本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及一种快速检测鱼粉中沙门氏菌的方法。
背景技术：
沙门氏菌是一种可致病的革兰氏阴性肠道杆菌，能引起多种动物疾病，影响动物的生长，严重时会造成畜禽大批死亡，给养殖业造成巨大损失。其中，在国标gb13078-2017《饲料卫生标准》中要求饲料原料和饲料产品中不得检出有沙门氏菌。
饲料中的沙门氏菌往往多来源于鱼粉、肉骨粉等动物性蛋白原料，由于这些原料的含菌成分一般比较复杂，导致采用elisa法对鱼粉中的沙门氏菌进行检测会出现沙门氏菌出现假阳性的概率较大的现象；采用国标法规定的传统分离鉴定法来检测鱼粉中的检测沙门氏菌流程需要耗时4～5个工作日，检测过程繁琐，检测效率较低，且工作量比较大，如果完全依赖国标法的检测方式会影响到原料在生产上的使用，同时给仓库库存造成很大压力，不适合企业对鱼粉进行验收，会面临周转效率低的问题；沙门氏菌的检测方法还有pcr法，然而，这种检测方法需要昂贵的仪器设备，操作相对复杂，检测总成本较高。
因此，有必要对现有技术改进以解决上述技术问题。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种快速检测鱼粉中沙门氏菌的方法，该方法能够显著提高鱼粉中沙门氏菌的检测效率，同时能够提高检测鱼粉中沙门氏菌的检测准确度，检测结果有保证。
为了实现上述发明目的，本发明的发明人进行了大量的探索研究，为了提高鱼粉中沙门氏菌的检测效率和准确性，本发明的发明人在研究中发现，虽然，国标gb/t13091-2018《饲料中沙门氏菌的测定》检测沙门氏菌的结果具有权威性，但是，这种传统的检测方法检测耗时较长，要4-5个工作日，检测效率较低，且工作量比较大，影响企业对鱼粉验收和周转；而elisa方法是检测沙门氏菌方法中成本较低，效率较快的方法，但是，发明人在研究中发现由于鱼粉的含菌成分比较复杂，导致elisa法检测出沙门氏菌出现假阳性的概率较大，如采用德国拜发elisa原方法在检测鱼粉中沙门氏菌时，以od值小于0.200时判断为阴性，od值大于0.200时判断为阳性，由于鱼粉菌落成分复杂，大部分采用传统的国标法gb/t13091-2018《饲料中沙门氏菌的测定》检测出阴性结果的鱼粉样品采用elisa原方法检测时od值显示大于0.200，所以多数样品被误判为阳性，采用gb/t13091-2018法和elisa法检测鱼粉中沙门氏菌的缺点如表1所示。
表1两种方法检测鱼粉中沙门氏菌的缺点
为了提高对鱼粉中沙门氏菌的检测效率和检测准确性，本发明的发明人经过创新性设计，将现行国标法和德国拜发elisa方法进行结合，提供一种新的检测鱼粉中沙门氏菌的方法。
由于鱼粉中细菌总数较多，菌落复杂，所以大部分的样品采用elisa法检测时遇到的干扰大，多数样品经过elisa法检测后的od值大于elisa方法给出的临界值0.200，被判断为疑似阳性需要重新用国标方法继续验证，这不利于提高检测效率，因此，本发明人经过大胆创新，对德国拜访elisa方法中判定阴阳性的临界od值进行优化，具体实验过程如下：
分别采用国标法gb/t13091-2018《饲料中沙门氏菌的测定》和拜发elisa方法对大量鱼粉样品进行检测，记录检测结果，具体实验结果如表2所示，发明人分析了国标法的检测结果与拜发沙门氏菌elisa试剂盒(
表2.拜发elisa试剂盒检测结果与国标法阳性结果统计
从上述表2的实验结果可知，如果按照拜发沙门氏菌elisa试剂盒(
由上述表2可知，拜发elisa检测od值小于1.000时，100％的鱼粉样品国标检测结果为阴性，因此，将拜发沙门氏菌elisa方法判定阴阳性的临界od值定位1.000，按照新的临界od值，80％以上的鱼粉样品2天就可以出检测结果，od值大于1.000的样品用国标法继续检测。将国标法与德国拜发elisa法进行结合，使大部分原本不含沙门氏菌但用原elisa法检测出假阳性的鱼粉，在新确定的方法中用elisa法检出结果为阴性，剩余小部分可疑阳性样品接着往下做国标法确认，新的检测方法即具有国标法的权威性，又能发挥elisa方法高效性，两种方法的有效结合可以提高鱼粉中沙门氏菌的检测效率和准确性。
一种快速检测鱼粉中沙门氏菌的方法，具体的技术方案包括如下步骤：
本实验试样的采集应遵循随机性、代表性的原则，为防止外来污染，采样过程应遵守无菌操作程序，采样方法：参照gb/t13091的采样方法进行。
s1，前增菌培养
在无菌条件下称取25g鱼粉样品，加入装有225ml灭菌缓冲蛋白胨水(bpw)的培养瓶中，用振荡器震荡混匀，在36℃±1℃的培养箱中培养18h±2h；
s2，采用拜发沙门氏菌elisa试剂盒(
s21，准备微孔板
将对照液和样品检测所需的微量反应条固定在微孔架板内；
s22，加样
在选定的微孔中分别加入100μl上述培养后的前增菌液及阴性和阳性对照液，采用微孔板遮盖膜盖住反应板，在36℃±1℃培养箱中孵育0.2～1h；
s23，第一次洗板
弃掉反应微孔内的液体，采用200～400μl洗涤液对上述微孔进行清洗，清洗5～10次；
s24，增菌培养
于各反应微孔中加入250μl预热好的沙门氏菌板内增菌培养基，采用微孔板遮盖膜盖住反应板，在36℃±1℃培养箱中孵育3～5h；
s25，第二次洗板
弃掉反应孔内的液体，采用300μl洗涤液对各微孔进行清洗，清洗3～5次；
s26，加入酶连接物
在反应孔中加100μl的酶连接物，盖上反应板，在36℃±1℃培养箱中孵育0.5～1h；
s27，第三次洗板
弃掉孔中液体，采用200～400μl洗涤液对上述微孔进行清洗，清洗5～10次；
s28，加入底物，终止反应
在清洗后的反应微孔中加入100μl底物，在室温条件下暗处孵育0.25～1h，再向每个微孔中加入100μl反应终止液，终止反应；
s29，测定样品od值
采用酶标仪在450nm条件下使用微孔板测定od值，620nm作为对照参考波长，确定od值的判定线，根据od值大小来判断鱼粉样品中是否含有沙门氏菌；结果为阴性的样品为未检测到沙门氏菌；结果为阳性的样品可能含有沙门氏菌，采用国标法继续往下进行检测；
s3，选择性增菌培养
对于采用步骤s2elisa试剂盒(
s4，分离培养
采用接种环取1环步骤s3的选择性增菌培养基，划线接种在亚硫酸铋(bs)琼脂平板上，于36℃±1℃培养24h～48h；用接种环取1环选择性增菌培养基，划线接种在胆硫乳(dhl)琼脂平板上，于36℃±1℃培养18h～24h，观察判断菌落是否为典型菌落；
其中，bs琼脂平板的沙门氏菌菌落特征为：黑色带光泽、棕色或灰色，菌落周围培养基可呈黑色或棕色；有些菌株形成灰绿色菌落，周围培养基不变；dhl琼脂板的沙门氏菌菌落特征为：无色半透明或粉红色，菌落中心黑色；
s5，生化鉴定试验
挑取步骤s4中分离培养中的典型菌落，用新型微生物微量生化鉴定管鉴定是否属于沙门氏菌属，分别从在亚硫酸铋(bs)琼脂平板上和在胆硫乳(dhl)琼脂平板上生长的2～3个可疑菌落划线接种在三糖铁琼脂(tsi)上，在36℃±1℃培养18h～24h，进行三糖铁琼脂(tsi)和赖氨酸脱羧酶试验，观察结果；在做三糖铁琼脂(tsi)和赖氨酸脱羧酶试验的同时可以接种缓冲蛋白胨水(做靛基质试验)，尿素琼脂进行尿素酶试验，氰化钾(kcn)培养基进行氰化钾(kcn)试验，生化鉴定试验还包括包括：甘露醇和山梨醇试验，β-半乳糖苷酶试验(opng试验)，综合上述生化鉴定试验的结果来判断样品中检出或未检出沙门氏菌。
优选地，所述步骤s22中，在36℃±1℃培养箱中孵育0.5h。
优选地，所述步骤s23中，采用300μl洗涤液对上述微孔进行清洗，清洗7次。
优选地，所述步骤s24中，在36℃±1℃培养箱中孵育4h。
优选地，所述步骤s29中，所述od值的判定线为1.000，od值小于1.000的样品为阴性；od值大于等于1.000，结果为疑似阳性，疑似阳性的样品，需要采用国标法继续往下进行检测。
与最接近的现有技术相比，本发明提供的技术方案具有如下优异效果：
(1)本发明提供的快速检测鱼粉中沙门氏菌的方法经过创新性设计利用elisa技术与传统方法相结合，通过优化德国拜发elisa方法od值的判定线，使德国拜发elisa方法od值的判定线更准确，从而减少假阳性率，使得大部分鱼粉的沙门氏菌检测由原来的4-5个工作日缩短至2个工作日，使得鱼粉的沙门氏菌检测效率得到很大的提高。
(2)本发明提供的快速检测鱼粉中沙门氏菌的方法同时减少了操作人员的工作量，降低原料仓库的库存压力，本发明新建立的快速检测鱼粉中沙门氏菌的方法更适用于饲料企业对鱼粉中沙门氏菌的检测。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。其中：
图1是本发明实施例1样品中检测出沙门氏菌的几种生化鉴定试验结果图；
图2是本发明实施例1快速检测鱼粉中沙门氏菌的方法的检测流程图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本发明提供一种快速检测鱼粉中沙门氏菌的方法，包括如下步骤：
1.实验试剂和实验仪器
本实施例1所需要的实验试剂如下：
水符合gb/t6682中三级水的要求，缓冲蛋白胨水(bpw)，拜发沙门氏菌elisa试剂盒(
本实施例1所需要的实验仪器如下：
酶标仪，冰箱，灭菌锅，生物安全柜，恒温培养箱，均质器，振荡器，电子天平，移液枪，培养瓶，培养皿。
2.实验过程
本实验试样的采集应遵循随机性、代表性的原则，为防止外来污染，采样过程应遵守无菌操作程序，采样方法：参照gb/t13091的采样方法进行。
2.1前增菌培养
在无菌条件下称取25g样品，加入装有225ml灭菌缓冲蛋白胨水(bpw)的培养瓶中，用振荡器震荡混匀，在36℃±1℃的培养箱中培养18h±2h。
2.2采用拜发沙门氏菌elisa试剂盒(
2.2.1准备微孔板
将对照液和样品检测所需的微量反应条固定在微孔架板内；
2.2.2加样
在选定的微孔中分别加入100μl上述培养后的前增菌液及阴性和阳性对照液，使用拜发沙门氏菌elisa试剂盒(
2.2.3第一次洗板
弃掉反应微孔内的液体，采用300μl洗涤液对各微量孔进行清洗，清洗7次；
2.2.4增菌培养
于各反应微孔中加入250μl预热好的沙门氏菌板内增菌培养基，采用微孔板遮盖膜盖住反应板，在36℃±1℃培养箱中孵育4h；
2.2.5第二次洗板
弃掉反应孔内的液体，采用300μl洗涤液对各微量孔进行清洗，清洗3～5次；
2.2.6加入酶连接物
在反应孔中加100μl的酶连接物，盖上反应板，在36℃±1℃培养箱中孵育30min；
2.2.7第三次洗板
弃掉孔中液体，采用300μl洗涤液对各微量孔进行清洗，清洗7次；
2.2.8加入底物:
在清洗后的反应微孔中加入100μl底物，在室温(20℃～25℃)条件下暗处孵育15min；
2.2.9终止反应
向每个微孔中加入100μl反应终止液。
采用酶标仪在450nm条件下使用微孔板测定od值，620nm作为对照参考波长，od值小于1.000，结果为阴性；od值大于等于1.000，结果为疑似阳性，采用elisa试剂盒(
2.3选择性增菌培养
对于采用步骤2.2elisa试剂盒(
2.4分离培养
用接种环取1环选择性增菌培养基，划线接种在亚硫酸铋(bs)琼脂平板上，于36℃±1℃培养24h～48h；用接种环取1环选择性增菌培养基，划线接种在胆硫乳(dhl)琼脂平板上，于36℃±1℃培养18h～24h，观察判断菌落是否为典型菌落。
其中，bs琼脂平板的沙门氏菌菌落特征为：黑色带光泽、棕色或灰色，菌落周围培养基可呈黑色或棕色；有些菌株形成灰绿色菌落，周围培养基不变；dhl琼脂板的沙门氏菌菌落特征为：无色半透明或粉红色，菌落中心黑色。
2.5生化鉴定试验
挑取步骤2.4中分离培养中的可疑菌落，用新型微生物微量生化鉴定管鉴定是否属于沙门氏菌属，分别从在亚硫酸铋(bs)琼脂平板上和在胆硫乳(dhl)琼脂平板上生长的2～3个可疑菌落划线接种在三糖铁琼脂(tsi)上，在36℃±1℃培养18h～24h，进行三糖铁琼脂(tsi)和赖氨酸脱羧酶试验，观察结果；在做三糖铁琼脂(tsi)和赖氨酸脱羧酶试验的同时可以接种缓冲蛋白胨水(做靛基质试验)，尿素琼脂，氰化钾(kcn)培养基进行尿素酶试验，氰化钾(kcn)试验，生化鉴定试验还包括包括：甘露醇和山梨醇试验，β-半乳糖苷酶试验(opng试验)，综合上述生化鉴定试验的结果来判断样品中检出或未检出沙门氏菌，本实施例1列出了样品中检测出沙门氏菌的几种生化试验结果，具体结果如图1所示。
本实施例提供的快速检测鱼粉中沙门氏菌的方法，其具体的检测步骤可概括为如图2所示，拜发沙门氏菌elisa试剂盒(
因此，本发明提供的快速检测鱼粉中沙门氏菌的方法，利用elisa技术与传统方法相结合，通过优化德国拜发elisa方法od值的判定线，使德国拜发elisa方法od值的判定线更准确，从而减少假阳性率，使得大部分鱼粉的沙门氏菌检测由原来的4-5个工作日缩短至2个工作日；使得鱼粉的沙门氏菌检测效率得到很大的提高，同时减少了操作人员的工作量，降低原料仓库的库存压力，本发明新建立的快速检测鱼粉中沙门氏菌的方法更适用于饲料企业对鱼粉中沙门氏菌的检测。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
1.一种快速检测鱼粉中沙门氏菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
s1，前增菌培养
在无菌条件下称取25g鱼粉样品，加入装有225ml灭菌缓冲蛋白胨水的培养瓶中，混匀，在36℃±1℃的培养箱中培养18h±2h；
s2，采用拜发沙门氏菌elisa试剂盒法对步骤s1培养后的样品进行检测：
s21，准备微孔板
将对照液和样品检测所需的微量反应条固定在微孔架板内；
s22，加样
在选定的微孔中分别加入100μl上述培养后的前增菌液及阴性和阳性对照液，采用微孔板遮盖膜盖住反应板，在36℃±1℃培养箱中孵育0.2～1h；
s23，第一次洗板
弃掉反应微孔内的液体，采用200～400μl洗涤液对上述微孔进行清洗，清洗5～10次；
s24，增菌培养
于各反应微孔中加入250μl预热好的沙门氏菌板内增菌培养基，采用微孔板遮盖膜盖住反应板，在36℃±1℃培养箱中孵育3～5h；
s25，第二次洗板
弃掉反应孔内的液体，采用300μl洗涤液对各微孔进行清洗，清洗3～5次；
s26，加入酶连接物
在反应孔中加100μl的酶连接物，盖上反应板，在36℃±1℃培养箱中孵育0.5～1h；
s27，第三次洗板
弃掉孔中液体，采用200～400μl洗涤液对上述微孔进行清洗，清洗5～10次；
s28，加入底物，终止反应
在清洗后的反应微孔中加入100μl底物，在室温条件下暗处孵育0.25～1h，再向每个微孔中加入100μl反应终止液，终止反应；
s29，测定样品od值
采用酶标仪在450nm条件下使用微孔板测定od值，620nm作为对照参考波长，确定od值的判定线，根据od值大小来判断鱼粉样品中是否含有沙门氏菌；结果为阴性的样品为未检测到沙门氏菌；结果为阳性的样品可能含有沙门氏菌，采用国标法继续往下进行检测；
s3，选择性增菌培养
对于采用步骤s2中elisa试剂盒(
s4，分离培养
采用接种环取1环步骤s3的选择性增菌培养基，划线接种在亚硫酸铋琼脂平板上，于36℃±1℃培养24h～48h；用接种环取1环选择性增菌培养基，划线接种在胆硫乳琼脂平板上，于36℃±1℃培养18h～24h，观察判断菌落是否为典型菌落；
其中，bs琼脂平板的沙门氏菌菌落特征为：黑色带光泽、棕色或灰色，菌落周围培养基可呈黑色或棕色；有些菌株形成灰绿色菌落，周围培养基不变；dhl琼脂板的沙门氏菌菌落特征为：无色半透明或粉红色，菌落中心黑色；
s5，生化鉴定试验
挑取步骤s4中分离培养中的典型菌落，用新型微生物微量生化鉴定管鉴定是否属于沙门氏菌属，生化鉴定试验包括，三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验，白做靛基质试验，尿素酶试验，氰化钾(kcn)试验，甘露醇和山梨醇试验，β-半乳糖苷酶试验，综合上述生化鉴定试验的结果来判断样品中检出或未检出沙门氏菌。
2.如权利要求1所述的快速检测鱼粉中沙门氏菌的方法，其特征在于，所述步骤s1中，采用振荡器震荡混匀。
3.如权利要求1所述的快速检测鱼粉中沙门氏菌的方法，其特征在于，所述步骤s22中，在36℃±1℃培养箱中孵育0.5h。
4.如权利要求1所述的快速检测鱼粉中沙门氏菌的方法，其特征在于，述步骤s23中，采用300μl洗涤液对上述微孔进行清洗，清洗7次。
5.如权利要求1所述的快速检测鱼粉中沙门氏菌的方法，其特征在于，所述步骤s29中，所述od值的判定线为1.000，od值小于1.000的样品为阴性；od值大于等于1.000，结果为疑似阳性，疑似阳性的样品，需要采用国标法继续往下进行检测。
技术总结