本发明属于生物检验领域。具体涉及己烯雌酚的测定方法。
背景技术：
己烯雌酚(dethylstilbestrol，des)作为一种人工合成的雌激素药物，广泛应用于妇科病的预防和治疗，同时它还具有促进动物生长和提高饲料转化率等作用。des可通过食物链进人人体，导致激素分泌异常、甚至乳腺癌和胚胎畸形等严重后果，因此许多国家已明令禁止将des用于动物养殖。我国国家标准规定的des检测方法为液相色谱-串联质谱法，目前用于des检测的方法主要有酶联免疫分析法、高效液相色谱法、液相色谱一质谱联用法、电化学法、放射免疫法等。以上方法准确灵敏，但存在过程复杂、操作繁琐以及携带不便等缺点。因此，建立简单、灵敏、快速的检测方法十分必要。
近年来，基于荧光标记的免疫层析技术得到广泛关注，量子点(quantumdots，qds)为免疫层析技术的常用的荧光标记物。qds作为免疫探针，建立了检测玉米赤霉烯酮的免疫层析方法，且灵敏度良好。段宏等利用量子点荧光微球为探针，制备免疫层析试纸条定量检测恶性疟原虫。稀土掺杂上转换纳米颗粒(ucnps)是一种新型材料，其上转换发光机制源于稀土离子在红外光激发下，可以转化为高能量可见光。nayf4：yb，er为双掺的上转换稀土化合物，量子产率高，荧光稳定性好。与qds相比，ucnps具有稳定性好、亮度高、干扰背景几乎为零、不易光解和光漂白等优点。目前，上转换发光免疫层析技术的研究逐渐受到关注，於然等将修饰羧基的上转换颗粒用于免疫层析试纸，检测脱氧雪腐镰刀菌烯醇，但抗体标记较复杂，检测范围窄。本研究以修饰醛基的ucnps为载体，将des单抗直接标记在颗粒表面，制备出新型的荧光探针，建立了上转换免疫层析试纸条快速定量检测des的新方法。方法检测范围宽，操作简单，适用于大量样品现场检测。
技术实现要素：
本文采用己烯雌酚上转换发光免疫层析方法，并基于上转换发光免疫分析仪，用于己烯雌酚的快速检测。
本发明包括以下步骤：
（1）上转换纳米材料nayf4：yb，er的合成与表面修饰：称取0.18mmolybcl3·6h2o，0.80mmolycl3·7h20和0.02mmolercl3·6h2o，加人10mlc18h3402和30mlc18h36。将溶液加热至160℃并维持30min，形成均匀溶液，同时除去o2和水，然后冷却至50℃。逐滴加入20ml溶有5mmolnaoh和8mmolnh4f的甲醇溶液并搅拌30min，尽快升温至100℃除去水和甲醇。在氮气保护下迅速加热至320℃并维持1h。反应完成后，溶液自然冷却至室温，所得产物用环己烷和乙醇洗3次，烘干备用。
称取上述ucnps100mg于60ml乙醇中，超声分散。加入2．5ml氨水，20ml超纯水和25µlteos，40℃下搅拌反应6h。随后，加人50µlaptes，40℃继续搅拌反应6h。所得产物用乙醇洗涤3次，干燥备用。称取10mg修饰氨基的ucnps，分散于10mlpbs缓冲液(0．01mol/l，ph7．4)，然后加人20ml2．5％的戊二醛溶液，振荡反应30min，所得产物用pbs缓冲液洗涤两次。
（2）des单抗标记的ucnps探针和ucnps试纸条的制备：称取10mg修饰后的ucnps，加人2ml超纯水超声分散。随后，加入4.8µl(10.5mg/ml)的des单克隆抗体，室温振荡1h，再加入50µl20％牛血清白蛋白(bsa)溶液封闭1h。用pbs洗涤两次后，将偶联上抗体的ucnps用pbs重悬，于4℃下保存待用。
上转换发光试纸条包括加样垫、结合垫、层析膜、吸水垫和pvc板。将标记好抗体的ucnps均匀滴涂在结合垫上，真空冷冻干燥。用划膜仪将0.8mg/mldes-bbsa和1mg/ml羊抗鼠igg喷涂在nc膜上，分别作为检测线(t线)和质控线(c线)，37℃干燥1h。将将加样垫、结合垫、nc膜、吸水垫裁剪成
合适大小，依次粘贴在pvc板上，用自动切条机切成4mm宽的试纸条，干燥备用。
（3）ucnps试纸条的检测流程及条件优化：将不同浓度的样品取100µl滴加到检测卡加样垫上，室温反应15min后，upt-3a免疫分析仪读取试纸条t和c线荧光强度。当样品中没有des时，ucnps探针经nc膜迁移至试纸条t线区域，未结合的ucnps探针与des-bsa结合，t线出现荧光条带；反之，ucnps探针上的des单克隆抗体与des结合，免疫复合物经nc膜进一步迁移至试纸条c线区域与羊抗鼠二抗结合，c线出现荧光条带，t/c的值与des浓度呈负相关。如果c线没有产生荧光条带，说明试纸条无效。以结合垫宽度、加样垫宽度、des-bsa浓度、羊抗鼠二抗浓度为因素，设计四因素三水平正交试验，优化试纸条性能，具体见表l。通过正交试验选取阴性样本t0/c0。与阳性样本t/c的差值最大时的条件为试纸条最佳工艺条件。采用免疫动力学分析方法确定试纸条最佳检测时间。最优条件下，将浓度为500ng/ml的des溶液加入加样孔，每隔30s，upt-3a免疫分析仪读取试纸条t/c的值，以t/c的值达到稳定的时间为最佳检测时间。
具体实施方式
下面将详细说明本发明的具体实施方式：
1.仪器、试剂及材料：
仪器：
jjem—ioocxii透射电子显微镜(日本电子株式会社)；fts6000傅里叶红外光谱仪(美国bio-rad公司)；lgj-10d型冷冻干燥机(北京四环科学仪器厂)；hm3010单维往复划膜仪(上海金标公司)；zq2000微电脑自动斩切机(上海金标公司)；硝酸纤维素膜(nc膜)、加样垫、结合垫、吸水垫、pvc底板及upt-3a便携式上转换发光免疫分析仪，均由北京热景生物技术有限公司提供。
试剂及材料：
氯化钇(ycl3·6h20)、氯化镱(ybcl3·6h20)、氯化铒(ercl3·6h2o)、十八烯(c18h36。)购于山东西亚化学工业有限公司；四乙氧基硅硅烷(teos)、3-氨丙基三乙氧基硅烷(aptes)，牛血清白蛋白(bsa)购于上海sigma公司；己烯雌酚(des)、雌二醇(e2、己烷雌酚(hex)、双烯雌酚(dien)、双酚a(bpa)购于北京百灵威公司；己烯雌酚单克隆抗体(des-ab))、己烯雌酚抗原(des-bsa)本实验室制备；羊抗鼠抗体(北京索莱宝公司)；实验用水为超纯水；其它试剂均为分析纯。牛奶样品购于当地超市。
2.方法与结果
ucnps试纸条的优化:结合垫宽度、加样垫宽度、des—bsa浓度、羊抗鼠二抗浓度是影响试纸条检测灵敏度的关键参数。本研究通过正交试验优化，当结合垫宽度为0.7cm，加样垫宽度为1.8cm，des-bsa浓度为0.8mg/ml，羊抗鼠二抗浓度为1mg/ml时阴性样本t0/c0。与阳性样本t/c的差值最大。因此，本实验选择该条件为试纸条的最优条件，t线和c线荧光强度比值随着反应时间的延长呈现下降趋势，在15min后即趋于稳定。此结果表明，试纸条最佳的检测时间为加样后15min。
ucnps试纸条定量检测des的标准曲线及检出限：用10％甲醇溶液配制des系列标准溶液(0，25，50，100，200，500，800，1000，4000，8000和10000ng/ml)。ucnps试纸条检测，15min后upt-3a免疫分析仪读取试纸条t和c线荧光强度以及t和c线荧光强度比值，每个浓度重复检测3次以des浓度对数为横坐标，阴性样本t0/c0。对数与阳性样本t/c对数的差值为纵坐标，绘制des检测的标准曲线。ucnps免疫层析试纸条检测des的标准曲线。结果表明，des浓度在25～10000ng/ml时，其对数值和阴性样本t0/c0。对数与阳性样本t/c对数的差值呈线性关系，线性回归方程为y=0.43927x一0.57647(r2=0.996)。检出限按m0-3sd(m0为20次空白测试t/c的平均值，sd为20次空白测试的标准差)计算为20.84ng/ml。
ucnps试纸条重复性和热稳定性：表2可知，ucnps试纸条批内和批间重复性相对较好。通过计算得出批内rsd小于6％，批间rsd变异系数(cv)小于10％。结果表明，ucnps试纸条重复性好。实际应用中，ucnps试纸条应存放在室温或4℃以保持生物分子活性。一般认为，如果试纸条存放在37℃，它的检测能力将更快受到损害因此，将试纸条密封存放于37℃恒温恒湿箱，分别在第0，3，7天取出检测，以第0天的检测值作为对照组组。如表3所示，第3天的检测值的rsd小于10％，而第7天的检测值的rsd平均值约为15％，说明ucnps试纸条热稳定性良好。
ucnps试纸条的特异性：分别配制浓度为270ng/ml的des，hex，dien，bpa，e2标准溶液。用ucnps试纸条检测，重复3次通过计算其竞争抑制率(1-b/b0)判断试纸条的特异性，其中b为阳性时试纸条的t/c值，b0为阴性时试纸条的t0/c0值。取des的结构类似物dine，hex，bpa和功能类似物e2评价试纸条的特异性。在浓度为270ng/ml时，只有des的竞争抑制率为67.7％，其结构类似物和功能类似物的竞争抑制率均小于20％，表明ucnps试纸条具有良好的特异性识别能力。
实际样品检测:牛奶样品购买于当地超市。分别取1ml牛奶置于离心管中，按50，200，800，4000和8000ng/ml水平添加des标准品。每个样品中加入等体积的乙酸乙酯萃取，小心振荡，静置，待样品分层后，收集上清液，用氮气吹干。最后，将残留物溶解在10％甲醇溶液中进行分析。同时用高效液相色谱法进行对比。
加标样品的检测：ucnps试纸条的准确性以及精密度通过加标回收实验进行评价。从表4可知，5个加标水平的平均回收率为90.1％～115.2％，相对标准偏差(rsd)均小于5％，表明ucnps试纸条的精密度及准确性满足快速定量检测des的需求。为了进一步验证ucnps试纸条的可靠性，同时用高效液相色谱法测定加标样品中的des，回收率为96.3％～113.5％，相对标准偏差(rsd)均小于4％。同时，两种方法的测定结果有较好的一致性。
表1四因素三水平正交试验表
表2ucnps免疫层析试纸条的重复性
表3ucnps试纸条的热稳定性实验
表4牛奶中己烯雌酚的加标回收实验
1.一种测定己烯雌酚的方法，其特征在于：
des的检测流程是将不同浓度的样品取100µl滴加到检测卡加样垫上，室温反应15min后，upt-3a免疫分析仪读取试纸条t和c线荧光强度。
2.当样品中没有des时，ucnps探针经nc膜迁移至试纸条t线区域，未结合的ucnps探针与des-bsa结合，t线出现荧光条带；反之，ucnps探针上的des单克隆抗体与des结合，免疫复合物经nc膜进一步迁移至试纸条c线区域与羊抗鼠二抗结合，c线出现荧光条带，t／c的值与des浓度呈负相关；如果c线没有产生荧光条带，说明试纸条无效。
3.根据权利要求1所述的测定己烯雌酚的方法，其特征在于：本试验采用溶剂热法合成上转换纳米颗粒(ucnps)-nayf4：yb，er，进行表面功能化修饰，将其与己烯雌酚(des)单克隆抗体偶联，制备荧光探针，以牛血清白蛋白一己烯雌酚(bsa—des)偶联物和羊抗鼠二抗分别喷涂硝酸纤维膜，形成试纸条检测线(t线)和质控线(c线)，建立了上转换发光免疫层析试纸条快速定量检测。
技术总结