本发明属于临床诊断
技术领域：
，具体涉及一种蛋白质质控芯片的稳定剂及制备蛋白质质控芯片的方法。
背景技术：
：生物芯片技术是生物工程学的一项革命性的新技术，具体是指通过微加工技术和微电子技术在固相基质表明构建的微型生物化学分析系统，以实现对生命机体的组织、细胞、蛋白质、核酸、糖类以及其他生物组分的准确、快速与大信息量的检测。自1998年美国宣布正式启动基因芯片计划依赖，生物芯片技术的理论研究与实际应用在国内外迅速发展，已经成为人们获取相关信息的重要手段之一。生物芯片技术是生命科学研究中继基因克隆技术、基因自动测序技术、pcr技术后的又一次革命性技术突破，在生物、医学、食品、环境科学等领域具有十分广阔的应用前景。生物芯片种类繁多，就目前为止有基因芯片、蛋白质芯片、组织芯片、细胞芯片、微路流芯片、糖芯片等。蛋白质芯片是一种新型的生物芯片。是由固定于不同种类支持介质上的蛋白微阵列组成，阵列中固定分子的位置及组成是已知的。用未经标记或标记(荧光物质、酶或化学发光物质等标记)的生物分子与芯片上的探针进行反应，然后通过特定的扫描装置进行检测，结果由计算机分析处理。蛋白质芯片具有特异性强、敏感性高、通量高、应用性强等特点。近年来，微阵列蛋白芯片已经在蛋白质组的功能研究、疾病诊断以及药物开发中显示出巨大的潜力。如可用于分析抗原-抗体、蛋白-蛋白、蛋白-核酸、蛋白-脂质、蛋白-小分子以及酶-底物间的相互作用等。蛋白质芯片技术是由芯片制作、样品制备、生物学反应、信号的检测与分析4个环节组成。制作蛋白质芯片是利用蛋白质芯片技术检测相应抗原、抗体、底物、受体、小分子的关键步骤之一。通常先将已知特性的蛋白质通过阵列点样仪准确、快速、定量、有序地点加在玻璃片、硅片、膜或云母片等载体表面。经干燥、洗涤和封闭后即制成蛋白质芯片。体外诊断试剂的批间稳定性至关重要，制备出形貌规则、稳定性强的质控芯片，可用于试剂盒的批间控制以及生物芯片阅读仪成像系统的定期校准。但是按照普通的封闭(3％bsa)工艺，则容易造成拖尾，导致芯片上的圆点不规则，不适合用于试剂盒的批间控制以及生物芯片阅读仪的定期校准。另外，常规制备的微阵列质控芯片，微阵列质控芯片的信号值在4℃下仅可稳定2个月，室温情况下仅稳定3天，37℃下十分不稳定。技术实现要素：有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术中存在的蛋白质质控芯片形貌不规则有拖尾、稳定性差的问题提供一种蛋白质质控芯片的稳定剂及制备蛋白质质控芯片的方法，能够解决质控芯片拖尾的现象且提高质控芯片的稳定性。为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：一种蛋白质质控芯片的稳定剂，包含乙烯基甲醚与马来酸单酯的交替共聚物和有机溶剂。其中，所述的稳定剂中所述乙烯基甲醚与马来酸单酯的交替共聚物为聚(乙烯基甲醚-alt-马来酸单乙酯)、聚(乙烯基甲醚-alt-马来酸单丁酯)或聚(乙烯基甲醚-alt-马来酸单异丙基酯)。在一些实施方案中，所述的稳定剂中所述有机溶剂为无水乙醇、异丙醇、氯仿、甲醇。在本发明所述稳定剂中，按g/ml计，所述乙烯基甲醚与马来酸单酯的交替共聚物与有机溶剂的质量体积比为1∶(4-8)。本发明还提供了上述的稳定剂的制备方法，具体为乙烯基甲醚与马来酸单酯的交替共聚物加入有机溶剂剧烈震荡10分钟至完全溶解。本发明还提供了一种制备蛋白质质控芯片的方法，将蛋白抗原及参考点蛋白点样于芯片基质上，进行芯片固定、封闭、稳定、参考品孵育、酶结合物孵育、芯片底物孵育、上述稳定剂稳定、烘干。在本发明中，所述封闭前还包括2％(g/ml)酪蛋白雾化封闭的步骤。所述2％(g/ml)酪蛋白为2g酪蛋白加入100ml水中溶解。进一步的，所述雾化封闭的喷雾量为5μl，雾化时间5秒。在本发明中，所述制备蛋白质质控芯片的方法，所述蛋白抗原为糖尿病特异抗原、特发性膜性肾病特异抗原或幽门螺杆菌特异抗原。在一些实施方案中，所述糖尿病特异抗原为gad重组蛋白、ia-2重组蛋白、ica重组蛋白、znt8重组蛋白和/或ins重组蛋白。在一些实施方案中，所述特发性膜性肾病特异抗原为pla2r重组蛋白和/或thsd7a重组蛋白。在一些实施方案中，所述幽门螺杆菌特异抗原为caga重组蛋白、vaca重组蛋白、urea重组蛋白和/或ureb重组蛋白。在本发明中，所述制备蛋白质质控芯片的方法中所述封闭后的稳定为用liquidplate进行稳定。具体为每孔加入100μlliquidplate室温(20-25℃)稳定30min，甩出液体。在本发明中，所述制备蛋白质质控芯片的方法中所述稳定剂稳定为各孔加入上述稳定剂(高分子稳定剂)50μl，37℃烘干2h。由上述技术方案可知，本发明提供了一种蛋白质质控芯片的稳定剂及制备蛋白质质控芯片的方法。本发明所述蛋白质质控芯片的稳定剂包含乙烯基甲醚与马来酸单酯的交替共聚物和有机溶剂。采用本发明所述稳定剂对蛋白质质控芯片进行稳定，解决了质控芯片拖尾的现象和质控芯片常温不稳定的问题，可制备出形貌规则、稳定性好的质控芯片，且质控芯片在37℃下可至少稳定1年，2～8℃可以稳定数年。制得的形貌规则、稳定性好的质控芯片可作为参照对试剂盒进行批间控制，亦可对仪器成像系统进行定期校准。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1-12示实施例2雾化封闭的结果图；图13-24示实施例2常规封闭(非雾化封闭)的结果图。具体实施方式本发明公开了一种蛋白质质控芯片的稳定剂及制备蛋白质质控芯片的方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。实施例1、微阵列质控芯片检测糖尿病自身抗体本发明中微阵列质控芯片的制备包括：通过点样仪将糖尿病的5种重组抗原以及一些参考点蛋白以一定的点阵列点样于芯片基质上，通过芯片固定，雾化封闭、封闭、稳定，参考品孵育，酶结合物孵育，芯片底物孵育，高分子稳定，烘干等步骤组成。1、配制点样缓冲液1.1配置点样缓冲液配制1000mltris点样缓冲液：在烧杯中称取tris2.42g，海藻糖100g，加入150ml丙三醇，加入1ml的proclin300，用量筒量取550ml纯化水倒入烧杯中，放入搅拌转子，并放到磁力搅拌器上搅拌至完全溶解。用校准后的ph计测量上述溶液的ph，用2m的hcl或2m的naoh调ph至8.50±0.20，定容至1000ml。配制1000mlpbs点样缓冲液：在烧杯中称取kh2po40.24g，na2hpo41.44g，kcl0.20g，nacl8.00g，海藻糖100g，加入150ml丙三醇，加入1ml的proclin300，用量筒量取550ml纯化水倒入烧杯中，放入搅拌转子，并放到磁力搅拌器上搅拌至完全溶解。用校准后的ph计测量上述溶液的ph，用2m的hcl或2m的naoh调ph至7.40±0.10，定容至1000ml。配制1000mlcb点样缓冲液：称取na2co31.59g，nahco32.93g，加入150ml甘油，加入100g海藻糖，加入1ml的proclin300，用量筒量取550ml纯化水倒入烧杯中，放入搅拌转子，并放到磁力搅拌器上搅拌至完全溶解。用校准后的ph计测量上述溶液的ph，用2m的hcl或2m的naoh调整ph至9.60±0.20，定容至1000ml。1.2点样液配制点名称点样浓度(μg/ml)点样缓冲液gad重组蛋白点40pbs点样缓冲液ia-2重组蛋白点60pbs点样缓冲液ica重组蛋白点12pbs点样缓冲液znt8重组蛋白点20tris点样缓冲液ins重组蛋白点80cb点样缓冲液样品质控点(sc)1cb点样缓冲液临界值对照点(co)0.13cb点样缓冲液 hba(30μg/ml)阴性对照点(nc)0.02cb点样缓冲液 hba(30μg/ml)位置参考点/阳性对照点(sc/pc)1.5cb点样缓冲液a)抗原点样液配制：分别取gad重组蛋白、ia-2重组蛋白、ica重组蛋白、znt8重组蛋白、ins重组蛋白，用上表中相应的点样缓冲液稀释到各点样浓度浓度，得到相应抗原点点样液；b)位置参考点(pr)点样液配制：分别取所需量的人igg抗体，分别用0.05mph9.6碳酸盐点样缓冲液(cb，含15％甘油)稀释到浓度1.5μg/ml，得到位置参考点pr点样液与阳性对照点pc；注：该位置参考点(pr)与阳性对照点(pc)相同；c)样品质控点(sc)点样液配制：分别取所需量的兔抗人igg，分别用0.05mph9.6碳酸盐点样缓冲液(cb，含15％甘油)稀释到浓度1μg/ml，得到位置参考点sc点样液。d)阴性对照点(nc)点样液配制：分别取所需量的人igg抗体，分别用0.05mph9.6碳酸盐点样缓冲液(cb，含30μg/mlhba，15％甘油)稀释到浓度0.02μg/ml，得到阴性对照点(nc)点样液；e)临界值对照点(co)点样液配制：分别取所需量的人igg抗体，分别用0.05mph9.6碳酸盐点样缓冲液(cb，含30μg/mlhba，含15％甘油)稀释到浓度0.13μg/ml，得到临界值对照点(co)点样液；按如下格式阵列点样：prgadia2pricacopr/pcscznt8concpriaacopr2、芯片点样：使用biodotad6200芯片点样仪按照20nl的点样体积在96孔板中进行点样。3、芯片固定点样结束后取出96孔板芯片，放入冰箱(2-8℃环境下)，固定18-22h。4、芯片封闭与稳定4.1配制洗涤液10×浓缩洗涤液100ml：称取nacl2.422g、tris8.766g并用纯化水溶解，加入110μlproclin300，50μl吐温20混匀后，调节ph至7.2±0.2，加入2％(w/v)酪蛋白40ml，再次调节ph至7.2±0.2并用纯化水定容到100ml。pbs1000ml：称取na2hpo4·12h2o2.9006g、nah2po4·2h2o0.2964g、nacl8.766g、调节ph至7.2±0.2并用纯化水定容到1000ml。4.2、雾化封闭取出完成固定的96孔板芯片，对96孔采用2％(g/ml)酪蛋白喷雾封闭，每孔喷雾量5μl，雾化时间5秒钟。4.3洗板10×浓缩洗涤液稀释10倍后得到洗涤液，用洗涤液洗板2次，洗好后拍干。4.4封闭用2％(w/v)酪蛋白封闭，每孔加入150μl封闭液在室温(20-25℃)下封闭1h。4.5pbs洗板甩出封闭液，每孔加入300μlpbs洗板，洗板2次，洗好后拍干。4.6稳定用liquidplate进行稳定，每孔加入100μl稳定剂室温(20-25℃)稳定30min，甩出液体。5、芯片干燥、装袋取稳定好的板放入烘箱，37±2℃干燥2h。取出板后在低湿环境下rh＜30％装入铝箔袋，并放入干燥剂，封袋待用。6、反应体系溶液配制6.1酶结合物配制每块96孔板用量为8ml。将抗人igg-hrp稀释1000倍，量取7992μl结合物稳定剂，加入8μl酶标抗体，混匀。6.2浓缩洗涤液配制10×浓缩洗涤液100ml：称取nacl8.766g、tris2.422g并用纯化水溶解，加入110μlproclin300，50μl吐温20混匀，调节ph至7.2±0.2，加入2％(w/v)酪蛋白40ml，再次调节ph至7.2±0.2，并用纯化水定容到100ml。6.3样品稀释液配制样品稀释液100ml：称取称取nacl8.766g、tris2.422g，并用纯化水溶解，加入110μlproclin300，50μl吐温20混匀后，调节ph至7.2±0.2，加入2％(w/v)酪蛋白40ml，再次调节ph至7.2±0.2，并用纯化水定容到100ml。6.4高分子稳定剂的配制取1g聚(乙烯基甲醚-alt-马来酸单乙酯)，加入4ml无水乙醇，剧烈震荡10分钟使之完全溶解即得。7、高分子修饰质控芯片制备过程7.1各反应组分平衡至室温后，将浓缩洗涤液(10×)用蒸馏水稀释10倍，待用；7.2稀释参考品：用样品稀释液稀释1份阳性参考品，稀释倍数为101倍；7.3孵育参考品：混匀后取稀释液100μl加入已平衡到室温的6个芯片反应孔中；室温反应60min；7.4洗涤：用配制好洗涤液洗涤3次，每次300μl，拍干残余液体；7.5孵育酶结合物：每孔加入酶结合物50μl，室温反应30min，用洗涤液3次，每次300μl，拍干残余液体；7.6显色与干燥：每孔加入单组份沉淀性tmb溶液50μl，室温反应30min，拍干残余液体，置于37℃鼓风干燥箱烘干30min；7.7高分子稳定：烘干后的各孔加入前述配好的50μl高分子稳定剂，37℃烘干2h。8、对照质控芯片(无高分子修饰质控芯片制备)步骤同7中高分子修饰质控芯片制备过程，但不加高分子稳定。9、稳定性试验按照高分子修饰工艺制备的6个质控芯片，2个质控芯片一组，用铝箔袋密封，分别置于2～8℃、室温(20-25℃)、37℃条件下，分别在第0个月、第0.5个月、第1个月、第3个月、第5个月、第8个月、第11个月、第12个月取出检测，进行稳定性考察；未使用高分子修饰工艺制备的6个质控芯片，2个质控芯片一组，用铝箔袋密封，分别置于2～8℃、室温(20-25℃)、37℃条件下，分别在第0个月、第0.5个月、第1个月、第3个月、第5个月、第8个月、第11个月、第12个月取出检测，进行稳定性考察，作对照试验。10、实验结果试验结果见表1-5。表1ica的微阵列质控芯片稳定性考察结果表2gad65的微阵列质控芯片稳定性考察结果表3ia-2的微阵列质控芯片稳定性考察结果表4znt8的微阵列质控芯片稳定性考察结果表5iaa的微阵列质控芯片稳定性考察结果结果显示，稳定化处理的质控芯片gad65、ia-2、znt8、ica、iaa各抗体点在2～8℃、rt、37℃储存条件下保存12个月，其检测结果没有明显下降；未经稳定化处理的质控芯片各抗体点在37℃条件下检测信号数天即完全下降，rt条件下保存的质控芯片检测信号也快速下降，2～8℃在第三个月时也有明显下降。实施例2、按照实施例1所述方法制备糖尿病自身抗体检测质控芯片，其中12个芯片为雾化封闭，12个芯片为常规封闭(非雾化封闭)，分别同时检测同一支阳性血清。观察反应结果的芯片点的形貌，同时统计除nc点以外的其他各点的cv。结果如下图1-24及表6和表7。表6雾化封闭的cv结果雾化封闭(n＝12)msdcv(％)gad65.719925.6401999％ia-2100.118710.1116310％ica104.81095.3803255％co24.6881.3064675％pc150.8356.8763315％sc49.894332.5740365％znt872.747254.9954957％co25.63851.5372926％nc4.6784170.930725n/aiaa36.310753.86719511％co24.10251.34196％表7常规封闭的cv结果常规封闭(n＝12)msdcv(％)gad68.2259211.3900317％ia-2101.250617.7758418％ica102.430816.0125916％co25.4022.6251210％pc149.373815.7461811％sc51.572756.6576813％znt871.1111.8371417％co25.260582.3915589％nc5.3190.874575n/aiaa38.571175.4477914％co23.23352.34732110％结果显示，与常规封闭相比，雾化封闭其解决了拖尾的问题，使形貌更好；而且使检测结果的cv更好，变异系数更低，提高了精密度。实施例3、微阵列质控芯片检测特发性膜性肾病自身抗体本发明中微阵列质控芯片的制备包括：通过点样仪将特发性膜性肾病的2种重组抗原以及一些参考点蛋白以一定的点阵列点样于芯片基质上，通过芯片固定，雾化封闭、封闭，参考品孵育，酶结合物孵育，芯片底物孵育，高分子稳定，烘干等步骤组成。1、配制点样缓冲液及点样液1.1配置点样缓冲液配制1000mltris点样缓冲液：在烧杯中称取tris2.42g，海藻糖100g，加入150ml丙三醇，加入1ml的proclin300，用量筒量取550ml纯化水倒入烧杯中，放入搅拌转子，并放到磁力搅拌器上搅拌至完全溶解。用校准后的ph计测量上述溶液的ph，用2m的hcl或2m的naoh调ph至8.50±0.20，定容至1000ml。配制1000mlpbs点样缓冲液：在烧杯中称取kh2po40.24g，na2hpo41.44g，kcl0.20g，nacl8.00g，海藻糖100g，加入150ml丙三醇，加入1ml的proclin300，用量筒量取550ml纯化水倒入烧杯中，放入搅拌转子，并放到磁力搅拌器上搅拌至完全溶解。用校准后的ph计测量上述溶液的ph，用2m的hcl或2m的naoh调ph至7.40±0.10，定容至1000ml。配制1000mlcb点样缓冲液：称取na2co31.59g，nahco32.93g，加入150ml甘油，加入100g海藻糖，加入1ml的proclin300，用量筒量取550ml纯化水倒入烧杯中，放入搅拌转子，并放到磁力搅拌器上搅拌至完全溶解。用校准后的ph计测量上述溶液的ph，用2m的hcl或2m的naoh调整ph至9.60±0.20，定容至1000ml。1.2点样液配制a)抗原点样液配制：分别取重组pt蛋白(recombinanthumanpla2r-thsd7a，rhpt)，用tris点样缓冲液稀释到浓度15μg/ml及重组thsd7a蛋白所需量的抗原，用pbs点样缓冲液(ph7.4)稀释浓度到7.5μg/ml，得到相应抗原点点样液；b)位置参考点(pr)点样液配制：分别取所需量的人igg抗体，分别用0.05mph9.6碳酸盐点样缓冲液(cb，含15％甘油)稀释到浓度1.5μg/ml，得到位置参考点pr点样液与阳性对照点pc；注：该位置参考点(pr)与阳性对照点(pc)相同；c)样品质控点(sc)点样液配制：分别取所需量的兔抗人igg，分别用0.05mph9.6碳酸盐点样缓冲液(cb，含15％甘油)稀释到浓度1μg/ml，得到位置参考点sc点样液。d)阴性对照点(nc)点样液配制：分别取所需量的人igg抗体，分别用0.05mph9.6碳酸盐点样缓冲液(cb，含30μg/mlhba，15％甘油)稀释到浓度0.02μg/ml，得到阴性对照点(nc)点样液；e)临界值对照点(co)点样液配制：分别取所需量的人igg抗体，分别用0.05mph9.6碳酸盐点样缓冲液(cb，含30μg/mlhba，含15％甘油)稀释到浓度0.13μg/ml，得到临界值对照点(co)点样液；按如下格式点样：2、芯片点样：使用biodotad6200芯片点样仪按照20nl的点样体积在96孔板中进行点样。3、芯片固定点样结束后取出96孔板芯片，放入冰箱(2-8℃环境下)，固定18-22h。4、芯片封闭与稳定4.1配制洗涤液10×浓缩洗涤液100ml：称取nacl2.422g、tris8.766g并用纯化水溶解，加入110μlproclin300，50μl吐温20混匀后，调节ph至7.2±0.2，加入2％(w/v)酪蛋白40ml，再次调节ph至7.2±0.2并用纯化水定容到100ml。pbs1000ml：称取na2hpo4·12h2o2.9006g、nah2po4·2h2o0.2964g、nacl8.766g、调节ph至7.2±0.2并用纯化水定容到1000ml。4.2雾化封闭取出完成固定的96孔板芯片，对96孔采用2％(g/ml)酪蛋白喷雾封闭，每孔喷雾量5μl，雾化时间5秒钟。4.3洗板10×浓缩洗涤液稀释10倍后得到洗涤液，用洗涤液洗板2次，洗好后拍干。4.4封闭用2％(w/v)酪蛋白封闭，每孔加入150μl封闭液在室温(20-25℃)下封闭1h。4.5pbs洗板甩出封闭液，每孔加入300μlpbs洗板，洗板2次，洗好后拍干。4.6稳定用liquidplate进行稳定，每孔加入100μl稳定剂室温(20-25℃)稳定30min，甩出液体。5、芯片干燥、装袋取稳定好的板放入烘箱，37±2℃干燥2h。取出板后在低湿环境下rh＜30％装入铝箔袋，并放入干燥剂，封袋待用。6、反应体系溶液配制6.1酶结合物配制每块96孔板用量为8ml。将抗人igg-hrp稀释1000倍，量取7992μl结合物稳定剂，加入8μl酶标抗体，混匀。6.2浓缩洗涤液配制10×浓缩洗涤液100ml：称取nacl8.766g、tris2.422g并用纯化水溶解，加入110μlproclin300，50μl吐温20混匀，调节ph至7.2±0.2，加入2％(w/v)酪蛋白40ml，再次调节ph至7.2±0.2，并用纯化水定容到100ml。6.3样品稀释液配制样品稀释液100ml：称取nacl8.766g、tris2.422g，并用纯化水溶解，加入110μlproclin300，50μl吐温20混匀后，调节ph至7.2±0.2，加入2％(w/v)酪蛋白40ml，再次调节ph至7.2±0.2，并用纯化水定容到100ml。6.4高分子稳定剂的配制取1g聚(乙烯基甲醚-alt-马来酸单乙酯)，加入4ml无水乙醇，剧烈震荡10分钟使之完全溶解即得。7、高分子修饰质控芯片制备过程7.1各反应组分平衡至室温后，将10×浓缩洗涤液用蒸馏水稀释10倍，待用；7.2稀释参考品：用样品稀释液稀释1份全阳性参考品，稀释倍数为101倍；7.3孵育参考品：混匀后取稀释液100μl加入已平衡到室温的6个芯片反应孔中；室温反应60min；7.4洗涤：用配制好洗涤液洗涤3次，每次300μl，拍干残余液体；7.5孵育酶结合物：每孔加入酶结合物50μl，室温反应30min，用洗涤液洗涤3次，每次300μl，拍干残余液体；7.6显色与干燥：每孔加入单组份沉淀性tmb溶液50μl，室温反应30min，拍干残余液体，置于37℃鼓风干燥箱烘干30min；7.7高分子稳定：烘干后的各孔加入前述配好的50μl高分子稳定剂，37℃烘干2h。8、对照质控芯片(无高分子修饰质控芯片制备)步骤同7中高分子修饰质控芯片制备过程，但不加高分子稳定。9、稳定性试验按照高分子修饰工艺制备的6个质控芯片，2个质控芯片一组，用铝箔袋密封，分别置于2～8℃、室温(20-25℃)、37℃条件下，分别在第0个月、第0.5个月、第1个月、第3个月、第5个月、第8个月、第11个月、第12个月取出检测，进行稳定性考察；未使用高分子修饰工艺制备的6个质控芯片，2个质控芯片一组，用铝箔袋密封，分别置于2～8℃、室温(20-25℃)、37℃条件下，分别在第0个月、第0.5个月、第1个月、第3个月、第5个月、第8个月、第11个月、第12个月取出检测，进行稳定性考察，作对照试验。10、实验结果试验结果见表8和9。表8pla2r的微阵列质控芯片稳定性考察结果表9thsd7a的微阵列质控芯片稳定性考察结果结果显示，稳定化处理的质控芯片pla2r、thsd7a抗体点在2～8℃、rt、37℃储存条件下保存12个月，其检测结果没有明显下降；未经稳定化处理的质控芯片各抗体点在37℃条件下检测信号数天即完全下降，rt条件下保存的质控芯片检测信号也快速下降，2～8℃在第三个月时也有明显下降。实施例4、微阵列质控芯片检测幽门螺杆菌本发明中微阵列质控芯片的制备包括：通过点样仪将幽门螺杆菌的4种重组抗原以及一些参考点蛋白以一定的点阵列点样于芯片基质上，通过芯片固定，雾化封闭、封闭，参考品孵育，酶结合物孵育，芯片底物孵育，高分子稳定，烘干等步骤组成。1、配制点样缓冲液1.1配置点样缓冲液配制1000mltris点样缓冲液：在烧杯中称取tris2.42g，海藻糖100g，加入150ml丙三醇，加入1ml的proclin300，用量筒量取550ml纯化水倒入烧杯中，放入搅拌转子，并放到磁力搅拌器上搅拌至完全溶解。用校准后的ph计测量上述溶液的ph，用2m的hcl或2m的naoh调ph至8.50±0.20，定容至1000ml。配制1000mlcb点样缓冲液：称取na2co31.59g，nahco32.93g，加入150ml甘油，加入100g海藻糖，加入1ml的proclin300，用量筒量取550ml纯化水倒入烧杯中，放入搅拌转子，并放到磁力搅拌器上搅拌至完全溶解。用校准后的ph计测量上述溶液的ph，用2m的hcl或2m的naoh调整ph至9.60±0.20，定容至1000ml。1.2点样液配制a)抗原点样液配制：分别取caga重组蛋白、vaca重组蛋白、urea重组蛋白、ureb重组蛋白，用tris点样缓冲液分别稀释到浓度4μg/ml、6μg/ml、6μg/ml、5μg/ml，得到相应抗原点点样液；b)位置参考点(pr)点样液配制：分别取所需量的人igg抗体，分别用0.05mph9.6碳酸盐点样缓冲液(cb，含15％甘油)稀释到浓度4μg/ml，得到位置参考点pr点样液与阳性对照点pc；注：该位置参考点(pr)与阳性对照点(pc)相同；c)样品质控点(sc)点样液配制：分别取所需量的兔抗人igg，分别用0.05mph9.6碳酸盐点样缓冲液(cb，含15％甘油)稀释到浓度3μg/ml，得到位置参考点sc点样液。d)阴性对照点(nc)点样液配制：分别取所需量的人igg抗体，分别用0.05mph9.6碳酸盐点样缓冲液(cb，含30μg/mlhba，15％甘油)稀释到浓度0.1μg/ml，得到阴性对照点(nc)点样液；e)临界值对照点(co)点样液配制：分别取所需量的人igg抗体，分别用0.05mph9.6碳酸盐点样缓冲液(cb，含30μg/mlhba，含15％甘油)稀释到浓度0.5μg/ml，得到临界值对照点(co)点样液；按如下格式阵列点样：prcagaprvacacopr/pcscureaconcprurebcopr2、芯片点样：使用biodotad6200芯片点样仪按照20nl的点样体积在96孔板中进行点样。3、芯片固定点样结束后取出96孔板芯片，放入冰箱(2-8℃环境下)，固定18-22h。4、芯片封闭与稳定4.1配制洗涤液10×浓缩洗涤液100ml：称取nacl2.422g、tris8.766g并用纯化水溶解，加入110μlproclin300，50μl吐温20混匀后，调节ph至7.2±0.2，加入2％(w/v)酪蛋白40ml，再次调节ph至7.2±0.2并用纯化水定容到100ml。pbs1000ml：称取na2hpo4·12h2o2.9006g、nah2po4·2h2o0.2964g、nacl8.766g、调节ph至7.2±0.2并用纯化水定容到1000ml。4.2、雾化封闭取出完成固定的96孔板芯片，对96孔进行喷雾封闭，每孔喷雾量5μl，雾化时间5秒钟。4.3洗板10×浓缩洗涤液稀释10倍后得到洗涤液，用洗涤液洗板2次，洗好后拍干。4.4封闭用2％(w/v)酪蛋白封闭，每孔加入150μl封闭液在室温(20-25℃)下封闭1h。4.5pbs洗板甩出封闭液，每孔加入300μlpbs洗板，洗板2次，洗好后拍干。4.6稳定用liquidplate进行稳定，每孔加入100μl稳定剂室温(20-25℃)稳定30min，甩出液体。5、芯片干燥、装袋取稳定好的板放入烘箱，37±2℃干燥2h。取出板后在低湿环境下rh＜30％装入铝箔袋，并放入干燥剂，封袋待用。6、反应体系溶液配制6.1酶结合物配制每块96孔板用量为8ml。将抗人igg-hrp稀释1000倍，量取7992μl结合物稳定剂，加入8μl酶标抗体，混匀。6.2浓缩洗涤液配制10×浓缩洗涤液100ml：称取nacl8.766g、tris2.422g并用纯化水溶解，加入110μlproclin300，50μl吐温20混匀，调节ph至7.2±0.2，加入2％(w/v)酪蛋白40ml，再次调节ph至7.2±0.2，并用纯化水定容到100ml。6.3样品稀释液配制样品稀释液100ml：称取称取nacl8.766g、tris2.422g，并用纯化水溶解，加入110μlproclin300，50μl吐温20混匀后，调节ph至7.2±0.2，加入2％(w/v)酪蛋白40ml，再次调节ph至7.2±0.2，并用纯化水定容到100ml。6.4高分子稳定剂的配制取1g聚(乙烯基甲醚-alt-马来酸单乙酯)，加入4ml无水乙醇，剧烈震荡10分钟使之完全溶解即得。7、高分子修饰质控芯片制备过程7.1各反应组分平衡至室温后，将浓缩洗涤液(10×)用蒸馏水稀释10倍，待用；7.2稀释参考品：用样品稀释液稀释1份全阳性参考品，稀释倍数为101倍；7.3孵育参考品：混匀后取稀释液100μl加入已平衡到室温的6个芯片反应孔中；室温反应60min；7.4洗涤：用配制好洗涤液洗涤3次，每次300μl，拍干残余液体；7.5孵育酶结合物：每孔加入酶结合物50μl，室温反应30min，用洗涤液3次，每次300μl，拍干残余液体；7.6显色与干燥：每孔加入单组份沉淀性tmb溶液50μl，室温反应30min，拍干残余液体，置于37℃鼓风干燥箱烘干30min；7.7高分子稳定：烘干后的各孔加入前述配好的50μl高分子稳定剂，37℃烘干2h。8、对照质控芯片(无高分子修饰质控芯片制备)步骤同7中高分子修饰质控芯片制备过程，但不加高分子稳定。9、稳定性试验按照高分子修饰工艺制备的6个质控芯片，2个质控芯片一组，用铝箔袋密封，分别置于2～8℃、室温(20-25℃)、37℃条件下，分别在第0个月、第0.5个月、第1个月、第3个月、第5个月、第8个月、第11个月、第12个月取出检测，进行稳定性考察；对2个质控芯片的相应结果平均值进行稳定性趋势考察。未使用高分子修饰工艺制备的6个质控芯片，2个质控芯片一组，用铝箔袋密封，分别置于2～8℃、室温(20-25℃)、37℃条件下，分别在第0个月、第0.5个月、第1个月、第3个月、第5个月、第8个月、第11个月、第12个月取出检测，进行稳定性考察，作对照试验。对2个质控芯片的相应结果平均值进行稳定性趋势考察。10、实验数据表10caga的微阵列质控芯片稳定性考察结果表11vaca的微阵列质控芯片稳定性考察结果表12urea的微阵列质控芯片稳定性考察结果表13ureb的微阵列质控芯片稳定性考察结果结果显示，稳定化处理的质控芯片的caga、vaca、urea及ureb抗体点在2～8℃、rt、37℃储存条件下保存12个月，其检测结果没有明显下降；未经稳定化处理的质控芯片各抗体点在37℃条件下检测信号数天即完全下降，rt条件下保存的质控芯片检测信号也快速下降，2～8℃在第三个月时也有明显下降。当前第1页1 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技术特征：1.一种蛋白质质控芯片的稳定剂，包含乙烯基甲醚与马来酸单酯的交替共聚物和有机溶剂。
2.根据权利要求1所述的稳定剂，所述乙烯基甲醚与马来酸单酯的交替共聚物为聚(乙烯基甲醚-alt-马来酸单乙酯)、聚(乙烯基甲醚-alt-马来酸单丁酯)或聚(乙烯基甲醚-alt-马来酸单异丙基酯)。
3.根据权利要求1所述的稳定剂，所述有机溶剂为无水乙醇、异丙醇、氯仿、甲醇。
4.根据权利要求1所述的稳定剂，按g/ml计，所述乙烯基甲醚与马来酸单酯的交替共聚物与有机溶剂的质量体积比为1∶(4-20)。
5.权利要求1-4任一项所述的稳定剂的制备方法乙烯基甲醚与马来酸单酯的交替共聚物加入有机溶剂剧烈震荡10分钟至完全溶解。
6.一种制备蛋白质质控芯片的方法，将蛋白抗原及参考点蛋白点样于芯片基质上，进行芯片固定、封闭、稳定、参考品孵育、酶结合物孵育、芯片底物孵育、权利要求1-4任一项所述稳定剂稳定、烘干。
7.根据权利要求6所述的方法，所述封闭前还包括2％(g/ml)酪蛋白雾化封闭的步骤。
8.根据权利要求7所述的方法，所述雾化封闭的喷雾量为5μl，雾化时间5秒。
9.根据权利要求6所述的方法，所述蛋白抗原为糖尿病特异抗原、特发性膜性肾病特异抗原或幽门螺杆菌特异抗原；所述封闭后稳定为用liquidplate进行稳定。
10.根据权利要求9所述的方法，所述糖尿病特异抗原为gad重组蛋白、ia-2重组蛋白、ica重组蛋白、znt8重组蛋白和/或ins重组蛋白；所述特发性膜性肾病特异抗原为pla2r重组蛋白和/或thsd7a重组蛋白；所述幽门螺杆菌特异抗原为caga重组蛋白、vaca重组蛋白、urea重组蛋白和/或ureb重组蛋白。
技术总结本发明属于临床诊断技术领域，公开了一种蛋白质质控芯片的稳定剂及制备蛋白质质控芯片的方法。本发明所述蛋白质质控芯片的稳定剂包含乙烯基甲醚与马来酸单酯的交替共聚物和有机溶剂。采用本发明所述稳定剂对蛋白质质控芯片进行稳定，解决了质控芯片拖尾的现象和质控芯片常温不稳定的问题，可制备出形貌规则、稳定性好的质控芯片，且质控芯片在37℃下可至少稳定1年，2～8℃可以稳定数年。制得的形貌规则、稳定性好的质控芯片可作为参照对试剂盒进行批间控制，亦可对仪器成像系统进行定期校准。
技术研发人员：王洪涛;张大准;段江磊;陈晓彤
受保护的技术使用者：深圳市伯劳特生物制品有限公司
技术研发日：2020.02.21
技术公布日：2020.06.09
