本发明涉及医学分子生物学技术领域，尤其涉及检测转铁蛋白表达量的试剂在制备肠道免疫耐受失衡疾病诊断试剂或试剂盒中的应用。
背景技术：
肠道是接触外界食物抗原、抵抗肠道病原菌和外界抗原感染的第一道防线。肠道中也寄居着大量的肠道菌群。肠道作为人体重要的免疫系统能够高效的识别有害抗原(外界病原菌)和无害抗原(肠道共生菌与食物抗原)，同时，肠道也能够有效的挑战来自肠道微生物代谢的大量的抗原物质(脂多糖、脂磷壁酸和细菌dna等)的刺激并高效的维持肠道免疫耐受的平衡。肠道免疫耐受的失衡会导致严重的炎症性肠病(inflammatoryboweldisease,ibd)的发生。
肠道免疫耐受性树突细胞(cd103 cd11b dc)、调节性t细胞(treg)和调节性b细胞(treg)等炎症抑制性细胞在维持肠道免疫耐受平衡上发挥着至关重要的作用，但是其分子机制仍然不清楚。目前，临床上还没有非常精准有效的检测肠道免疫失衡相关疾病的标志物。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供检测转铁蛋白表达量的试剂在制备肠道免疫耐受失衡疾病诊断试剂或试剂盒中的应用，本发明能够用于精准有效的检测肠道免疫失衡相关疾病。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了检测转铁蛋白表达量的试剂在制备肠道免疫耐受失衡疾病诊断试剂或试剂盒中的应用。
优选的，所述肠道免疫耐受失衡疾病包括溃疡性结肠炎。
本发明提供了一种以转铁蛋白作为标志物的肠道免疫耐受失衡疾病的elisa诊断试剂盒。
优选的，所述试剂盒包括抗人转铁蛋白特异的兔多克隆抗体。
优选的，所述试剂盒还包括：包孔板、包被液、洗涤液、封闭液、抗兔igg二抗、显色底物和终止液。
优选的，所述包被液包括磷酸盐缓冲液；所述洗涤液包括磷酸盐吐温缓冲液；所述封闭液包括牛血浆白蛋白溶液，所述牛血浆白蛋白溶液以磷酸缓冲盐溶液作为溶剂；所述显色底物包括3,3,5,5-四甲基联苯胺溶液；所述终止液包括硫酸水溶液。
本发明的有益效果：本发明提供了检测转铁蛋白表达量的试剂在制备肠道免疫耐受失衡疾病诊断试剂或试剂盒中的应用。本发明根据转铁蛋白浓度的高低来诊断肠道炎症疾病发病的严重程度，实现肠道免疫耐受失衡疾病早期诊断的目的。本发明以转铁蛋白作为肠道免疫耐受失衡标志物特异性和敏感性高，检测方法简单。
附图说明
图1为实施例2中溃疡性结肠炎病人和正常人的抗凝血中转铁蛋白的含量；
图2为实施例2中溃疡性结肠炎病人结肠组织中转铁蛋白浓度的westernblot实验结果；
图3为实施例2中溃疡性结肠炎病人结肠组织中转铁蛋白浓度的统计结果；
图4为实施例3中普通spf小鼠和无菌鼠(gf)的肠组织和肠系膜淋巴结各段(十二指肠(d)、空肠(j)、回肠(i)、盲肠(c1)和结肠(c2))转铁蛋白和肠道免疫耐受重要指标(视黄醛脱氢酶aldh1a2、ccl22、tgf-β1和il-10)的westernblot实验结果；
图5为实施例3中普通spf小鼠和无菌鼠(gf)的肠组织和肠系膜淋巴结各段tf的westernblot统计结果；
图6为实施例3中普通spf小鼠和无菌鼠(gf)的肠组织和肠系膜淋巴结各段aldh1a2的westernblot统计结果；
图7为实施例3中普通spf小鼠和无菌鼠(gf)的肠组织和肠系膜淋巴结各段ccl22的westernblot统计结果；
图8为实施例3中普通spf小鼠和无菌鼠(gf)的肠组织和肠系膜淋巴结各段tgf-β1的westernblot统计结果；
图9为实施例3中普通spf小鼠和无菌鼠(gf)的肠组织和肠系膜淋巴结各段il-10的westernblot统计结果；
图10为实施例4中普通spf小鼠(nc)和喂养复合抗生素(abs)组spf小鼠肠组织和肠系膜淋巴结各段(十二指肠(d)、空肠(j)、回肠(i)、盲肠(c1)和结肠(c2))转铁蛋白和肠道免疫耐受重要指标(视黄醛脱氢酶aldh1a2、ccl22、tgf-β1和il-10)的westernblot实验结果；
图11为实施例4中spf小鼠(nc)和喂养复合抗生素组spf小鼠的肠组织和肠系膜淋巴结各段tf的westernblot统计结果；
图12为实施例4中spf小鼠(nc)和喂养复合抗生素组spf小鼠的肠组织和肠系膜淋巴结各段aldh1a2的westernblot统计结果；
图13为实施例4中spf小鼠(nc)和喂养复合抗生素组spf小鼠的肠组织和肠系膜淋巴结各段ccl22的westernblot统计结果；
图14为实施例4中spf小鼠(nc)和喂养复合抗生素组spf小鼠的肠组织和肠系膜淋巴结各段tgf-β1的westernblot统计结果；
图15为实施例4中spf小鼠(nc)和喂养复合抗生素组spf小鼠的肠组织和肠系膜淋巴结各段il-10的westernblot统计结果；
图16为转铁蛋白敲降(sh)和喂养复合抗生素(abs)对小鼠肠组织(gut)各段(十二指肠(d)、空肠(j)、回肠(i)、盲肠(c1)和结肠(c2))树突细胞(cd103 cd11b 、cd103 cd11b-、cd103-cd11b-和cd103-cd11b )的影响情况；
图17为转铁蛋白敲降(sh)和喂养复合抗生素(abs)对小鼠肠系膜淋巴结(gln)各段(十二指肠(d)、空肠(j)、回肠(i)、盲肠(c1)和结肠(c2))树突细胞(cd103 cd11b 、cd103 cd11b-、cd103-cd11b-和cd103-cd11b )的影响情况；
图18为转铁蛋白敲降(sh)和喂养复合抗生素(abs)对小鼠肠组织(gut)各段对免疫耐受重要指标树突细胞(cd103 cd11b 、cd103 cd11b-、cd103-cd11b-和cd103-cd11b )分化情况统计结果；
图19为转铁蛋白敲降(sh)和喂养复合抗生素(abs)对小鼠肠系膜淋巴结(gln)各段对免疫耐受重要指标树突细胞(cd103 cd11b 、cd103 cd11b-、cd103-cd11b-和cd103-cd11b )分化情况统计结果；
图20为转铁蛋白敲降(sh)和喂养复合抗生素(abs)对小鼠肠组织(gut)各段(十二指肠(d)、空肠(j)、回肠(i)、盲肠(c1)和结肠(c2))的foxp3 rorγt treg和foxp3 treg影响；
图21为转铁蛋白敲降(sh)和喂养复合抗生素(abs)对小鼠肠系膜淋巴结(gln)各段(十二指肠(d)、空肠(j)、回肠(i)、盲肠(c1)和结肠(c2))的foxp3 rorγt treg和foxp3 treg影响；
图22为转铁蛋白敲降(sh)和喂养复合抗生素(abs)对小鼠肠组织(gut)各段的foxp3 rorγt treg的影响统计结果；
图23为转铁蛋白敲降(sh)和喂养复合抗生素(abs)对小鼠肠组织(gut)各段的foxp3 treg的影响统计结果；
图24为转铁蛋白敲降(sh)和喂养复合抗生素(abs)对肠系膜淋巴结(gln)各段的foxp3 rorγt treg的影响统计结果；
图25为转铁蛋白敲降(sh)和喂养复合抗生素(abs)对小鼠肠系膜淋巴结(gln)各段的foxp3 treg的影响统计结果。
具体实施方式
本发明提供了检测转铁蛋白表达量的试剂在制备肠道免疫耐受失衡疾病诊断试剂或试剂盒中的应用；所述肠道免疫耐受失衡疾病优选的包括溃疡性结肠炎；所述转铁蛋白优选为血浆和/或肠道组织中的转铁蛋白。
本发明依据肠道免疫耐受失衡疾病溃疡性结肠炎病人血浆和结肠组织中转铁蛋白含量下调来诊断肠道免疫耐受失衡相关疾病。转铁蛋白浓度的下调和肠道免疫耐受稳态的破坏相关，本发明通过检测病人血浆和肠道中转铁蛋白浓度来作为肠道免疫耐受失衡相关疾病的早期的诊断和监测标记。
本发明提供了一种以转铁蛋白作为标志物的肠道免疫耐受失衡疾病的elisa诊断试剂盒；所述试剂盒优选的包括抗人转铁蛋白特异的兔多克隆抗体。本发明对所述抗人转铁蛋白特异的兔多克隆抗体的制备方法没有特殊限制，采用本领域常规方法即可。
本发明中，所述试剂盒优选的还包括：包孔板、包被液、洗涤液、封闭液、抗兔igg二抗、显色底物和终止液。
本发明中，所述包被液包括磷酸盐缓冲液(pbs缓冲液)，所述磷酸盐缓冲液的ph值优选为9.6，所述磷酸盐缓冲液的溶质包括na2co3和nahco3，所述磷酸盐缓冲液中溶质的浓度优选为0.05m；所述洗涤液包括磷酸盐吐温缓冲液(pbst)，所述磷酸盐吐温缓冲液中吐温的体积百分含量优选为0.5％；所述封闭液包括牛血浆白蛋白溶液，所述牛血浆白蛋白溶液以磷酸缓冲盐溶液作为溶剂，所述牛血浆白蛋白溶液中牛血浆白蛋白的质量百分含量为1％；所述显色底物包括3,3,5,5-四甲基联苯胺溶液(tmb)；所述终止液包括硫酸水溶液，所述硫酸水溶液中硫酸的浓度为2m。
本发明所述试剂盒的使用方法优选的包括以下步骤：
将收集得到的肠道免疫耐受失衡疾病病人的血浆样本或肠道组织用包被液稀释后铺板96孔板，封闭处理后利用抗人转铁蛋白特异的兔多克隆抗体的特异性吸附板孔中转铁蛋白，通过辣根过氧化物酶标记的二抗来进行显色。通过和标准曲线测定样本中转铁蛋白的浓度。根据转铁蛋白浓度的高低来诊断肠道炎症疾病发病的严重程度，实现肠道免疫耐受失衡疾病早期诊断的目的。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
转铁蛋白检测试剂盒。
该测定方法为常规的酶联免疫吸附法(elisa)，检测步骤如下：
1)分别取1μl1000倍稀释后溃疡性结肠炎病人和正常人血浆与99μl固定液(50mm碳酸盐缓冲液，ph9.6)混合后加入96孔板(nunc，丹麦)中，4℃包被过夜。
2)次日，弃去孔内溶液，用0.1m磷酸盐缓冲液(pbs)洗3次后进行封闭处理，之后加入自制的抗人转铁蛋白兔多克隆抗体(10μg/ml)于37℃孵育60min。抗人转铁蛋白多克隆抗体的制备流程为：将500微克人转铁蛋白(sigma)溶解于1ml的弗氏完全佐剂(sigma)并多点皮下注射兔子(雄性，2kg)皮下组织。在第一次免疫后的第14、28和42天分别用同样的方法与兔子皮下组织注射250μg用弗氏不完全佐剂(sigma)溶解的人转铁蛋白。最后通过耳缘静脉取血后用抗体分离试剂盒(amershambiosciences,piscataway,nj,usa)分离纯化抗人转铁蛋白多克隆抗体。
3)洗涤液洗涤未结合的抗体后加入辣根过氧化物酶标记的抗兔igg二抗(kpl，美国)，最后用四甲基联苯胺(tmb)进行显色反应。
4)用一系列按梯度稀释的标准转铁蛋白做标准曲线得到所测定血浆样品中转铁蛋白的浓度。具体操作流程为将购买的人纯品转铁蛋白(sigma)配置成20，10，5，2.5，1.25，0.625，0.3125毫克/毫升的7个标准浓度梯度。
实施例2：
溃疡性结肠炎病人和正常人血浆和结肠组织中转铁蛋白含量的elisa检测。
分别从医院收集20例溃疡性结肠炎病人和正常人的血浆，将血浆和3.8％(质量：体积)柠檬酸钠按照1：9(体积：体积)的比例混合得到抗凝血，按照实施例1的方法检测抗凝血中转铁蛋白的含量。检测结果如图1所示，溃疡性结肠炎病人血浆转铁蛋白的浓度水平呈现明显的降低现象(p<0.01)。tf：转铁蛋白。
正常人和溃疡性结肠炎病人的结肠组织(n＝20)研磨后用实施例1所述的转铁蛋白抗体进行westernblot检测。结果如图2和图3所示，图2为溃疡性结肠炎病人结肠组织中转铁蛋白浓度的westernblot实验结果；图3为溃疡性结肠炎病人结肠组织中转铁蛋白浓度的westernblot的统计结果，该统计结果来自20个病人的5次独立重复的实验结果。**p<0.01；溃疡性结肠炎病人结肠组织中转铁蛋白的水平明显降低(p<0.01)。
实施例3：
为了进一步验证转铁蛋白在维持肠道免疫耐受上的作用，本发明检测了普通spf小鼠和无菌鼠(gf)的肠组织和肠系膜淋巴结各段{十二指肠(d)、空肠(j)、回肠(i)、盲肠(c1)和结肠(c2)}转铁蛋白和肠道免疫耐受重要指标(视黄醛脱氢酶aldh1a2、ccl22、tgf-β1和il-10)的含量。结果为：相对于spf小鼠，无菌鼠肠组织和肠系膜淋巴结中转铁蛋白和肠道肠道免疫耐受重要指标(aldh1a2、ccl22、tgf-β1和il-10)含量都有所下降(图4～图9所示，*p<0.05；**p<0.01)，其中图4为普通spf小鼠和无菌鼠(gf)的肠组织和肠系膜淋巴结各段(十二指肠(d)、空肠(j)、回肠(i)、盲肠(c1)和结肠(c2))转铁蛋白和肠道免疫耐受重要指标(视黄醛脱氢酶aldh1a2、ccl22、tgf-β1和il-10)的westernblot实验结果；图5为普通spf小鼠和无菌鼠(gf)的肠组织和肠系膜淋巴结各段tf的westernblot统计结果；图6为普通spf小鼠和无菌鼠(gf)的肠组织和肠系膜淋巴结各段aldh1a2的westernblot统计结果；图7为普通spf小鼠和无菌鼠(gf)的肠组织和肠系膜淋巴结各段ccl22的westernblot统计结果；图8为普通spf小鼠和无菌鼠(gf)的肠组织和肠系膜淋巴结各段tgf-β1的westernblot统计结果；图9为普通spf小鼠和无菌鼠(gf)的肠组织和肠系膜淋巴结各段il-10的westernblot统计结果。
实施例4：
为了进一步验证转铁蛋白在维持肠道免疫耐受上的作用，本发明检测了spf小鼠(nc)和喂养复合抗生素组spf小鼠(abs，具体操作为配置氨苄(1g/l)、链霉素(1g/l)、甲硝唑(0.5g/ml)和万古霉素(1g/l)水溶液并喂养小鼠三周)肠组织和肠系膜淋巴结各段(十二指肠(d)、空肠(j)、回肠(i)、盲肠(c1)和结肠(c2))转铁蛋白和肠道免疫耐受重要指标(视黄醛脱氢酶aldh1a2、ccl22、tgf-β1和il-10)的含量。结果为：相对于对照组小鼠(nc)，复合抗生素处理组小鼠肠组织和肠系膜淋巴结中转铁蛋白和肠道肠道免疫耐受重要指标(aldh1a2、ccl22、tgf-β1和il-10)含量都有所下降(图10～15所示，*p<0.05；**p<0.01)，其中图10为普通spf小鼠(nc)和喂养复合抗生素(abs)组spf小鼠肠组织和肠系膜淋巴结各段(十二指肠(d)、空肠(j)、回肠(i)、盲肠(c1)和结肠(c2))转铁蛋白和肠道免疫耐受重要指标(视黄醛脱氢酶aldh1a2、ccl22、tgf-β1和il-10)的westernblot实验结果；图11为spf小鼠(nc)和喂养复合抗生素组spf小鼠的肠组织和肠系膜淋巴结各段tf的westernblot统计结果；图12为spf小鼠(nc)和喂养复合抗生素组spf小鼠的肠组织和肠系膜淋巴结各段aldh1a2的westernblot统计结果；图13为spf小鼠(nc)和喂养复合抗生素组spf小鼠的肠组织和肠系膜淋巴结各段ccl22的westernblot统计结果；图14为spf小鼠(nc)和喂养复合抗生素组spf小鼠的肠组织和肠系膜淋巴结各段tgf-β1的westernblot统计结果；图15为spf小鼠(nc)和喂养复合抗生素组spf小鼠的肠组织和肠系膜淋巴结各段il-10的westernblot统计结果。
实施例5：
为了进一步验证转铁蛋白对肠道免疫耐受指标的影响，本发明检测了转铁蛋白敲降(sh)和复合抗生素(abs，构建方法同实施例4)对免疫耐受重要指标树突细胞(cd103 cd11b dc)和调节性t细胞(foxp3 rorγt treg和foxp3 treg)分化的影响，具体分组和给药方式如下：对照组(nc，生理盐水组)、转铁蛋白敲低组(sh)，病毒给药方式尾静脉注射的病毒量为107tu(transducingunits)和喂养复合抗生素组(abs)。
结果为：相对于对照组(生理盐水组)，转铁蛋白敲低组(sh)和复合抗生素处理组树突细胞(cd103 cd11b )和调节性t细胞(foxp3 rorγt treg和foxp3 treg)的分化明显减少(图16～25，p<0.01)。
其中图16为转铁蛋白敲降(sh)对小鼠肠组织(gut)和肠系膜淋巴结(gln)各段(十二指肠(d)、空肠(j)、回肠(i)、盲肠(c1)和结肠(c2))树突细胞(cd103 cd11b 、cd103 cd11b-、cd103-cd11b-和cd103-cd11b )的影响情况；
图17为喂养复合抗生素(abs)对小鼠肠组织(gut)和肠系膜淋巴结(gln)各段(十二指肠(d)、空肠(j)、回肠(i)、盲肠(c1)和结肠(c2))树突细胞(cd103 cd11b 、cd103 cd11b-、cd103-cd11b-和cd103-cd11b )的影响情况；
图18为转铁蛋白敲降(sh)对小鼠肠组织(gut)和肠系膜淋巴结(gln)各段对免疫耐受重要指标树突细胞(cd103 cd11b dc)和调节性t细胞(foxp3 rorγt treg和foxp3 treg)分化情况统计结果；
图19为喂养复合抗生素(abs)对小鼠肠组织(gut)和肠系膜淋巴结(gln)各段对免疫耐受重要指标树突细胞(cd103 cd11b dc)和调节性t细胞(foxp3 rorγt treg和foxp3 treg)分化情况统计结果；
图20为转铁蛋白敲降(sh)对小鼠肠组织(gut)和肠系膜淋巴结(gln)各段(十二指肠(d)、空肠(j)、回肠(i)、盲肠(c1)和结肠(c2))的foxp3 rorγt treg和foxp3 treg影响；
图21为喂养复合抗生素(abs)对小鼠肠组织(gut)和肠系膜淋巴结(gln)各段(十二指肠(d)、空肠(j)、回肠(i)、盲肠(c1)和结肠(c2))的foxp3 rorγt treg和foxp3 treg影响；
图22为转铁蛋白敲降(sh)对小鼠肠组织(gut)各段的foxp3 rorγt treg的影响统计结果；
图23为转铁蛋白敲降(sh)对小鼠肠组织(gut)各段的foxp3 treg的影响统计结果；
图24为喂养复合抗生素(abs)对小鼠肠组织(gut)各段的foxp3 rorγt treg的影响统计结果；
图25为喂养复合抗生素(abs)对小鼠肠组织(gut)各段的foxp3 treg的影响统计结果。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
1.检测转铁蛋白表达量的试剂在制备肠道免疫耐受失衡疾病诊断试剂或试剂盒中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肠道免疫耐受失衡疾病包括溃疡性结肠炎。
3.一种以转铁蛋白作为标志物的肠道免疫耐受失衡疾病的elisa诊断试剂盒。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括抗人转铁蛋白特异的兔多克隆抗体。
5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：包孔板、包被液、洗涤液、封闭液、抗兔igg二抗、显色底物和终止液。
6.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述包被液包括磷酸盐缓冲液；所述洗涤液包括磷酸盐吐温缓冲液；所述封闭液包括牛血浆白蛋白溶液，所述牛血浆白蛋白溶液以磷酸缓冲盐溶液作为溶剂；所述显色底物包括3,3,5,5-四甲基联苯胺溶液；所述终止液包括硫酸水溶液。
技术总结