本发明属于分析检验技术领域，涉及一种免疫检测方法，具体涉及一种免清洗通用型elisa荧光免疫探针及其制备方法和应用。
背景技术：
生物标志物一般是指可供客观测定和评价的生理、病理、治疗过程中的某种特征的生化指标。通过对生物标志物的测定能够获知机体当前所处生物学过程的进程。生物标志物的检查，对于疾病的鉴定、早期诊断及预防、治疗过程的监控能够起到一定的帮助作用。
因此，寻找和发现有价值的生物标志物已经成为相关领域的研究热点，而在对生物标志物研究的过程中人们发现关键的问题是：如何提高对生物标志物检测的准确性。
在提高准确性的研究中，基于抗原-抗体特异性识别的免疫分析以其在复杂样品检测中的高灵敏、高选择性，已成功应用于各种生物标志物的检测。其中，酶联免疫吸附测定(elisa)由于其良好的选择性和灵敏度、简单的操作手法、以及可外带测试等优势在临床分析、药物分析、毒物分析等领域得到了广泛应用。但是，elisa检测过程中涉及到涂板、洗涤、封闭、孵育、检测等多个步骤，不仅劳动强度大、试剂用量多，而且耗时长，导致诊断延迟，所以应用结果较差。
因此，研究人员致力于开发更快速、更简单、更灵敏的免疫测定方法。例如，基于电化学(ecl)或表面等离子体共振(spr)的免标记免疫分析法，基于ecl或spr的竞争免疫分析法等。然而，这些新开发的方法通常需要复杂的化学反应机制，所以这些方法还需要进一步的改进和完善才能实现广泛应用。
技术实现要素：
为了弥补现有技术的不足，本发明提供了一种免清洗通用型elisa荧光免疫探针及其制备方法和应用，采用抗体(ab)标记的bcnns(ab-bcnns)为荧光探针，对目标抗原进行选择性检测，通过改变ab-bcnns中的标记抗体，可实现对不同目标抗原的选择性检测。
一种免清洗通用型elisa荧光免疫探针的制备方法，其特征在于，所述荧光免疫探针的制备方法包括以下步骤：
(1)g-c3n4粉末的合成：将1-5g双氰胺于氧化铝坩埚中，盖上盖子并用铝箔纸包裹密封，放入马弗炉中，以3℃min-1的速度升温至550℃并保持2h；待反应物冷却至室温取出，所得淡黄色固体即为g-c3n4，用玛瑙研钵将所述g-c3n4研磨成均匀固体粉末，备用；
(2)硼酸修饰：取4-羧基苯硼酸和hbtu于无水dmf中，搅拌使其溶解，并在50℃下继续搅拌30-60min，得到混合物；随后向所述混合物中加入所述g-c3n4和diea，50℃下继续搅拌12-16h完成反应；将反应后的产物离心收集，并依次用无水乙醇和二次水各清洗2-3次，60℃下烘干得bcn；
(3)用超声辅助液体剥离法将所述bcn剥离成bcn纳米片bcnns：取所述bcn于锥形瓶中，加入二次水配成浓度为1mgml-1的悬浮液；之后连续超声10h；随后将超声所得奶白色悬浮液在3000rpm转速下离心15min，收集上清；将所述上清在14000rpm转速下离心10min，收集沉淀，即为bcnns；将所述bcnns冷冻干燥后称重，配成0.2mgml-1的bcnns分散液，备用；
(4)抗体标记：将抗体用含0.5-2％bsa的pbs(ph7.2-7.6)稀释至10-100μgml-1，取50μl所述抗体加入到100μl0.2mgml-1bcnns分散液中，混合均匀后在室温下振荡反应10min，随后继续加入50μl的1-10μmoll-1葡萄糖溶液，在室温下振荡8-20min，得到混合体系；最后将所述混合体系在14000rpm转速下离心10min，保留下层沉淀并重悬于200μlpbs中，即得到抗体标记的bcnns，即为ab-bcnns。
作为一种优选的方案，步骤(1)中所述双氰胺的用量为3g。
更为优选的是，步骤(2)中所述4-羧基苯硼酸(4-cpba)、hbtu和diea的反应摩尔比为1：1～1.5：1～3。
更为优选的是，步骤(2)中硼酸修饰的具体参数为：取166mg4-羧基苯硼酸和400mghbtu于30ml无水dmf中，搅拌使其溶解，并在50℃下继续搅拌30min，得到混合物；随后向所述混合物中加入100mg所述g-c3n4和0.5mldiea，50℃下继续搅拌12h完成反应。
更为优选的是，步骤(3)中所述连续超声的功率为800w。
更为优选的是，步骤(4)中所述抗体稀释方法为将所述抗体用含0.5％bsa的pbs(ph7.4)稀释至10μgml-1。
更为优选的是，步骤(4)中所述葡萄糖溶液的浓度为1μmoll-1。
更为优选的是，步骤(4)中所述振荡反应的时间为10min。
一种免清洗通用型elisa荧光免疫探针，采用前述的方法制备得到。
一种免清洗通用型elisa荧光免疫探针应用于具有特异抗体的目标物检测，具体检测过程如下：取待测样本于所述免清洗通用型elisa荧光免疫探针溶液ab-bcnns中，且待测样本与探针溶液混合体积比为1:4，混合均匀后在37℃水浴中孵育20min，随后在330nm激发下测定混合液的荧光光谱，记录440nm处的荧光强度，带入标准曲线即可算出样本中目标物的浓度。
本发明的有益效果在于：本发明提供的一种免清洗通用型elisa荧光免疫探针及其制备方法具有以下优势：
第一，本发明提供的一种免清洗通用型elisa荧光免疫探针的制备方法是通过hbtu/diea偶联反应，将羧基苯硼酸修饰到g-c3n4上，后经超声剥离，可得到弱荧光的硼酸修饰的石墨相氮化碳纳米片(bcnns)，再将ab标记到bcnns上，可得到强荧光的ab-bcnns复合材料(on)，随着目标抗原的加入，ab-bcnns复合材料的荧光发生猝灭现象(off)，基于这种on-off现象，即可实现对目标抗原的特异性检测；而且通过改变ab-bcnns中的标记抗体，即可实现对不同目标抗原的选择性检测。
第二，基于本发明提供的一种免清洗通用型elisa荧光免疫探针的免疫检测，与传统elisa相比，检测方法简便快速，无需清洗和离心步骤、操作简单，只需一步，即可获得测定结果；反应快速，仅需20分钟孵育即可获得结果。
第三，本发明提供的一种免清洗通用型elisa荧光免疫探针不仅可用于蛋白标记物和小分子毒素，还可以适用于其他所有的有对应抗体的目标物，是一种具有普适性的荧光免疫探针。
第四，本发明提供的一种免清洗通用型elisa荧光免疫探针制作方法简单，没有专业化学合成经验的终端用户也可以制备，只需要将对应的抗体通过硼酸亲和作用固定在硼酸修饰的氮化碳室温孵育即可，和传统elisa的孔板包被步骤一样简单，但又比孔板包被快了很多(孔板包被需要12h，此方法只需要30min)。
第五，本发明提供的一种免清洗通用型elisa荧光免疫探针应用于具有特异抗体的目标物检测，具有操作简单、耗时短，检测选择性强和灵敏度高的优势。
附图说明
图1为本发明实施例1的一种免清洗通用型elisa荧光免疫探针的制备方法及应用原理示意图；
图2为本发明实施例2的一种免清洗通用型elisa荧光免疫探针abctni-bcnns与不同浓度ctni(0-100ngml-1)混合后的荧光光谱图；
图3为本发明实施例2的一种免清洗通用型elisa荧光免疫探针abctni-bcnns与不同浓度ctni混合后的荧光强度变化图，其中插图为荧光强度与浓度的校准曲线(0.01-5ngml-1)；
图4为本发明实施例2的一种免清洗通用型elisa荧光免疫探针abmb-bcnns与不同浓度mb(0-100ngml-1)混合后的荧光光谱图；
图5为本发明实施例2的一种免清洗通用型elisa荧光免疫探针abmb-bcnns与不同浓度mb混合后的荧光强度变化图，其中插图为荧光强度与浓度的校准曲线(0.04-20ngml-1)；
图6为本发明实施例2的一种免清洗通用型elisa荧光免疫探针abck-mb-bcnns与不同浓度ck-mb(0-10ngml-1)混合后的荧光光谱图；
图7为本发明实施例2的一种免清洗通用型elisa荧光免疫探针abck-mb-bcnns与不同浓度ck-mb混合后的荧光强度变化图，其中插图为荧光强度与浓度的校准曲线(0.02-6ngml-1)；
图8为本发明实施例2的一种免清洗通用型elisa荧光免疫探针abcea-bcnns与不同浓度cea(0-100ngml-1)混合后的荧光光谱图；
图9为本发明实施例2的一种免清洗通用型elisa荧光免疫探针abcea-bcnns与不同浓度cea混合后的荧光强度变化图，其中插图为荧光强度与浓度的校准曲线(0.02-8ngml-1)；
图10为本发明实施例2的一种免清洗通用型elisa荧光免疫探针abbpa-bcnns与不同浓度bpa(0-5mgml-1)混合后的荧光光谱图；
图11为本发明实施例2的一种免清洗通用型elisa荧光免疫探针abbpa-bcnns与不同浓度bpa混合后的荧光强度变化图，其中插图为荧光强度与浓度的校准曲线(20-500ngml-1)；
图12为本发明实施例3的一种免清洗通用型elisa荧光免疫探针abctni-bcnns采用酶联免疫法和荧光免疫分析法对人血清中ctni测定结果的线性相关图；图中三种不同浓度的血清样本圆形代表阴性，正方形代表低阳性，三角形代表高阳性；
图13为本发明实施例3的一种免清洗通用型elisa荧光免疫探针abmb-bcnns采用酶联免疫法和荧光免疫分析法对人血清中mb测定结果的线性相关图；图中三种不同浓度的血清样本圆形代表阴性，正方形代表低阳性，三角形代表高阳性；
图14为本发明实施例3的一种免清洗通用型elisa荧光免疫探针abck-mb-bcnns采用酶联免疫法和荧光免疫分析法对人血清中ck-mb测定结果的线性相关图；图中三种不同浓度的血清样本圆形代表阴性，正方形代表低阳性，三角形代表高阳性。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种免清洗通用型elisa荧光免疫探针的制备方法，包括以下步骤：
(1)g-c3n4粉末的合成：称取3g双氰胺于50ml氧化铝坩埚中，盖上盖子并用铝箔纸包裹密封，放入马弗炉中，以3℃min-1的速度升温至550℃并保持2h；待反应物冷却至室温取出，所得淡黄色固体即为g-c3n4，用玛瑙研钵将所述g-c3n4研磨成均匀固体粉末，备用；
(2)硼酸修饰：取166mg4-羧基苯硼酸和400mghbtu于30ml无水dmf中，搅拌使其溶解，并在50℃下继续搅拌30min，得到混合物；随后向所述混合物中加入100mg所述g-c3n4和0.5mldiea，50℃下继续搅拌12h完成反应；将反应后的产物离心收集，并依次用无水乙醇和二次水各清洗2-3次，60℃下烘干得bcn；
(3)用超声辅助液体剥离法将所述bcn剥离成bcn纳米片bcnns：取100mg所述bcn于250ml锥形瓶中，倒入100ml二次水；之后连续超声10h，超声功率800w；随后将超声所得黄色悬浮液在3000rpm转速下离心15min，收集上清；将所述上清在14000rpm转速下离心10min，收集沉淀，即为bcnns；将所述bcnns冷冻干燥后称重，配成0.2mgml-1的bcnns分散液，备用；
(4)抗体标记：将抗体用含0.5％bsa的pbs(ph7.4)稀释至10μgml-1，取50μl所述抗体加入到100μl0.2mgml-1bcnns分散液中，混合均匀后在室温下振荡反应10min，随后继续加入50μl的1μmoll-1葡萄糖溶液，在室温下振荡10min，得到混合体系；最后将所述混合体系在14000rpm转速下离心10min，保留下层沉淀并重悬于200μlpbs中，即得到抗体标记的bcnns，即为ab-bcnns。
实施例1制备的一种免清洗通用型elisa荧光免疫探针的制备及应用原理如图1所示。具体为：通过hbtu/diea偶联反应，将羧基苯硼酸修饰到g-c3n4上，后经超声剥离，可得到弱荧光的硼酸修饰的g-c3n4纳米片(bcnns)，再将ab标记到bcnns上，可得到强荧光的ab-bcnns复合材料(on)，随着目标抗原的加入，ab-bcnns复合材料的荧光发生猝灭现象(off)，基于这种on-off现象，通过改变bcnns上标记的抗体，即可实现对不同目标抗原的特异性检测；基于此荧光探针的免疫检测，与传统elisa相比，操作简单，只需一步，即可获得测定结果；反应快速，仅需20分钟孵育即可。
实施例2
将采用实施例1的方法制备一种免清洗通用型elisa荧光免疫探针应用于具有特异抗体的目标物检测，具体实验为对人血清中三种心肌标志物，肌钙蛋白i(ctni)、肌红蛋白(mb)和肌酸激酶同工酶mb(ck-mb)进行检测。
1.对肌钙蛋白i(ctni)的检测
制备：采用实施例1的方法，利用ctni抗体制备一种免清洗通用型elisa荧光免疫探针abctni-bcnns。
检测方法及结果：向abctni-bcnns中直接加入不同浓度的ctni，混合均匀后在37℃水浴中孵育20min，随后在330nm激发下测定混合液的荧光光谱，得到图2，从图中可以看到，随着ctni加入浓度的增大(0-100ngml-1)，体系的荧光强度逐渐降低。记录此时体系在440nm处的荧光强度，得到趋势图如图3所示。经计算可知，在0.01-5ngml-1浓度范围内，ctni浓度与体系荧光强度之间存在良好的线性关系(图3插图)，计算得线性回归方程为：f＝-791.8cctni 6427(0.01-5ngml-1，即0.4-209nmoll-1；r2＝0.9934)。检出限为121fmoll-1(3σ/s,n＝11)。
2.对肌红蛋白(mb)的检测
制备：采用实施例1的方法，利用mb抗体制备一种免清洗通用型elisa荧光免疫探针abmb-bcnns。
检测方法及结果：向abmb-bcnns中直接加入不同浓度的mb，混合均匀后在37℃水浴中孵育20min，随后在330nm激发下测定混合液的荧光光谱，得到图4，从图中可以看到，随着mb加入浓度的增大(0-100ngml-1)，体系的荧光强度逐渐降低。记录此时体系在440nm处的荧光强度，得到趋势图如图5所示。经计算可知，在0.01-5ngml-1浓度范围内，mb浓度与体系荧光强度之间存在良好的线性关系(图5插图)，计算得线性回归方程为：f＝-943.8cmb 7544(0.04-20ngml-1，即2.4-1198nmoll-1；r2＝0.9937)，检出限为515fmoll-1(3σ/s,n＝11)。
3.肌酸激酶同工酶mb(ck-mb)的检测
制备：采用实施例1的方法，利用ck-mb抗体制备一种免清洗通用型elisa荧光免疫探针abck-mb-bcnns。
检测方法及结果：向abck-mb-bcnns中直接加入不同浓度的ck-mb，混合均匀后在37℃水浴中孵育20min，随后在330nm激发下测定混合液的荧光光谱，得到图6，从图中可以看到，随着ck-mb加入浓度的增大(0-10ngml-1)，体系的荧光强度逐渐降低。记录此时体系在440nm处的荧光强度，得到趋势图如图7所示。经计算可知，在0.01-5ngml-1浓度范围内，ck-mb浓度与体系荧光强度之间存在良好的线性关系(图7插图)，计算得线性回归方程为：f＝-1012cck-mb 7387(0.02-6ngml-1，即0.23-70nmoll-1；r2＝0.9911)，检出限为74fmoll-1(3σ/s,n＝11)。
4.癌胚抗原(cea)的检测
制备：采用实施例1的方法，利用cea抗体制备一种免清洗通用型elisa荧光免疫探针abcea-bcnns。
检测方法及结果：向abcea-bcnns中直接加入不同浓度的cea，混合均匀后在37℃水浴中孵育20min，随后在330nm激发下测定混合液的荧光光谱，得到图8，从图中可以看到，随着cea加入浓度的增大(0-100ngml-1)，体系的荧光强度逐渐降低。记录此时体系在440nm处的荧光强度，得到趋势图如图9所示。经计算可知，在0.01-5ngml-1浓度范围内，cea浓度与体系荧光强度之间存在良好的线性关系(图9插图)，计算得线性回归方程为：f＝-890.5ccea 6599(0.02-8ngml-1，即0.11-45nmoll-1；r2＝0.9968)，检出限为23fmoll-1(3σ/s,n＝11)。
5.双酚a(bpa)的检测
制备：采用实施例1的方法，利用bpa抗体制备一种免清洗通用型elisa荧光免疫探针abbpa-bcnns。
检测方法及结果：向abbpa-bcnns中直接加入不同浓度的bpa，混合均匀后在37℃水浴中孵育20min，随后在330nm激发下测定混合液的荧光光谱，得到图10，从图中可以看到，随着bpa加入浓度的增大(0-5mml-1)，体系的荧光强度逐渐降低。记录此时体系在440nm处的荧光强度，得到趋势图如图11所示。经计算可知，在0.01-5ngml-1浓度范围内，bpa浓度与体系荧光强度之间存在良好的线性关系(图11插图)，计算得线性回归方程为：f＝-1144cbpa 6186(20-500nmoll-1；r2＝0.9728)，检出限为6.8nmoll-1(3σ/s,n＝11)。
实施例3
将采用实施例1的方法制备一种免清洗通用型elisa荧光免疫探针应用于对人血清中的ctni、mb和ck-mb进行检测。
在最优条件下，向abctni-bcnns中加入不同人血清样本(可按照阴性、低阳性、高阳性分为三组，每组四个样本，共12个样本)，在相同的条件下测定混合液的荧光光谱，记录440nm处的荧光强度，并计算出每个人血清样本中ctni的含量。同时用商品化的ctni酶联免疫试剂盒对同一批血清样本进行测试，以ctni酶联免疫试剂盒对血清样本的测试值为横坐标，本实验的荧光免疫分析法对血清样本的测试值为纵坐标，得到两种方法的线性相关图(图12)，从图上可以看出，两种方法检测结果的相关性较好，说明本实验的荧光免疫分析法对血清样本中ctni检测的准确度较好。
类似的，将abctni-bcnns血清样本替换为abmb-bcnns和abck-mb-bcnns血清样本，重复上述步骤，并各自以两种检测方法的检测结果为横纵坐标，得到两种方法的线性相关图(mb：图13，ck-mb：图14)。从结果可知，当以mb和ck-mb为目标物时，本实验的荧光免疫分析法依然有着良好的准确性，综上，说明本方法可以实现人血清中三中心肌标志物的准确检测。本方法不仅可以实现所试验的三种心肌标志物的检测，也可以推广至其他有对应抗体的目标物的检测。
应当理解，以上所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。由本发明的精神所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。
1.一种免清洗通用型elisa荧光免疫探针的制备方法，其特征在于，所述荧光免疫探针的制备方法包括以下步骤：
(1)g-c3n4粉末的合成：将1-5g双氰胺于氧化铝坩埚中，盖上盖子并用铝箔纸包裹密封，放入马弗炉中，以3℃min-1的速度升温至550℃并保持2h；待反应物冷却至室温取出，所得淡黄色固体即为g-c3n4，用玛瑙研钵将所述g-c3n4研磨成均匀固体粉末，备用；
(2)硼酸修饰：取4-羧基苯硼酸和hbtu于无水dmf中，搅拌使其溶解，并在50℃下继续搅拌30-60min，得到混合物；随后向所述混合物中加入所述g-c3n4和diea，50℃下继续搅拌12-16h完成反应；将反应后的产物离心收集，并依次用无水乙醇和二次水各清洗2-3次，60℃下烘干得bcn；
(3)用超声辅助液体剥离法将所述bcn剥离成bcn纳米片bcnns：取所述bcn于锥形瓶中，加入二次水配成浓度为1mgml-1的悬浮液；之后连续超声10h；随后将超声所得奶白色悬浮液在3000rpm转速下离心15min，收集上清；将所述上清在14000rpm转速下离心10min，收集沉淀，即为bcnns；将所述bcnns冷冻干燥后称重，配成0.2mgml-1的bcnns分散液，备用；
(4)抗体标记：将抗体用含0.5-2％bsa的pbs(ph7.2-7.6)稀释至10-100μgml-1，取50μl所述抗体加入到100μl0.2mgml-1bcnns分散液中，混合均匀后在室温下振荡反应10min，随后继续加入50μl的1-10μmoll-1葡萄糖溶液，在室温下振荡8-20min，得到混合体系；最后将所述混合体系在14000rpm转速下离心10min，保留下层沉淀并重悬于200μlpbs中，即得到抗体标记的bcnns，即为ab-bcnns。
2.根据权利要求1所述的一种免清洗通用型elisa荧光免疫探针的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述双氰胺的用量为3g。
3.根据权利要求1所述的一种免清洗通用型elisa荧光免疫探针的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述4-羧基苯硼酸(4-cpba)、hbtu和diea的反应摩尔比为1：1～1.5：1～3。
4.根据权利要求1所述的一种免清洗通用型elisa荧光免疫探针的制备方法，其特征在于，步骤(2)中硼酸修饰的具体参数为：取166mg4-羧基苯硼酸和400mghbtu于30ml无水dmf中，搅拌使其溶解，并在50℃下继续搅拌30min，得到混合物；随后向所述混合物中加入100mg所述g-c3n4和0.5mldiea，50℃下继续搅拌12h完成反应。
5.根据权利要求1所述的一种免清洗通用型elisa荧光免疫探针的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述连续超声的功率为800w。
6.根据权利要求1所述的一种免清洗通用型elisa荧光免疫探针的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述抗体稀释方法为将所述抗体用含0.5％bsa的pbs(ph7.4)稀释至10μgml-1。
7.根据权利要求1所述的一种免清洗通用型elisa荧光免疫探针的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述葡萄糖溶液的浓度为1μmoll-1。
8.根据权利要求1所述的一种免清洗通用型elisa荧光免疫探针的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述振荡反应的时间为10min。
9.一种免清洗通用型elisa荧光免疫探针，其特征在于，所述免清洗通用型elisa荧光免疫探针采用权利要求1-9任意一项所述的方法制备得到。
10.一种免清洗通用型elisa荧光免疫探针的应用，其特征在于，所述免清洗通用型elisa荧光免疫探针应用于具有特异抗体的目标物检测。
技术总结