本发明属于玉米耐旱鉴定技术领域，具体涉及一种用于玉米萌发期耐旱鉴定的方法。
背景技术：
20世纪以来，干旱在全球范围日益严重，引起了土壤水分短缺，温度变化大等一系列环境问题。干旱是制约农业及社会发展的主要因素之一，中国干旱、半干旱地区面积大约占全国土地面积的一半。玉米是主要的粮食和饲料作物之一，干旱使玉米产量减少20％-30％，严重时可达到50％以上。中国的玉米大部分都种植在东北、华北、西南和西北的旱地上，因此，干旱更是导致中国玉米产量变化的主要因素。玉米在苗期遇干旱，会出现出苗能力下降、保苗率降低等问题，严重影响田间苗数，从而导致减产。选育抗旱玉米品种，提高玉米品种的抗旱能力，是解决玉米减产的有效途径，也是保证玉米稳产或增产的重要措施。因此，评价玉米品种的抗旱性和筛选抗旱品种是进行玉米抗旱育种的重要问题。
萌发期受到干旱胁迫，会导致幼苗生长受阻、芽势弱、发根量少且根短、苗弱、成活率低，并将严重影响子粒的生长发育及最终产量。开展耐旱性状筛选及耐旱性评价是筛选耐旱资源、选育耐旱品种的关键。因此，开展玉米萌发期耐旱鉴定适宜种子半萌发土壤含水量(mediangerminationsoilwatercontent,gw50)、适宜指标的筛选并开展耐旱性综合评价具有极其重要的意义。
萌芽期抗旱鉴定具有时间短、容量大、重复性强、易于活体鉴定、破坏小、环境影响小等优点。近年来，国内外针对玉米萌发期耐旱性鉴定开展了许多研究，普遍采用聚乙二醇(peg)模拟干旱，设置1、2或3个胁迫浓度，将形态和生理指标相结合，利用单指标多重比较或者结合隶属函数法赋予各指标权重系数，对供试玉米自交系和杂交种的种子萌发期耐旱性进行综合评价。当然，也有少数研究者把种子萌发期和苗期作为一个时期，结合两个时期的耐旱性鉴定结果综合评价材料的耐旱性。此外，董志强等开展了沙培和纸培对发芽率影响的比较研究，张文英等从玉米抗旱性的系统性和整体性出发，采用灰色关联度和聚类分析方法筛选萌发期简便、易测的指标。
前人开展玉米萌发期耐旱性研究，基本上使用peg-6000作为胁迫介质进行模拟试验，这种方法会导致植物组织快速脱水，而且peg本身会被植物吸收，导致此类方法鉴定结果与实际田间情况相差甚远，因此具有一定的争议。同时，利用单指标鉴定抗旱性极易受到环境的影响，而仅仅利用隶属函数法进行多指标评价时又会因为各指标间存在程度不同的相关性，导致各单项指标提供的信息发生重叠，不易得出简明的规律，影响耐旱鉴定效果。鉴于目前使用土壤进行萌发期干旱鉴定还鲜有报道，处理方法还未确立。另外，萌发期耐旱鉴定使用的性状指标多种多样，对萌发期耐旱鉴定评价的关键性状指标还没有统一的认识。
技术实现要素：
本发明的目的意在真实模拟大田生长环境，所鉴定出的耐旱种质与大田数据吻合度较高，能真实反应种质的耐旱情况；将logistic方程引入实验中，符合玉米萌发期生长规律，可靠程度高，所鉴定出的耐旱优异种质能够用于抗旱品种筛选与种质改良。
本发明是通过以下技术方案实现的。
一种用于玉米萌发期耐旱鉴定的方法，包括以下操作步骤：
(1)种子处理：将已通过国审或省审并商业化的玉米杂交种进行消毒处理；
(2)鉴定所需土壤制备：取耕层土壤，自然状态下充分风干，再将土壤粉碎后用20目细筛去除杂质，烘干至完全干燥状态后，将土壤称重并加入定量蒸馏水，将其调至干旱鉴定所需土壤含水量，设置土壤含水量梯度15.0％、15.5％、16.0％、16.5％、17.0％、17.5％、18.0％、18.5％、19.0％、19.5％、20.0％、20.5％、21.0％(绝对土壤含水量，即加水重量/土壤干重×100％)；
(3)将消毒后的玉米杂交种在种植土壤中，标记上试验品种名称及处理水平，放入光照培养箱中25℃条件下暗培养，处理7d后测定种子发芽率，根据杂交种在不同土壤含水量下的种子发芽率求得logistic回归方程及萌发期耐旱鉴定种子半萌发率(mediangerminationsoilwatercontent,gw50)的土壤含水量；
(4)确定玉米萌发期耐旱鉴定适宜浓度后，使用该浓度对后续玉米品种进行胁迫处理，每个处理3次重复，处理7d后测定各项指标，所有数据均采用均值进行处理，统计时依据公式a:
求算耐旱系数，计算相对发芽率x1、相对胚芽鲜重x2、相对胚芽干重x3、相对胚芽长x4、相对胚根鲜重x5、相对胚根干重x6、相对胚根长x7、相对胚根数x8、种子鲜重x9、种子干重x10、相对贮藏干物质转运率x11,用公式b:
求得每一基因型各综合指标的隶属函数值，式中xj表示第j个综合指标；xmin表示第j个综合指标的最小值；xmax表示第j个综合指标的最大值，
在公式c:
中，wj表示第j个综合指标在所有综合指标中的重要程度即权重；pj为各基因型第j个综合指标的贡献率，
在公式d:
中，d值为各基因型在干旱胁迫条件下用综合指标评价所得的耐旱性综合评价值；
(5)对y值用x-0.5246s和x 0.5246s2个分点分为3个等级，使1-3级的出现概率分别为30％、40％和30％，其中，x代表y值的平均值，s代表y值的标准差。
具体地，上述步骤(1)中，种子消毒处理的操作为：将玉米杂交种用1‰的升汞消毒10分钟后取出，用蒸馏水反复冲洗3次，水分晾干后待用。
具体地，上述步骤(3)中，玉米杂交种在种植土壤中的具体操作为：将玉米杂交种均匀轻按入土壤中，覆盖7cm自然风干表土，加盖以减少塑料桶内的水分蒸发。
具体地，上述步骤(4)中，贮藏物质运转率＝(芽 根)干重/(芽 根 种子)干重×100％，取平均值，结果保留整数位。
具体地，上述步骤(4)和步骤(5)中，用spss21.0软件完成萌发期耐旱相关指标的统计分析、相关性分析、主成分分析、回归分析、聚类分析和概率分级。
由以上的技术方案可知，本发明的有益效果：
本发明提供的一种用于玉米萌发期耐旱鉴定的方法，可以科学、规范、精准地鉴定出玉米萌发期耐旱性强弱；同时此实验不受环境及时间限制，可在实验室内随时进行，可重复性好；本发明的鉴定结果真实可靠，可以为培育及改良耐旱杂交种提供优异种质。
附图说明
图1为种子发芽率拟合的logistic方程。
图2为玉米萌发期耐旱相关指标的相关性分析与频数分布，*、**分别表示在5％和1％水平显著性，ns：不显著。
图3为36份基因型萌发期耐旱性聚类分析。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本实施例中测定指标及方法：
遵照中华人民共和国国家标准gb/t5520-2011《粮油检验籽粒发芽试验》，以萌发出的幼根达到粒长、幼芽达到粒长1/2为发芽标准。
种子发芽率(germinationrate,gr)＝第8d发芽的种子数/供试种子总数×100％，3次重复，取平均值，结果保留整数位。
胚根长(radiclelength,rl)：游标卡尺测量第8d的种子胚根长度。3次重复，取平均值，结果保留到0.1。
胚芽长(germlength,gl)：游标卡尺测量第8d的种子胚芽长度。3次重复，取平均值，结果保留到0.1。
种子鲜重(seedfreshweigh,sfw)、胚芽鲜重(germfreshweigh,gfw)、胚根鲜重(radiclefreshweigh,rfw)：第8d选取长势一致的发芽种子，去土洗净处理后，电子天平称量测定种子、芽、根鲜重指标，取平均值，结果保留到0.01。
种子干重(seeddryweigh,sdw)、胚芽干重(germdryweigh,gdw)、胚根干重(radicledryweigh,rdw)：完成鲜重指标测定后，将试验材料各自用牛皮纸袋分装并放入105℃烘箱内杀青20min，80℃下烘干至恒重后电子天平称重即为干重，取平均值，结果保留到0.01。
胚根数(radiclenumber,rn)：第8d选取长势一致的发芽种子，去土洗净处理后，人工查根数并记录，取平均值，结果保留到0.1。
贮藏物质运转率(storagematerialtransportrate,smtr)＝(芽 根)干重/(芽 根 种子)干重×100％，取平均值，结果保留整数位。
实施例1
一种用于玉米萌发期耐旱鉴定的方法，包括以下操作步骤：
(1)种子处理：将已通过国审或省审并商业化的玉米杂交种进行消毒处理，消毒处理的具体操作为：玉米杂交种用0.1％的hgcl2消毒10分钟后取出，用蒸馏水反复冲洗3次，水分晾干后待用；
(2)鉴定所需土壤制备：取耕层土壤，自然状态下充分风干，再将土壤粉碎后用20目细筛去除杂质，烘干至完全干燥状态后，将土壤称重并加入定量蒸馏水，将其调至干旱鉴定所需土壤含水量，设置土壤含水量梯度15.0％、15.5％、16.0％、16.5％、17.0％、17.5％、18.0％、18.5％、19.0％、19.5％、20.0％、20.5％、21.0％(绝对土壤含水量，即加水重量/土壤干重×100％)；
(3)将消毒后的玉米杂交种种在种植土壤中，标记上试验品种名称及处理水平，放入光照培养箱中25℃条件下暗培养，处理7d后测定种子发芽率，根据杂交种在不同土壤含水量下的种子发芽率求得logistic回归方程及萌发期耐旱鉴定种子半萌发率土壤含水量(gw50)，玉米杂交种种植的具体操作为：将玉米杂交种均匀轻按入土壤中，覆盖7cm自然风干表土，加盖以减少塑料桶内的水分蒸发；
本实施例以郑单958、京科968、登海605、吉单551、优迪919五份商业化玉米杂交种为试验材料，从表1中可以看出，土壤含水量低于17.0％，种子不萌发；土壤含水量达到20.0％时，发芽率接近100％，整体上看，培养7d后不同品种的种子发芽率随着土壤含水量的增加而显著提高，五份杂交种在不同土壤含水量下的种子发芽率求得logistic回归方程及萌发期耐旱鉴定胁迫强度下种子半萌发率土壤含水量(gw50)见表2，从拟合的logistic回归方程可得出，5份杂交种的gw50在18.20～18.65％之间，r2在0.978～0.992之间，与试验过程中的表现相符。
表1不同土壤含水量对玉米杂交种发芽率的影响
表25份杂交种在不同土壤含水量下的种子发芽率logistic方程及相关参数
从图1可以看出，随着土壤含水量的增加，不同品种的种子发芽率均显著提高，呈明显的“s”型曲线，但5份杂交种的拟合度、“s”型曲线以及求算出的gw50均略有不同。最终，取其平均将玉米萌发期耐旱鉴定种子半萌发率下土壤含水量，即玉米萌发期耐旱鉴定适宜浓度确立为18.5％；
(4)确定玉米萌发期耐旱鉴定适宜浓度后，使用该浓度对后续玉米品种进行胁迫处理，每个处理3次重复，处理7d后测定各项指标，所有数据均采用均值进行处理，统计时依据公式a:
求算耐旱系数，计算相对发芽率x1、相对胚芽鲜重x2、相对胚芽干重x3、相对胚芽长x4、相对胚根鲜重x5、相对胚根干重x6、相对胚根长x7、相对胚根数x8、种子鲜重x9、种子干重x10、相对贮藏干物质运转率x11,用公式b:
求得每一基因型各综合指标的隶属函数值，式中xj表示第j个综合指标；xmin表示第j个综合指标的最小值；xmax表示第j个综合指标的最大值，
在公式c:
中，wj表示第j个综合指标在所有综合指标中的重要程度即权重；pj为各基因型第j个综合指标的贡献率，
在公式d:
中，d值为各基因型在干旱胁迫条件下用综合指标评价所得的耐旱性综合评价值，
根据干旱处理和对照测试结果计算胁迫处理后各单项性状dtc，依据萌发期36份材料(表3中的序号1-36)、11项鉴定指标的统计分析(表4)，在18.5％土壤含水量的干旱胁迫下，各品种的指标最小值变幅为0.08～1.00，最大值变幅为0.45～1.68，均值变幅为0.20～1.29，变异系数变幅为0.09～0.47。从表4可知，萌发期处理后除x9(种子鲜重)、x10(种子干重)外，其余指标平均值都小于1，说明这些性状都受到了干旱胁迫不同程度的抑制作用。其中，x1(相对发芽率)平均值为58％，这与2.1中提出的土壤含水量为18.53％时达到耐旱鉴定的半胁迫强度这一结论相吻合；x2(胚芽鲜重)、x3(胚芽干重)、x4(胚芽长)这三个地上指标的平均值均小于30％，x11(贮藏物质运转率)的平均值为0.35，说明上述指标在干旱胁迫下受到较明显的抑制。由变异系数变化范围可知，11个指标在36个品种中变异程度并不一致，变异系数越大则变异程度越大，说明该指标对干旱胁迫越敏感，反之则受影响越小。如x3(胚芽干重)变异系数最大，因而品种间差异最大，表明x3对干旱胁迫最为敏感；x10(种子干重)变异系数最小，因而在品种间的差异最小，说明x10对干旱胁迫最不敏感。基于各鉴定指标相对值变异系数的大小，11个鉴定指标对干旱胁迫的敏感程度由大到小依次为：x3＞x4＞x5＞x2＞x11＞x6＞x1＞x7＞x8＞x10＞x9；
表3玉米萌发期耐旱鉴定的杂交种
表4玉米萌发期耐旱相关指标的耐旱系数及其统计分析
如图2所示，从36份材料在干旱胁迫后耐旱系数间的相关系数，除rn这个性状外，其余性状都至少与一个其它性状呈显著或极显著相关，其中gr仅与sfw呈显著正相关，表明玉米种子发芽率越高，芽鲜重越大；sfw与sdw、rfw、rl、smtr成显著正相关，与sl呈极显著正相关(相关系数为0.91)，与sdw呈显著负相关，表明芽鲜重越大，芽干重、根鲜重、根长、贮藏物质运转率越大，而种子干重越小。sdw与gl呈显著正相关，与rfw、rdw和smtr呈极显著正相关(相关系数为别为0.61、0.74、0.87)，与sfw呈极显著负相关(相关系数为-0.53)。表明胚芽干重越大，胚芽长、胚根鲜重、胚根干重和贮藏物质运转率越大，而种子鲜重越小。gl与rfw、rl、sdw和smtr呈显著正相关，表明胚芽越长，胚根鲜重、胚根长、种子干重和贮藏物质运转率越大。rfw与rdw和smtr呈极显著正相关(相关系数分别为0.66、0.62)，与rl显著正相关。表明胚根鲜重越大，胚根干重、胚根长和贮藏物质运转率越大。rdw与sfw呈极显著负相关(相关系数为-0.53)，与smtr呈极显著正相关(相关系数为0.87)，表明胚根干重越大，贮藏物质运转率越大，而种子鲜重越小。sfw与sdw呈极显著正相关(相关系数为0.49)，与smtr呈极显著负相关(相关系数为-0.61)，表明种子鲜重越大，种子干重越大，而贮藏物质运转率越小。sdw与smtr呈极显著负相关(相关系数为-0.38)，表明种子干重也大，贮藏物质运转率越小。因此，即使利用隶属函数法等方法进行多指标评价时也会因为各指标间存在一定程度的相关性，导致信息重叠，而影响耐旱鉴定效果，因此，直接利用这些指标很难客观、准确地评价各基因型间的耐旱性。
(5)对y值用x-0.5246s和x 0.5246s2个分点分为3个等级，使1-3级的出现概率分别为30％、40％和30％，其中，x代表y值的平均值，s代表y值的标准差，
如表5所示，利用spss软件对萌发期干旱胁迫各11个性状的耐旱系数进行主成分分析(表5)，前4个综合指标的累计贡献率达到了80.46％，前4个综合指标能代表11个单项指标的绝大部分信息，可以分别用这4个主成分对36份材料萌发期耐旱性进行概括分析。第一主成分的贡献率为39.04％，决定第一主成分大小的主要是芽干重、根鲜重、根干重、根长、种子鲜重及干物质转运率。第二主成分的贡献率为17.69％，决定第二主成分大小的是芽鲜重和芽长。第三主成分的贡献率为13.88％，决定第三主成分大小的是发芽率和种子干重。第四主成分的贡献率为9.84％，决定第四主成分大小的是根数。
表5玉米萌发期干旱主成分特征向量及贡献值
根据公式b计算出各基因型干旱胁迫后所有综合指标的隶属函数值，根据各综合指标贡献率的大小，用公式c可计算出4个综合指标的权重，根据各基因型各综合指标的u值和权重，利用公式d获得各基因型耐旱性综合评价d值。根据d值可以判断各基因型的萌发期耐旱性强弱,如图3，采用欧氏距离法对萌发期耐旱d值分别进行聚类分析，可以将36个基因型划分为3类。吉农大819、优迪919、吉单551、禾田4号等15份材料为一类，属于不耐旱型，占试验群体的41.7％；金园15、鹏玉1号、先玉335、吉单56、迪卡159等16份材料为一类，属于中度耐旱型，占试验群体的44.4％；吉单50、吉通808、吉单96、吉单511、吉单558这5份材料为一类，属于高度耐旱型，占试验群体的13.9％，为分析耐旱鉴定指标与耐旱性之间的关系，筛选耐旱鉴定指标，建立耐旱性评价的数学模型，进行耐旱性预测，对萌发期干旱处理各11个鉴定指标进行了逐步回归分析，以耐旱性综合评价值(d值)作因变量，各单项指标耐旱系数作自变量建立最优回归方程，回归方程y＝-0.319 0.46x11 0.471x2 0.288x3 0.315x5 0.178x1(f＝140.320**，r2＝0.959)，回归方程中，入选的指标对相应耐旱性综合评价值都有显著影响，方程都达到极显著水平，利用这个方程可以对玉米萌发期耐旱型进行预测，可靠性达到95.9％。
遵照已建立的回归方程，以64份杂交种为试材(表3中的序号37-100)，仅测定回归方程中所涉及的相对发芽率(x1)、相对胚芽鲜重(x2)、相对胚芽干重(x3)、相对胚根鲜重(x5)、相对贮藏干物质转运率(x11)5项指标。基于所确立的回归方程(y＝-0.319 0.46x11 0.471x2 0.288x3 0.315x5 0.178x1)，计算100份杂交种的y值。y值为0.30±0.18，最小为0.07，最大为0.89，按照x-0.5246s和x 0.5246s2个分点分为3个等级，结果见表6。1-3级的份数分别为29、39、32，比较符合理论的30％、40％和30％的概率分布：
表6玉米萌发期综合耐旱指数评价表
由本实施例可知，以土壤为介质真实模拟大田种植条件，通过拟合logistic生长模型确立玉米萌发期耐旱鉴定种子半萌发率下土壤含水量为18.5％，将logistic方程引入实验中，符合玉米萌发期生长规律，可靠程度高，在该干旱胁迫强度下，将萌发期干旱胁迫11个单项指标综合成为4个相互独立的综合指标。基于耐旱性综合评价d值，将36份杂交种聚类成耐旱能力有差异的3类，高度耐旱5份、中度耐旱16份和干旱敏感15份，建立最优回归方程y＝-0.319 0.46x11 0.471x2 0.288x3 0.315x5 0.178x1，并继续完成64份杂交种的萌发期耐旱性预测。基于100份材料的y值，建议性提出3级分级标准，用高耐、中耐、敏感来描述耐旱性强弱；y>0.40为高耐，0.21<y<0.40为中耐，y<0.21为敏感，本实施例中，所鉴定出的耐旱种质与大田数据吻合度较高，能真实反应种质的耐旱情况；所鉴定出的耐旱优异种质能够用于抗旱品种筛选与种质改良。
当然，上述说明并非是对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例，本技术领域的普通技术人员，在本发明的实质范围内，作出的变化、改变、添加或替换，都应属于本发明的保护范围。
1.一种用于玉米萌发期耐旱鉴定的方法，其特征在于，包括以下操作步骤：
(1)种子处理：将已通过国审或省审并商业化的玉米杂交种进行消毒处理；
(2)鉴定所需土壤制备：取耕层土壤，自然状态下充分风干，再将土壤粉碎后用20目细筛去除杂质，烘干至完全干燥状态后，将土壤称重并加入定量蒸馏水，将其调至干旱鉴定所需土壤含水量，设置土壤含水量梯度15.0％、15.5％、16.0％、16.5％、17.0％、17.5％、18.0％、18.5％、19.0％、19.5％、20.0％、20.5％、21.0％(绝对土壤含水量，即加水重量/土壤干重×100％)；
(3)将消毒后的玉米杂交种种在种植土壤中，标记上试验品种名称及处理水平，放入光照培养箱中25℃条件下暗培养，处理7d后测定种子发芽率，根据杂交种在不同土壤含水量下的种子发芽率求得logistic回归方程及萌发期种子半萌发土壤含水量；
(4)确定玉米萌发期耐旱鉴定适宜浓度后，使用该浓度对后续玉米品种进行胁迫处理，每个处理3次重复，处理7d后测定各项指标，所有数据均采用均值进行处理，统计时依据公式a:
求算耐旱系数，计算相对发芽率x1、相对胚芽鲜重x2、相对胚芽干重x3、相对胚芽长x4、相对胚根鲜重x5、相对胚根干重x6、相对胚根长x7、相对胚根数x8、种子鲜重x9、种子干重x10、相对贮藏干物质转运率x11,用公式b:
求得每一基因型各综合指标的隶属函数值，式中xj表示第j个综合指标；xmin表示第j个综合指标的最小值；xmax表示第j个综合指标的最大值，
在公式c:
中，wj表示第j个综合指标在所有综合指标中的重要程度即权重；pj为各基因型第j个综合指标的贡献率，
在公式d:
中，d值为各基因型在干旱胁迫条件下用综合指标评价所得的耐旱性综合评价值；
(5)对y值用x-0.5246s和x 0.5246s2个分点分为3个等级，使1-3级的出现概率分别为30％、40％和30％，其中，x代表y值的平均值，s代表y值的标准差。
2.根据权利要求1所述的一种用于玉米萌发期耐旱鉴定的方法，其特征在于，上述步骤(1)中，种子消毒处理的操作为：将玉米杂交种用0.1％的hgcl2消毒10分钟后取出，用蒸馏水反复冲洗3次，水分晾干后待用。
3.根据权利要求1所述的一种用于玉米萌发期耐旱鉴定的方法，其特征在于，上述步骤(3)中，玉米杂交种种植的具体操作为：将玉米杂交种均匀轻按入土壤中，覆盖7cm自然风干表土，加盖减少塑料桶内的水分蒸发。
4.根据权利要求1所述的一种用于玉米萌发期耐旱鉴定的方法，其特征在于，上述步骤(4)中，贮藏物质运转率＝(芽 根)干重/(芽 根 种子)干重×100％，取平均值，结果保留整数位。
5.根据权利要求1所述的一种用于玉米萌发期耐旱鉴定的方法，其特征在于，上述步骤(4)和步骤(5)中，用spss21.0软件完成萌发期耐旱相关指标的统计分析、相关性分析、主成分分析、回归分析、聚类分析和概率分级。
技术总结