计算其rsd；样品平行测定3次，计算其平均值。
5、试验结果与分析
(1)检出限、定量限和线性范围
硝酸盐及亚硝酸盐的离子色谱图显示，亚硝酸盐和硝酸盐的保留时间分别为16.040min和35.633min，两者的出峰时间差距大，分离度好。
绘制硝酸盐和亚硝酸盐标准曲线，以此来确定硝酸盐及亚硝酸盐的定量限、检出限和线性范围。由表2可知，硝酸盐和亚硝酸盐的定量限分别为0.3、0.2mg/kg，检出限分别为0.09、0.06mg/kg。硝酸盐在0.2-2.0mg/kg，亚硝酸盐在0.02-0.2mg/kg范围内均呈良好的线性关系，其相关系数均为0.999。
表2硝酸盐及亚硝酸盐的线性方程、线性系数、定量限及检出限
(2)加标回收率及精密度
由于本发明检测方法和国标方法检测畜禽肉中硝酸盐和亚硝酸盐的本底值不同，本试验依据各样品的本底值分别计算其加标量。分别对猪、牛、羊、鸡和鸭5种畜禽肉进行回收率的检测，结果如表3和表4所示，在低、中、高3个浓度水平，本发明检测方法所测得硝酸盐和亚硝酸盐的加标回收率平均值分别在77.0％-106.1％、77.3％-101.0％、65％-97.5％、80.0％-103.3％、90.5％-99.2％，rsd分别在1.12％-8.75％、2.48％-7.05％、1.34％-6.83％、1.29％-7.70％、0.10％-8.20％。而国标方法所测得硝酸盐和亚硝酸盐的加标回收率平均值分别在30.8％-76.8％、16.7％-83.0％、51.7％-89.2％、25.4％-63.0％、50.3％-80.0％，rsd分别在1.82％-10.40％、1.02％-12.26％、2.41％-13.34％、1.14％-11.49％、2.36％-13.01％。这表明与国标方法相比，本发明的检测方法回收率较高，精密度良好。
表3本发明方法加标回收率和rsd(n＝6)
表4国标方法加标回收率和rsd(n＝6)
试验例2、本发明检测方法的实际应用
选取市售畜禽肉制品14份，其中腌腊肉制品4份、酱卤制品3份、肉干制品3份、烧烤制品1份、西式肉制品3份，检测其中的硝酸盐及亚硝酸盐含量。样品前处理方法和检测条件参照试验例1，以此评价本发明方法检测畜禽肉制品中硝酸盐及亚硝酸盐含量的实际应用效果。
如表5所示，选取的市售肉制品都含有一定量的硝酸盐和亚硝酸盐。硝酸盐含量在1.4270-37.0629mg/kg，其中仅有猪肉脯含量高于国家限定最大残留量(30mg/kg)。此外，酱牛肉、肉松和烤鸭中硝酸盐含量也有检出，但均未超标。亚硝酸盐含量在0.0468-10.6934mg/kg，其中无淀粉火腿含量最高，但低于国家限定最大残留量(30mg/kg)。
表5畜禽肉制品中硝酸盐及亚硝酸盐含量
1.一种畜禽肉及其制品中硝酸盐和亚硝酸盐的检测方法，其特征在于，包含以下步骤：
(1)样品前处理：称取畜禽肉的均质样品，加水超声萃取，水浴加热，取出后冷却至室温，加入有机溶剂，充分混合后静置，离心，取上清液依次过0.22μm滤膜、rp柱和na柱，待用；
(2)标准曲线的制作：将硝酸根及亚硝酸根离子的标准系列工作液分别注入离子色谱仪中，得到各浓度标准工作液色谱图，测定相应的峰面积，以硝酸根及亚硝酸根离子质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制硝酸根及亚硝酸根离子的标准曲线；
(3)待测溶液的含量测定：将空白溶液和待测溶液注入离子色谱仪中，得到空白和试样溶液的峰面积，根据标准曲线计算待测溶液中硝酸盐和亚硝酸盐的含量；
其中，步骤(2)和(3)中离子色谱条件为：色谱柱选择阴离子分析色谱柱，柱温为25-40℃；流速为0.5-5ml/min；淋洗液为氢氧化钾溶液。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中的畜禽肉选自猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉或鸭肉。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中超声萃取的温度为30-50℃，超声萃取时间为20-40min。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中水浴加热温度为60-80℃，水浴加热时间为2-10min。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中有机溶剂选自二氯甲烷、丙酮、乙腈或其组合。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中均质样品与有机溶剂的质量体积比为1g：1-10ml。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(2)和(3)中柱温为30℃。
8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(2)和(3)中淋洗液流速为1ml/min。
9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(2)和(3)中阴离子分析色谱柱为dionexionpactmas11-hcrfictmanalytical型离子色谱分析柱。
10.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(2)和(3)中氢氧化钾淋洗液的洗脱梯度为：①5mmol/l，40-50min；②60mmol/l，5-15min；③5mmol/l，5-15min。
技术总结