本发明涉及一种用于辅助诊断前列腺增生症的试剂盒。
背景技术：
前列腺增生症(bph)是世界范围内老年男性常见的泌尿系统疾病之一，几乎每个老年男性都会遇到这个问题，只是增生的程度不同。临床治疗前列腺增生症的常见手段有手术、药物治疗等，但手术治疗对于某些患者的风险较大，药物治疗起效缓慢等问题，前列腺增生症的生物分子标靶疗法是未来研究的一个方向之一。
gper(gprotein-coupledestrogenreceptor)是一类七次跨膜的g蛋白偶联受体，被发现在心脏、大脑、胃肠道、卵巢、肝脏以及卵巢等组织。gper是一种属于位于细胞膜上的新型雌激素受体，这和传统的细胞核的经典雌激素受体erα/β不同，gper可以通过一系列的快速途径影响细胞的功能状态。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种用于辅助诊断前列腺增生症的试剂盒，本发明提供了gper在制备辅助诊断前列腺增生症的试剂或试剂盒中的用途。
为实现上述目的，本发明所采取的技术方案：一种用于辅助诊断前列腺增生症的试剂盒，包括与gper结合的一抗，生物素标记的二抗，链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶，显色试剂，磷酸缓冲盐溶液。
优选地，所述一抗为兔源抗gper多克隆抗体。
优选地，所述显色试剂为dab。
优选地，所述试剂盒还包括内源性过氧化物酶阻断剂。
优选地，所述试剂盒还包括动物非免疫血清。
本发明提供了gper在制备辅助诊断前列腺增生症的试剂或试剂盒中的用途。
本发明提供了检测gper的试剂在制备辅助诊断前列腺增生症的试剂盒中的用途。
本发明试剂盒使用方法如下：
1)将临床组织从液氮中取出，将该组织装入包埋盒中保存；
2)用自来水连续冲洗5小时；
3)放入leica自动脱水机中进行组织脱水；
4)进行石蜡包埋组织；
5)将包埋好的石蜡组织块进行连续切片，厚度约为4μm；
6)将切好的片子在60℃的恒温烤箱中放置约2个小时；
7)放入leica自动脱蜡机中进行组织切片脱蜡(包括二甲苯和梯度酒精脱蜡)
8)蒸馏水冲洗一下，将切片置于枸橼酸抗原修复液中(注意过程中液体量足够以免微波炉加热时烧干)进行抗原修复，微波炉加热3min,拿出来凉一下，再加热1min，再拿出来室温冷却一下，再加热1min，冷却至室温；
9)用阻水笔把切片组织圈住，用pbs浸泡；
10)每张切片加50ul过氧化酶阻断溶液，以便灭活组织内源性过氧化物酶，室温孵育15分钟；
11)pbs冲洗或浸泡3×3min；
12)甩去pbs液，每张组织切片加50ul的非免疫性动物血清封闭非特异性结合，室温下孵育10-15分钟；
13)甩干血清，每张切片加200ulpbs稀释好的第一抗体(兔源抗gper多克隆抗体1ul：pbs缓冲液200ul)；
14)置于孵育盒内，4℃恒温下过夜；
15)第二天将过夜的切片进行室温下复温约30min；
16)pbs冲洗或浸泡3×10min；
17)甩去pbs液，每张切片加50ul生物素标记第二抗体，室温下孵育30min；
18)pbs冲洗或浸泡3×10min；
19)甩去pbs液，每张切片加50ul链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液，室温下孵育15min；
20)pbs冲洗或浸泡3×3min；
21)甩去pbs液，每张切片加100ul新鲜配制的二氨基联苯胺(diaminobenzidine,dab)显色液，显微镜下观察，看到黄染之后立即将切片浸入蒸馏水中中止染色；
22)将切片放入leica自动病理机上进行苏木素复染及封片(乙醇、二甲苯)；
23)晾干后放置leica光镜下观察；
24)免疫组织化学检测结果判断结果判定：leica荧光显微镜下，每张切片随机选取五个高倍镜视野观察细胞，细胞浆和(或)细胞核出现棕黄或棕褐色颗粒为阳性细胞，根据阳性细胞染色强度以及阳性细胞在总细胞中所占数量比例判定实验结果。按染色强度评分：无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；然后按阳性细胞率评分：肿瘤细胞内无阳性染色者为0分，阳性细胞率≤10％为1分，11％～50％为2分，51％～75％为3分，＞75％为4分。针对gper评分采用定量的方法，即两者评分相加作为最后的染色评分结果，范围0～7分。
本发明的有益效果在于：本发明研究了gper的表达水平跟前列腺增生症的进展关系，发现gper能作为前列腺增生症患者疾病诊疗的新的参考指标，采用本发明试剂盒的检测方法操作简单、快速，检测灵敏度和特异性高，可达到对选定临床样本进行定性及半定量检测，无需其他特殊仪器，临床样本保存时间长，一般医院实验室或者病理室都可以完成。该试剂盒有望成为前列腺增生症术后疾病辅助诊断的新技术。
具体实施方式
以下通过前列腺增生症患者组织和人正常前列腺组织样本进行gper的多克隆抗体染色试验，并结合临床样本数据来进一步证明本发明对预测前列腺增生症有利效果，证明本发明能有效判断前列腺增生症患者的gper生物诊疗标靶表达状态。
实验步骤：
1)将临床组织从液氮中取出，将该组织装入包埋盒中保存；
2)用自来水连续冲洗5小时；
3)放入leica自动脱水机中进行组织脱水；
4)进行石蜡包埋组织；
5)将包埋好的石蜡组织块进行连续切片，厚度约为4μm；
6)将切好的片子在60℃的恒温烤箱中放置约2个小时；
7)放入leica自动脱蜡机中进行组织切片脱蜡(包括二甲苯和梯度酒精脱蜡)
8)蒸馏水冲洗一下，将切片置于枸橼酸抗原修复液中(注意过程中液体量足够以免微波炉加热时烧干)进行抗原修复，微波炉加热3min,拿出来凉一下，再加热1min，再拿出来室温冷却一下，再加热1min，冷却至室温；
9)用阻水笔把切片组织圈住，用pbs浸泡；
10)每张切片加50ul过氧化酶阻断溶液，以便灭活组织内源性过氧化物酶，室温孵育15分钟；
11)pbs冲洗或浸泡3×3min；
12)甩去pbs液，每张组织切片加50ul的非免疫性动物血清封闭非特异性结合，室温下孵育10-15分钟；
13)甩干血清，每张切片加200ulpbs稀释好的第一抗体(兔源抗gper多克隆抗体1ul：pbs缓冲液200ul)；
14)置于孵育盒内，4℃恒温下过夜；
15)第二天将过夜的切片进行室温下复温约30min；
16)pbs冲洗或浸泡3×10min；
17)甩去pbs液，每张切片加50ul生物素标记第二抗体，室温下孵育30min；
18)pbs冲洗或浸泡3×10min；
19)甩去pbs液，每张切片加50ul链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液，室温下孵育15min；
20)pbs冲洗或浸泡3×3min；
21)甩去pbs液，每张切片加100ul新鲜配制的二氨基联苯胺(diaminobenzidine,dab)显色液，显微镜下观察，看到黄染之后立即将切片浸入蒸馏水中中止染色；
22)将切片放入leica自动病理机上进行苏木素复染及封片(乙醇、二甲苯)；
23)晾干，放置leica光镜下观察；
24)免疫组织化学检测结果判断结果判定：leica荧光显微镜下，每张切片随机选取五个高倍镜视野观察细胞，细胞浆和(或)细胞核出现棕黄或棕褐色颗粒为阳性细胞，根据阳性细胞染色强度以及阳性细胞在总细胞中所占数量比例判定实验结果。按染色强度评分：无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；然后按阳性细胞率评分：肿瘤细胞内无阳性染色者为0分，阳性细胞率≤10％为1分，11％～50％为2分，51％～75％为3分，＞75％为4分。针对gper评分采用定量的方法，即两者评分相加作为最后的染色评分结果，范围0～7分。
结果显示，在10例接受经尿道前列腺电切术的前列腺增生症组织玻片gper的蛋白主要在前列腺细胞膜上着色。而10例正常前列腺组织玻片中gper的蛋白的着色程度远比前者低(p<0.001)。此外我们的细胞实验也证明了，激活gper后前列腺细胞的自噬活动明显减弱，而许多研究表明前列腺增生患者伴随着低自噬活动，拮抗gper的药物有望成为前列腺增生症的新型疗法。
上述临床验证的结果进一步表明：该试剂和试剂盒可以显示作为判断前列腺增生症进展的分子标记物gper的表达水平。运用本发明提供的试剂盒，检测人体前列腺组织gper的表达水平，根据其表达水平可以方便快捷地为临床前列腺增生症患者提供一个新指标，并对疾病未来的生物标靶治疗提供帮助。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
1.一种用于辅助诊断前列腺增生症的试剂盒，其特征在于，包括与gper结合的一抗，生物素标记的二抗，链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶，显色试剂，磷酸缓冲盐溶液。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述一抗为兔源抗gper多克隆抗体。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述显色试剂为dab。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括内源性过氧化物酶阻断剂。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括动物非免疫血清。
6.gper在制备辅助诊断前列腺增生症的试剂或试剂盒中的用途。
7.检测gper的试剂在制备辅助诊断前列腺增生症的试剂盒中的用途。
技术总结