本发明属于生物医学领域，具体涉及hras蛋白自身抗体及其在制备癌症检测产品中的应用和在癌症检测中的应用。
背景技术：
根据世界卫生组织数据显示，2018年，全球新患癌症人数达1810万人，960万人因癌症死亡，全球发生209万例肺癌新病例，在所有癌症类型中排名第一。根据国家癌症中心2017年的统计数据显示，肺癌的发病率和死亡率在恶性肿瘤中都排第一，在男性中发病率为20.27％位列第一，在女性中发病率为14.94％仅次于乳腺癌(17.07％)；死亡率在男性和女性中都占据第一位，分别为23.89％和17.70％。据预测，2015年至2030年，中国的肺癌死亡率可能会增加约40％。
肺癌在组织学上可分为两大类：小细胞肺癌(sclc)和非小细胞肺癌(nsclc)。nsclc约占诊断出肺癌的79％，包括腺癌，鳞状细胞癌和大细胞癌。目前，针对肺癌的靶向疗法和免疫疗法取得了巨大进步，但外科切除，辅助放疗和/或化疗仍然是早期治疗nsclc患者的首选方法。尽管近年来所有癌症的存活率都有所提高，但肺癌的存活率仍处于较低水平。在2012-2015年，男性肺癌的存活率为16.8％，比存活率最高的甲状腺癌低62.5％，女性的存活率也仅为25.1％。肺癌的低存活率和诊断技术的局限性相关，大多数肺癌患者在诊断时被发现处于晚期，失去了最佳的治疗时机。当前，胸部高分辨率(或小剂量)计算机断层扫描(ldct)是唯一可有效降低肺癌早期死亡率的筛查试验。许多地区建立了ldct免费筛查高危人群的项目。美国曾有一项研究表明，ldct筛查具有较好的肺癌早筛潜力，或许可将肺癌高危人群的死亡率降低20％。但临床转化仍然是问题。ldct的问题还在于较高的假阳性率一定程度上会导致过度诊断。重复暴露于放射线也可能会导致潜在的健康危害。因此，发现用于早期肺癌诊断的非侵入性血清学生物标记物将大大有利于肺癌的干预和预防。采用基于生物标志物的初始筛选后进行ldct或将生物标志物测试与ldct相结合的方法成为了更好的肺癌诊断手段。
人们在100多年前就察觉到了机体的免疫系统对肿瘤可能有防治的作用。肿瘤的生长伴随着一些带有抗原性性质的物质产生。这些物质不再被机体当作“自身”，而是被当作抗原对待。免疫系统会产生抗体去消灭这些抗原。这些抗体叫做自身抗体。自身抗体自上世纪70年代被发现以来，人们已经鉴别出了成百上千种自身抗体。不是所有的肿瘤相关抗原在所有个体都会激发免疫反应，也不是所有的免疫反应都是肿瘤特异性的。肿瘤相关自身抗体检测为癌症检测提供了一种替代方法。这种方法有望通过在癌症患者血清内检测到高表达(相对于健康人和良性肿瘤)的自身抗体来实现。当前在临床中运用得比较多的是肿瘤相关抗原，例如碳水化合物抗原(ca)125，ca19-9，癌胚抗原(cea)和α胎儿蛋白(afp)。这些标志物在血清中的含量是随着肿瘤大小的增长而增高的，所以肿瘤相关抗原在癌症早期的灵敏度和特异性都非常差。自身抗体在肿瘤发生的早期产生，可在出现临床症状之前五年被检测到。在癌症早期，检测出来的肿瘤相关抗原的信号非常弱，但由于自身抗体的浓度远远高于抗原，所以检测自身抗体相当于得到了一个放大的信号。自身抗体在血液循环中的半衰期达到了30天，在体外也比其他的标志物要稳定。自身抗体检测具有经济合算、操作简便等优点。自身抗体检测可以直接在现有的临床检测平台利用存档的血清实现。
hras(ensembl:ensg00000174775mim:190020)由11号染色体上的hras基因编码，在皮肤(rpkm24.4)，大脑(rpkm14.8)和其他25个组织中普遍表达。hras编码的hras蛋白为gtp酶，hras是一种小的g蛋白，属于小gtp酶超家族，当hras与鸟苷三磷酸结合后，会结合raf激酶比如c-raf，再进一步激活mapk/erk通路。这个基因的突变与多种癌症相关，包括膀胱癌，滤泡状甲状腺癌，口腔鳞状细胞癌。专利申请wo/2018/187228公开了血清学标记物对肺癌的早期诊断。目前，虽然已有抗hras自身抗体的研究，但是其敏感度较低，临床应用价值有限。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是克服现有癌症特别是肺癌检测技术的缺陷和不足，提供一种灵敏性高、特异性强的自身抗体在制备癌症检测产品和在癌症检测中的应用。
本发明的一方面提供了自身抗体在制备用于癌症检测的产品中的应用，所述的自身抗体包括hras蛋白自身抗体。
优选的，所述的hras蛋白自身抗体包括igg和/或iga自身抗体。
优选的，所述的癌症包括肺癌、膀胱癌、滤泡状甲状腺癌、口腔鳞状细胞癌。更优选的，所述的癌症是肺癌。
优选的，所述的检测包括将抗原包被在固相载体上。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的抗原为hras蛋白抗原。
具体的，所述的hras蛋白抗原为igg和iga。
优选的，所述的包被包括直接包被和间接包被，其中，直接包被是将抗原直接包被于固相载体上，间接包被是通过生物素与链霉亲和素之间的特异性反应将抗原间接包被于固相载体上。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的包被是间接包被法。
优选的，所述的固相载体包括酶标微孔板、微粒、微球、亲和膜、液相芯片、玻片、试纸条和塑料球。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的固相载体是酶标微孔板。
优选的，所述的检测包括可见光显色法、化学发光法、荧光发光法。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的检测是荧光发光法。
具体的，所述的荧光发光法是酶联免疫吸附法。
优选的，所述的产品包括制备所述的产品使用的试剂，如有标记物的二抗、稀释缓冲液、包被缓冲液、封闭缓冲液、清洗缓冲液、显色底物、终止液。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的有标记物的二抗是抗人iga辣根过氧化物酶标记的二抗和抗人igg辣根过氧化物酶标记的二抗。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的稀释缓冲液是含bsa的pbst。
具体的，所述的稀释缓冲液是含1％bsa的1×pbst。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的包被缓冲液是碳酸盐缓冲液。
具体的，所述的包被缓冲液是0.05m的ph9.6的碳酸盐缓冲液。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的封闭缓冲液是含bsa的pbst。
具体的，所述的封闭缓冲液是含3％bsa的1×pbst。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的洗涤缓冲液是pbst。
具体的，所述的洗涤缓冲液是ph7.4的1×pbst。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的显色底物是四甲基联苯胺。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的终止液是h2so4。
具体的，所述的终止液是2m的h2so4。
优选的，所述的产品用于定性或定量检测待测样品中所述的hras蛋白自身抗体。
优选的，所述的待测样品包括血液、血清、血浆、乳汁、泪液、唾液、汗液、胃肠液、呼吸道分泌液、尿液。更优选的，所述的样品为血液。特别优选的，所述的样品为血清。
本发明的再一方面提供了自身抗体在用于癌症检测中的应用，所述的自身抗体包括hras蛋白自身抗体。
优选的，所述的hras蛋白自身抗体包括igg和/或iga自身抗体。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的hras蛋白自身抗体为igg和iga。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的癌症检测是肺癌检测。
具体的，所述的肺癌检测可以准确的鉴别肺癌患者和健康人。
具体的，所述的肺癌患者和健康人进行了roc曲线分析。
具体的，所述的肺癌患者和健康人中，hrasigg自身抗体roc分析特异性为92.52％，灵敏度为8.91％，hrasiga自身抗体roc分析的特异性为91.59％，灵敏度为20.30％。
本发明提供了hras蛋白自身抗体在制备癌症检测产品和癌症检测中的应用，能够实现癌症的有效检测和辅助诊断，可以较准确地将肺癌患者和健康人鉴别开来；且能以血清作为检测样品，操作简单、成本低、准确性高、无创伤。本发明具备良好的应用前景。
附图说明
图1：肺癌患者与健康对照血清中hrasigg型自身抗体水平对比。
图2：肺癌患者与健康对照血清中hrasiga型自身抗体水平对比。
图3：ⅰ期肺癌患者与健康对照血清中hrasigg自身抗体水平对比。
图4：ⅰ期肺癌患者与健康对照血清中hrasiga自身抗体水平对比。
图5：ⅱ期肺癌患者与健康对照血清中hrasigg自身抗体水平对比。
图6：ⅱ期肺癌患者与健康对照血清中hrasiga自身抗体水平对比。
图7：iii期肺癌患者与健康对照血清中hrasigg自身抗体水平对比。
图8：iii期肺癌患者与健康对照血清中hrasiga自身抗体水平对比。
图9：ⅳ期肺癌患者与健康对照血清中hrasigg自身抗体水平对比。
图10：ⅳ期肺癌患者与健康对照血清中hrasiga自身抗体水平对比。
图11：肺癌患者与健康对照血清中hrasigg型自身抗体roc分析。
图12：肺癌患者与健康对照血清中hrasiga型自身抗体roc分析。
具体实施方式
除非另行定义，文中所用的专业与科学用语与本领域技术人员熟悉的意义相同。如：
本发明所述的hras自身抗体是指hras蛋白自身抗体。
本发明所述的roc曲线是指接受者操作特性曲线。
本发明所述的tmb是指四甲基联苯胺。
本发明所述的bsa是指牛血清白蛋白。
本发明所述的psbt是指磷酸盐吐温缓冲液。
下面结合说明书附图和具体实施例进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限定本发明的范围。下例实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域常规条件或按照制造厂商建议的条件。如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1血清中hras自身抗体在肺癌检测中的应用
1.临床样本
选取肺癌患者202例，健康对照107例，基本信息如下表1：
表1：肺癌患者基本信息表
2.基本原理
酶标孔板上固定有hras蛋白，加血清孵育后，血清中hras自身抗体(主要包括igg、iga型抗体，也有一些其它类型的抗体)会结合上去，清洗去除未结合的抗体和其它蛋白质，再加入抗人iga辣根过氧化物酶标记二抗或者抗人igg辣根过氧化物酶标记二抗孵育后，洗去未结合二抗，加入辣根过氧化物酶底物，待底物显色后，通过酶标仪检测，信号的强弱与hras自身抗体的数量呈正相关。
3.方法
(1)包被hras蛋白：用0.05mph9.6碳酸盐缓冲液将蛋白稀释,在酶标板的反应孔中加入稀释后的蛋白50ng/孔，4℃过夜；
(2)复温：将步骤(1)的酶标板从4℃冰箱取出，置于室温复温半小时，用ph7.4的1×pbst洗涤四次。
(3)封闭：在步骤(2)的酶标中加含3％bsa的1×pbst封闭液,37℃孵育1小时,洗涤两次；
(4)加入血清样本：在步骤(3)的酶标板中加入1:200稀释的血清样品，放置于侧摆摇床12rpm室温孵育2.5h,洗涤四次(血清需提前放置于4℃冻融，稀释后的血清先震荡混匀再加样)；
(5)加酶标抗体：在步骤(4)的酶标板各反应孔中，加入辣根过氧化物酶标记的抗人igg或者抗人iga抗体(4μg/ml)，放置于侧摆摇床12rpm，室温避光孵育1小时，洗涤两次；
(6)加显色底物：在步骤(5)的酶标板各反应孔中加入50μl临时配置的tmb底物溶液；
(7)终止：待步骤(6)的酶标板孔中液体变蓝后，于各反应孔中加入25μl2mh2so4；
(8)上机读数：将步骤(7)的酶标板放在tecanf50酶标仪中测量0d450的读数，并保存数据。
4.实验结果
通过统计学软件分析酶标仪测量得到的数据，并对肺癌组和健康组的hrasigg和iga自身抗体进行了roc曲线分析，结果如下：
由图1可知，肺癌患者血清中的hrasigg型自身抗体的表达水平与健康对照组无统计学差异。
由图2可知，肺癌患者血清中的hrasiga型自身抗体的表达水平和健康对照组有显著统计学差异。
由图3和图4可知，ⅰ期肺癌患者igg型自身抗体和iga型自身抗体水平均与健康人无统计学差异。
由图5可知，ⅱ期肺癌患者中igg型自身抗体水平与健康人无统计学差异；由图6可知，ⅱ期肺癌患者中iga型自身抗体与健康对照有显著统计学差异。
由图7和图8可知，iii期肺癌患者igg型自身抗体和iga型自身抗体水平均与健康人无统计学差异。
由图9可知，ⅳ期肺癌患者iga型自身抗体水平与健康人不存在统计学差异，由图10可知，igg型自身抗体水平在肺癌患者和健康对照中有显著差异。
由图11可知，肺癌组与健康组的hrasigg型自身抗体roc分析特异性为92.52％，灵敏度为8.91％。
由图12可知，在肺癌组与健康组的hrasiga型自身抗体roc分析中，特异性为91.59％，灵敏度为20.30％。
综合以上结果可知，肺癌患者与健康人的血清中hras自身抗体的水平有着明显的差异，通过检测血清中hras自身抗体的水平，能够达到肺癌检测的目的。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节。对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
1.自身抗体在制备用于癌症检测的产品中的应用，其特征在于，所述的自身抗体包括hras蛋白自身抗体，具体的，所述的hras蛋白自身抗体包括igg和/或iga自身抗体。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的癌症包括肺癌、膀胱癌、滤泡状甲状腺癌、口腔鳞状细胞癌，具体的，所述的癌症是肺癌。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的检测包括将抗原包被在固相载体上。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的抗原为hras蛋白抗原，具体的，所述的hras蛋白抗原为igg和iga。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的包被包括直接包被和间接包被，其中，直接包被是将抗原直接包被于固相载体上，间接包被是通过生物素与链霉亲和素之间的特异性反应将抗原间接包被于固相载体上，具体的，所述的包被是间接包被法。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的固相载体包括酶标微孔板、微粒、微球、亲和膜、液相芯片、玻片、试纸条和塑料球，具体的，所述的固相载体是酶标微孔板。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的检测包括可见光显色法、化学发光法、荧光发光法，具体的，所述的检测是荧光发光法。
8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的产品包括制备所述的产品使用的试剂，如有标记物的二抗、稀释缓冲液、包被缓冲液、封闭缓冲液、清洗缓冲液、显色底物、终止液。
9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的产品用于定性或定量检测待测样品中所述的hras蛋白自身抗体，优选的，所述的待测样品包括血液、血清、血浆、乳汁、泪液、唾液、汗液、胃肠液、呼吸道分泌液、尿液，更优选的，所述的样品为血液，特别优选的，所述的样品为血清。
10.自身抗体在用于癌症检测中的应用，其特征在于，所述的自身抗体包括hras蛋白自身抗体。
技术总结