本发明属于化妆品
技术领域：
，具体涉及一种修复皮肤屏障的组合物及其制备方法和应用。
背景技术：
：健康的皮肤可以有效地挽留住水分，从而保持皮肤良好的弹性和光泽的外表。但皮肤受生活环境和自身生理条件的影响，肌肤可能出现敏感、干燥脱皮、油脂分泌过剩、产生色斑、皮肤松弛老化、红血丝等肌肤问题，究其最主要的原因就是肌肤屏障受到损害。肌肤屏障是由角质层和皮脂膜共同构建的一层保护性结构，其既可以缓冲理化刺激、有效抑制细菌滋生、阻隔细菌、病毒、真菌对肌肤的伤害，又可以锁住水分，防止水分蒸发，从而实现保持水分的功能。肌肤屏障受到损害，导致肌肤遭受细菌、病毒、真菌的侵蚀，也会导致肌肤内的水分肆无忌惮的的蒸发，进而使肌肤出现各种问题。目前常用的修复肌肤屏障的手段就是充分补水，但传统化妆品中的水分大部分仅存在于皮肤表层，皮肤表层水分的蒸发速度要远大于吸收速度，能够被肌肤吸收的水分量有限，导致肌肤屏障修复的速度较慢，耗时较长，而且简单的补水对肌肤色素沉积导致的色斑问题并无有效的改善作用。cn102349867a公开了一种补水修复化妆品及其制备方法和应用。该发明化妆品，包括补水修复冻干粉和补水修复基本液。所述冻干粉主要成分有葡萄籽提取物、水解红藻提取物、小分子量透明质酸、水解胶原蛋白、重组人角质细胞生长因子、重组人表皮细胞生长因子、低分子肝素钠。该发明补水修复化妆品可用于日常皮肤护理，具有补充皮肤水分，修复缺水受损细胞，增强皮肤弹性的美容功效。cn110638740a公开了一种具有调节皮肤微生态的组合物及其应用，所述具有调节皮肤微生态的组合物包括二裂酵母发酵产物溶胞物、酵母菌发酵产物滤液、乳酸杆菌/藻提取物发酵产物、淡黑巨海藻提取物和海水。该发明所述具有调节皮肤微生态的组合物可以选择性保护益生菌的同时抑制病原菌，该发明所述具有调节皮肤微生态的组合物应用在化妆品中具有良好的舒缓功效，但修复皮肤屏障的效果较差，能够被肌肤吸收的水分量有限，导致肌肤屏障修复的速度较慢，耗时较长。因此，开发一种能够全面修复皮肤屏障的护肤品是目前研究的重点。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种修复皮肤屏障的组合物及其制备方法和应用。所述修复皮肤屏障的组合物能够强化肌肤屏障，提升肌肤抗敏潜能，改善皮肤微生态，具有保湿、亮白肤色、修复再生、抗衰祛皱、抗氧化防护、抗敏舒缓、提升皮肤免疫力。为达此目的，本发明采用以下技术方案：第一方面，本发明提供了一种修复皮肤屏障的组合物，所述组合物包括海茴香愈伤组织培养物滤液、四氢甲基嘧啶羧酸和水解红藻提取物。本发明中，所述海茴香愈伤组织培养物滤液(crithmummaritimum)由海茴香制得，所述海茴香根部必需吸收海岸间的养分去面对严苛的陆地环境，进而发展出一种独特生命系统，它含有丰富的维他命c与矿物质，能调节皮肤黑色素的失调，恢复皮肤抗氧化的保护能力，促进皮肤伤口愈合，调节表皮层内角质细胞分裂、转移、脱落等功能，改善皮肤外观，增加皮肤美白效果，并能够刺激角质生成，促进表皮新陈代谢，改善皮肤自愈能力，减少自由基的侵袭，改善皮肤老化，还能提高皮肤保湿性能，淡化色素沉着，改善皮肤光泽。本发明中，所述四氢甲基嘧啶羧酸来自于生长在埃及沙漠盐湖的沙漠嗜盐细菌，四氢甲基嘧啶羧酸抑制uva诱导的线粒体基因突变，抑制uva诱导的细胞核dna损伤，保护角化细胞免于uvb伤害，保护朗格汉斯细胞免于uv伤害，抑制uva引起的炎症反应。四氢甲基嘧啶羧酸还能够保护细胞膜对抗表活伤害，增强细胞膜的稳定性，增强角质层屏障功能，降低tewl。此外，其电荷分布促进类冰晶水结构的形成，降低水活度，长效保湿，类冰晶水结构为肌肤保鲜。本发明中，所述水解红藻提取物中的多糖活性物质能与皮肤蛋白结合形成保湿性的凝胶，而且它还可以通过水合作用，在皮肤表面形成保护膜，防止水分蒸发，帮助强化和恢复肌肤保湿状态。同时，水解红藻提取物中的多糖活性物质对皮肤有消炎、抗敏、紧肤的功效。可以促进皮肤组织更新，加快肌肤新陈代谢、促进皮肤细胞修复、充填皮肤基底组织，由里至表抚平皱纹，调肤养肤。本发明中，所述海茴香愈伤组织培养物滤液、四氢甲基嘧啶羧酸和水解红藻提取物相互配合，协同增效，从而全面修复皮肤屏障。通过强化皮肤的微生物屏障、理化屏障和免疫屏障，将有害侵扰因素隔绝在皮肤之外，构筑完整健康的肌肤防御线，从根本上解决各种皮肤问题。此外，所述组合物还具有抗炎舒缓的功效，对于皮肤的炎症反应和不适症状进行快速有效地安抚，维持皮肤的稳态与基础健康。优选地，所述海茴香愈伤组织培养物滤液、四氢甲基嘧啶羧酸和水解红藻提取物的质量比为(3～9):(2～5):(1～3)；其中，“3～9”可以是3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9等；其中，“2～5”可以是2、2.2、2.5、2.8、3、3.2、3.5、3.8、4、4.2、4.5、4.8、5等；其中，“1～3”可以是1、1.2、1.4、1.5、1.6、1.8、2、2.2、2.4、2.6、2.8、3等。优选地，所述海茴香愈伤组织培养物滤液由以下方法制备得到：(1)愈伤组织诱导培养：将海茴香外植体接种到诱导培养基中进行愈伤组织诱导培养，得到愈伤组织；(2)愈伤组织颗粒悬浮培养：将步骤(1)得到的愈伤组织接种到液体培养基中震荡培养，得到增殖愈伤组织；(3)愈伤组织扩大培养：将步骤(2)得到的增殖愈伤组织接种至无菌细胞袋中进行扩大培养，得到所述海茴香愈伤组织培养物；(4)分离：将步骤(3)得到的海茴香愈伤组织培养物过滤、干燥，得到所述茴香愈伤组织培养物滤液。优选地，步骤(1)所述海茴香外植体为经灭菌处理的海茴香外植体。优选地，步骤(1)所述诱导培养基为琼脂培养基。优选地，步骤(1)所述诱导培养的温度为15～30℃，例如可以是15℃、17℃、19℃、21℃、23℃、25℃、27℃、29℃、30℃等，所述诱导培养的时间为12～16天，例如可以是12天、13天、14天、15天、16天等。优选地，步骤(2)所述液体培养基为ms培养基。优选地，步骤(2)所述震荡培养的温度为15～30℃，例如可以是15℃、17℃、19℃、21℃、23℃、25℃、27℃、29℃、30℃等，所述震荡培养的时间为12～16天，例如可以是12天、13天、14天、15天、16天等。优选地，步骤(2)所述震荡培养在振荡培养箱中进行，所述振荡培养箱的转速为50～200r/min，例如可以是50r/min、60r/min、70r/min、80r/min、90r/min、100r/min、120r/min、140r/min、160r/min、180r/min、200r/min。优选地，步骤(3)所述扩大培养的温度为15～30℃，例如可以是15℃、17℃、19℃、21℃、23℃、25℃、27℃、29℃、30℃等，所述扩大培养的时间为20～25天，例如可以是20天、21天、22天、23天、24天、25天等。优选地，步骤(4)所述过滤通过纱布进行过滤。优选地，所述纱布的孔径为80～100目，例如可以是80目、82目、84目、86目、88目、90目、92目、94目、96目、98目、100目。优选地，步骤(4)所述干燥的温度为20～30℃，例如可以是20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃等。优选地，所述海茴香愈伤组织培养物滤液由以下方法制备得到：(1)愈伤组织诱导培养：将海茴香外植体接种到琼脂培养基中进行愈伤组织诱导培养，所述诱导培养的温度为15～30℃，所述诱导培养的时间为12～16天，得到愈伤组织；(2)愈伤组织颗粒悬浮培养：将步骤(1)得到的愈伤组织接种到ms培养基中，在振荡培养箱中以50～200r/min转速进行震荡培养，所述震荡培养的温度为15～30℃，所述震荡培养的时间为12～16天，得到增殖愈伤组织；(3)愈伤组织扩大培养：将步骤(2)得到的增殖愈伤组织接种至无菌细胞袋中进行扩大培养，所述扩大培养的温度为15～30℃，所述扩大培养的时间为20～25天，得到所述海茴香愈伤组织培养物；(4)分离：将步骤(3)得到的海茴香愈伤组织培养物通过80～100目的纱布进行过滤，再在20～30℃下进行干燥，得到所述茴香愈伤组织培养物滤液。优选地，所述四氢甲基嘧啶羧酸由以下方法制备得到：(a)沙漠嗜盐细菌的培养：将沙漠嗜盐细菌接种于液体培养基中培养，得到沙漠嗜盐细菌菌体；(b)渗透压冲击：将步骤(a)得到的沙漠嗜盐细菌菌体重悬于高渗透压溶液中浸泡、过滤，得到沉淀沙漠嗜盐细菌菌体；(c)电渗析：将步骤(b)得到的沙漠嗜盐细菌菌体通过电渗析处理，得到四氢甲基嘧啶羧酸。优选地，步骤(a)所述液体培养基为scdlp液体培养基。优选地，步骤(a)所述培养在振荡培养箱中进行，所述振荡培养箱的转速为800～1000r/min，例如可以是800r/min、820r/min、840r/min、860r/min、880r/min、900r/min、920r/min、940r/min、960r/min、980r/min、1000r/min等。优选地，步骤(a)所述培养的温度为15～30℃，例如可以是15℃、17℃、19℃、21℃、23℃、25℃、27℃、29℃、30℃等，所述培养的时间为45～55h，例如可以是45h、46h、47h、48h、49h、50h、51h、52h、53h、54h、55h等。优选地，步骤(b)所述高渗透压溶液按质量百分比计包括：10～20％(例如可以是10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％等)的蔗糖、0.05～0.2％(例如可以是0.05％、0.06％、0.08％、0.1％、0.12％、0.14％、0.16％、0.18％、0.2％等)的edta，余量为水。优选地，步骤(b)所述浸泡的时间为0.5～2h，例如可以是0.5h、0.6h、0.8h、1h、1.2h、1.4h、1.6h、1.8h、2h等。优选地，所述四氢甲基嘧啶羧酸由以下方法制备得到：(a)沙漠嗜盐细菌的培养：将沙漠嗜盐细菌接种于scdlp液体培养基中，在振荡培养箱中以800～1000r/min的转速进行培养，所述培养的温度为15～30℃，所述培养的时间为45～55h，得到沙漠嗜盐细菌菌体；(b)渗透压冲击：将步骤(a)得到的沙漠嗜盐细菌菌体重悬于高渗透压溶液(所述高渗透压溶液按质量百分比计包括：10～20％的蔗糖、0.05～0.2％的edta，余量为水)中浸泡0.5～2h，过滤，得到沉淀沙漠嗜盐细菌菌体；(c)电渗析：将步骤(b)得到的沙漠嗜盐细菌菌体通过电渗析处理，色谱纯化，得到四氢甲基嘧啶羧酸。优选地，所述水解红藻提取物由以下方法制备得到：(a)提取：向红藻粉中加入溶剂提取，静置取沉淀，得红藻多糖粗料；(b)水解：将步骤(a)得到的红藻多糖粗料加水溶解后加入水解剂，混合搅拌，得到水解红藻提取液；(c)超滤：将步骤(b)得到的水解红藻提取液通过超滤膜处理浓缩脱盐，得到水解红藻提取物。优选地，步骤(a)之前还包括预处理的步骤。优选地，所述预处理的步骤为：将红藻清洗、粉碎过筛，得到红藻粉。优选地，所述过筛的目数为100-200目，例如可以是100目、120目、140目、160目、180目、200目等。优选地，所述红藻的原料为杜尔维利藻、紫菜、石花菜、海人草、串珠藻、珊瑚藻中的任意一种或至少两种的组合，优选为杜尔维利藻。优选地，步骤(a)所述提取的具体步骤为：向红藻粉中加入水进行一次提取得到一次提取液，将一次提取液过滤后浓缩，再加入乙醇水溶液进行二次提取，静置取沉淀，得红藻多糖粗料。优选地，所述水和红藻粉的质量比为(20～30):1，例如可以是20:1、22:1、24:1、26:1、28:1、30:1等。优选地，所述一次提取的温度为60-80℃，例如可以是60℃、62℃、64℃、66℃、68℃、70℃、72℃、74℃、76℃、78℃、80℃等，所述一次提取的时间为8-12h，例如可以是8h、9h、10h、11h、12h等。优选地，所述乙醇水溶液的体积比浓度为70～90％，例如可以是70％、72％、74％、75％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％等。优选地，所述二次提取的温度为50-70℃，例如可以是50℃、52℃、54℃、56℃、58℃、60℃、62℃、64℃、66℃、68℃、70℃等，所述二次提取的时间为5-8h，例如可以是5h、5.5h、6h、6.5h、7h、7.5h、8h等。优选地，步骤(b)所述水解剂为20～40wt％(例如可以是20wt％、25wt％、30wt％、35wt％、40wt％)的过氧化氢水溶液。优选地，步骤(b)所述混合搅拌的时间为1～2h，例如可以是1h、1.2h、1.4h、1.6h、1.8h、2h等，所述混合搅拌的温度为30～60℃，例如可以是30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃等。优选地，步骤(c)所述超滤的时间20-40min，例如可以是20min、22min、24min、26min、28min、30min、32min、34min、36min、38min、40min等，所述超滤的温度30-40℃，例如可以是30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃等。优选地，所述水解红藻提取物由以下方法制备得到：(a)提取：向红藻粉中加入水在60-80℃下进行一次提取，所述一次提取的时间为8-12h，所述水和红藻粉的质量比为(20～30):1，得到一次提取液，将一次提取液过滤后浓缩，再加入体积比浓度为70～90％的乙醇水溶液进行二次提取，静置取沉淀，得红藻多糖粗料；(b)水解：将步骤(a)得到的红藻多糖粗料加水溶解后，加入20～40wt％的过氧化氢水溶液，30～60℃下混合搅拌1～2h，得到水解红藻提取液；(c)超滤：将步骤(b)得到的水解红藻提取液通过超滤膜处理浓缩脱盐，所述超滤的时间20-40min，所述超滤的温度30-40℃，得到水解红藻提取物。第二方面，本发明提供一种如第一方面所述修复皮肤屏障的组合物的制备方法，所述修复皮肤屏障的组合物的制备方法为：将海茴香愈伤组织培养物滤液、四氢甲基嘧啶羧酸和水解红藻提取物混合，得到所述修复皮肤屏障的组合物。优选地，所述混合的温度为20～40℃，例如可以是20℃、22℃、24℃、26℃、28℃、30℃、32℃、34℃、36℃、38℃、40℃等。优选地，所述混合的时间为10～30min，例如可以是10min、12min、14min、16min、18min、20min、22min、24min、26min、28min、30min等。优选地，所述修复皮肤屏障的组合物的制备方法为：将海茴香愈伤组织培养物滤液、四氢甲基嘧啶羧酸和水解红藻提取物在20～40℃下混合10～30min，得到所述修复皮肤屏障的组合物。第三方面，本发明提供一种如第一方面所述的修复皮肤屏障的组合物在护肤品中的应用。相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：(1)本发明所述修复皮肤屏障的组合物包括海茴香愈伤组织培养物滤液、四氢甲基嘧啶羧酸和水解红藻提取物，各组分相互配合，协同增效，通过强化皮肤的微生物屏障、理化屏障和免疫屏障，将有害侵扰因素隔绝在皮肤之外，构筑完整健康的肌肤防御线，从根本上解决各种皮肤问题。(2)本发明所述修复皮肤屏障的组合物还具有抗炎舒缓的功效，对于皮肤的炎症反应和不适症状进行快速有效地安抚，维持皮肤的稳态与基础健康。具体实施方式下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。制备例1本制备例制备一种海茴香愈伤组织培养物，所述海茴香愈伤组织培养物滤液由以下方法制备得到：(1)愈伤组织诱导培养：将海茴香外植体接种到琼脂培养基中进行愈伤组织诱导培养，所述诱导培养的温度为20℃，所述诱导培养的时间为14天，得到愈伤组织；(2)愈伤组织颗粒悬浮培养：将步骤(1)得到的愈伤组织接种到ms培养基中，在振荡培养箱中以100r/min转速进行震荡培养，所述震荡培养的温度为20℃，所述震荡培养的时间为14天，得到增殖愈伤组织；(3)愈伤组织扩大培养：将步骤(2)得到的增殖愈伤组织接种至无菌细胞袋中进行扩大培养，所述扩大培养的温度为25℃，所述扩大培养的时间为24天，得到所述海茴香愈伤组织培养物；(4)分离：将步骤(3)得到的海茴香愈伤组织培养物通过100目的纱布进行过滤，再在25℃下进行真空干燥，得到所述茴香愈伤组织培养物滤液。制备例2本制备例制备四氢甲基嘧啶羧酸，所述四氢甲基嘧啶羧酸由以下方法制备得到：(a)沙漠嗜盐细菌的培养：将沙漠嗜盐细菌接种于scdlp液体培养基中，在振荡培养箱中以1000r/min的转速进行培养，所述培养的温度为20℃，所述培养的时间为48h，得到沙漠嗜盐细菌菌体；(b)渗透压冲击：将步骤(a)得到的沙漠嗜盐细菌菌体重悬于高渗透压溶液(所述高渗透压溶液按质量百分比计包括：18％的蔗糖、0.1％的edta，余量为水)中浸泡1h，过滤，得到沉淀沙漠嗜盐细菌菌体；(c)电渗析：将步骤(b)得到的沙漠嗜盐细菌菌体通过电渗析处理，得到四氢甲基嘧啶羧酸。制备例3本制备例制备一种水解红藻提取物，所述水解红藻提取物的制备方法包括包括以下步骤：(a)提取：将杜尔维利藻清洗，粉碎并过100-200目筛，得到红藻粉；向红藻粉中加入水在70℃下进行一次提取，所述一次提取的时间为10h，所述水和红藻粉的质量比为20:1，得到一次提取液，将一次提取液过滤后浓缩，再加入体积比浓度为80％的乙醇水溶液进行二次提取，静置取沉淀，得红藻多糖粗料；(b)水解：将步骤(a)得到的红藻多糖粗料加水溶解后，加入30wt％的过氧化氢水溶液，50℃下混合搅拌1h，得到水解红藻提取液；(c)超滤：将步骤(b)得到的水解红藻提取液通过超滤膜处理浓缩脱盐，所述超滤的时间30min，所述超滤的温度30℃，得到水解红藻提取物。实施例1本实施例提供一种修复皮肤屏障的组合物，所述组合物包括：海茴香愈伤组织培养物滤液0.5g、四氢甲基嘧啶羧酸0.4g和水解红藻提取物0.3g。所述修复皮肤屏障的组合物的制备方法为：将0.5g海茴香愈伤组织培养物滤液、0.4g四氢甲基嘧啶羧酸和0.3g水解红藻提取物在30℃下混合20min，得到所述修复皮肤屏障的组合物。实施例2本实施例提供一种修复皮肤屏障的组合物，所述组合物包括：海茴香愈伤组织培养物滤液0.8g、四氢甲基嘧啶羧酸0.2g和水解红藻提取物0.2g。所述修复皮肤屏障的组合物的制备方法为：将0.8g海茴香愈伤组织培养物滤液、0.2g四氢甲基嘧啶羧酸和0.2g水解红藻提取物在20℃下混合30min，得到所述修复皮肤屏障的组合物。实施例3本实施例提供一种修复皮肤屏障的组合物，所述组合物包括：海茴香愈伤组织培养物滤液0.6g、四氢甲基嘧啶羧酸0.3g和水解红藻提取物0.3g。所述修复皮肤屏障的组合物的制备方法为：将0.6g海茴香愈伤组织培养物滤液、0.3g四氢甲基嘧啶羧酸和0.3g水解红藻提取物在40℃下混合10min，得到所述修复皮肤屏障的组合物。实施例4本实施例提供一种修复皮肤屏障的组合物，与实施例1的区别在于，所述组合物包括：海茴香愈伤组织培养物滤液0.9g、四氢甲基嘧啶羧酸0.2g和水解红藻提取物0.1g，所述修复皮肤屏障的组合物的制备方法同实施例1。实施例5本实施例提供一种修复皮肤屏障的组合物，与实施例1的区别在于，所述组合物包括：海茴香愈伤组织培养物滤液0.3g、四氢甲基嘧啶羧酸0.5g和水解红藻提取物0.3g，所述修复皮肤屏障的组合物的制备方法同实施例1。实施例6本实施例提供一种修复皮肤屏障的组合物，与实施例1的区别在于，所述组合物包括：海茴香愈伤组织培养物滤液0.1g、四氢甲基嘧啶羧酸0.6g和水解红藻提取物0.5g，所述修复皮肤屏障的组合物的制备方法同实施例1。实施例7本实施例提供一种修复皮肤屏障的组合物，与实施例1的区别在于，所述组合物包括：海茴香愈伤组织培养物滤液0.6g、四氢甲基嘧啶羧酸0.1g和水解红藻提取物0.5g，所述修复皮肤屏障的组合物的制备方法同实施例1。实施例8本实施例提供一种修复皮肤屏障的组合物，与实施例1的区别在于，所述组合物包括：海茴香愈伤组织培养物滤液0.6g、四氢甲基嘧啶羧酸0.55g和水解红藻提取物0.05g，所述修复皮肤屏障的组合物的制备方法同实施例1。对比例1本对比例提供一种修复皮肤屏障的组合物，与实施例1的区别在于，所述组合物不含海茴香愈伤组织培养物滤液，所述四氢甲基嘧啶羧酸含量增至0.65g，所述水解红藻提取物含量增至0.55g，所述修复皮肤屏障的组合物的制备方法同实施例1。对比例2本对比例提供一种修复皮肤屏障的组合物，与实施例1的区别在于，所述组合物不含四氢甲基嘧啶羧酸，所述海茴香愈伤组织培养物滤液含量增至0.7g，所述水解红藻提取物含量增至0.5g，所述修复皮肤屏障的组合物的制备方法同实施例1。对比例3本对比例提供一种修复皮肤屏障的组合物，与实施例1的区别在于，所述组合物不含水解红藻提取物，所述海茴香愈伤组织培养物滤液含量增至0.65g，所述四氢甲基嘧啶羧酸含量增至0.55g，所述修复皮肤屏障的组合物的制备方法同实施例1。试验例1安全性能测试对实施例1～8提供的修复皮肤屏障的组合物和对比例1-3提供的修复皮肤屏障的组合物进行安全性能测试，方法如下：(1)红细胞溶血实验红细胞悬液的制备：选择健康家兔，心脏取血9ml，加入2％的草酸钾溶液1ml，离心，弃去上清液，用20mmol/l的pbs溶液将沉淀物稀释至20ml，4℃保存备用。选择样品用pbs溶液稀释至不同浓度，每个样品设置5个浓度梯度。取10ml待测样品的稀释液，加入200μl上述红细胞悬液(控制样品终浓度分别为5、10、20、50、100mg/ml)，以蒸馏水作为全溶血对照，pbs溶液作为阴性对照，轻轻混匀，37℃下孵育30min，在2000r/min的转速下离心10min，取上清液，用分光光度计测试其在560nm处的吸光度(a560)，按如下公式计算溶血率；绘制溶血率～样品浓度标准曲线，计算50％红细胞发生溶血时的样品浓度(hd50)。(2)蛋白变性实验：将样品用pbs溶液稀释至10g/l，取10ml待测样品的稀释液，加入200μl上述红细胞悬液，以蒸馏水作为空白对照，1mg/ml十二烷基硫酸钠(sds)溶液作为阳性对照，轻轻混匀，37℃下孵育30min，在2000r/min的转速下离心10min，取上清液，用分光光度计分别测试其在540nm和575nm处的吸光度a540和a575，按照如下公式计算蛋白变性指数(di)；其中，r1＝空白对照组a575/空白对照组a540，r2＝实验组a575/实验组a540，r3＝阳性对照组a575/阳性对照组a540。根据l/d值对待测样品的刺激性进行评价，其中l/d值为hd50/di，红细胞溶血实验刺激性分级标准如下表1所示：表1l/d分级>100无刺激性10<l/d≤100微刺激性1<l/d≤10轻度刺激性0.1<l/d≤1中度刺激性上述红细胞溶血实验和蛋白变性实验的测试结果如下表2所示：表2由1～8提供的修复皮肤屏障的组合物和性能测试可知，本发明提供的护肤组合物刺激性分级为无刺激性，说明本发明提供的护肤组合物具有温和无刺激的特点。试验例2保湿性能测试对实施例1～8和对比例1～3提供的修复皮肤屏障的组合物进行保湿性能测试，方法如下：(1)经皮失水变化率：仪器为德国ck公司的tewametertm300，测试外部环境：室温25℃，湿度60％。选取110名皮肤健康的18～40岁的志愿者，男女比例各占一半，随机分成11组，每组5名男性、5名女性，分别使用实施例1～8和对比例1～3提供的修复皮肤屏障的组合物。在使用前皮肤组合物前，以及连续使用4天后，分别测试各位受试者的经皮失水变化率(以使用前为100％计)，每个数据测试三次，取平均值后，计算每组平均值，保留小数点后一位。(2)水分保持率：仪器为德国courage khazakaelectronic型号：dermaunitssc，测试温度25℃，湿度60％。选取110名皮肤健康的18～40岁的志愿者，男女比例各占一半，随机分成11组，每组5名男性、5名女性，分别使用实施例1～8和对比例1～3提供的修复皮肤屏障的组合物。在使用前以及使用4h后分别测试各位受试者的皮肤水分含水量(以使用前为100％计)，每个数据测试三次，取平均值后，计算每组平均值，保留小数点后一位。(3)体外称重法保湿性能测试：称取样品0.2g，分别均匀涂敷在贴有微孔通气胶带的5cm×5cm的玻璃板上，并将玻璃板放入恒温恒湿的干燥器中，分别称量玻璃板放置4h后的质量，计算其保湿率。保湿率计算公式为：保湿率/％＝(m2～m0)/(m1～m0)×100％。其中，m0为玻璃板板质量/g，m1为加样后玻璃板质量/g，m2为干燥器中放置若干小时后玻璃板质量/g。具体测试结果如表3所示：表3样品经皮失水变化率/％水分保持率/％保湿率/％实施例190.8594.9094.90实施例291.5492.1893.30实施例392.4290.3393.42实施例495.2189.2990.13实施例595.5287.6189.30实施例698.5485.7487.90实施例797.9584.9785.27实施例8100.0784.3185.55对比例1128.5379.4075.92对比例2119.4278.9080.12对比例3124.6179.7282.00由上述测试数据可知，本实施例1～8提供的修复皮肤屏障的组合物经皮失水变化率在100％以下，水分保持率在84.31％以上，体外称重法测得的保湿率在85％以上，这充分说明本发明所述修复皮肤屏障的组合物包括海茴香愈伤组织培养物滤液、四氢甲基嘧啶羧酸和水解红藻提取物，各组分相互配合，协同增效与皮肤蛋白结合形成保湿性的凝胶，还可以通过水合作用，在皮肤表面形成保护膜，防止水分蒸发，帮助强化和恢复肌肤保湿状态。促进类冰晶水结构的形成，降低水活度，长效保湿，类冰晶水结构为肌肤保鲜。试验例3抗氧化性能测试(1)对超氧阴离子自由基清除能力评价取0.05mol/lph＝8.2的tris-hcl缓冲溶液4.5ml，于25℃水浴锅中预热30min。再加入1ml试样和0.4ml25mol/l的邻苯三酚溶液，混匀后，于25℃水浴中反应5min，加入8mol/l的hcl1.0ml终止反应。以tris-hcl缓冲溶液作参比，在299nm处测吸光度值。空白对照用1ml试样的溶剂来替代样品。所述超氧阴离子自由基清除率(％)＝[1-(a2/a1)]×100％，式中a1为空白对照的吸光度值；a2为对应样品的吸光度值。(2)对羟自由基的清除能力评价在25ml比色皿中依次加入2mmol/lfeso43ml，1mmol/lh2o23ml，摇匀，接着加入6mmol/l水杨酸3ml，摇匀，于37℃水浴加热15min后取出，测其吸光度；分别加入待测液，摇匀，继续水浴加热15min，取出测其吸光度。所述羟自由基清除率(％)＝[a0-ax-(a0-ax0)]/a0×100％，式中a0为未加样品前反应体系的吸光度值；ax为样品清除羟自由基后体系的吸光度值；ax0为空白对照清除羟自由基后体系的吸光度值。具体测试结果如表4所示：表4样品超氧阴离子自由基清除率/％羟自由基清除率/％实施例194.8894.20实施例295.1295.00实施例394.8693.28实施例493.3192.88实施例591.1292.00实施例692.0091.56实施例791.7492.24实施例892.7991.20对比例180.9085.21对比例282.7582.34对比例384.0385.01由上述测试数据可知，本实施例1～8提供的修复皮肤屏障的组合物超氧阴离子自由基清除率在91％以上，羟自由基清除率在91％以上。这充分说明本发明所述修复皮肤屏障的组合物包括海茴香愈伤组织培养物滤液、四氢甲基嘧啶羧酸和水解红藻提取物，各组分相互配合，协同增效具有很好的清除自由基的功效，恢复皮肤抗氧化的保护能力。试验例4抗过敏性能测试透明质酸酶是过敏反应的参与者，透明质酸酶与炎症、过敏有强相关性，各种肥大细胞释放组胺的药物能调节透明质酸酶活性，抑制透明质酸酶活性作为研究抗过敏作用的指标。因此，采用透明质酸酶体外抑制实验elson-morgan法进行。取0.1ml0.25mmol/lcacl2溶液和0.5ml透明质酸酶液37℃保温培养20min；分别加入中药组合物0.5ml，继续37℃保温培养20min；加入0.5ml透明质酸钠液37℃保温30min，常温放置5min；加入0.1ml0.4mol/lnaoh溶液和0.5ml乙酰丙酮溶液，置于沸水浴中加热15min后立即用冰水进行冷却5min；加入埃尔利希试剂1.0ml并用3.0ml无水乙醇进行稀释，放置20min显色，用分光光度计测定其吸光度值。计算公式：透明质酸酶抑制率(％)＝[((a-b)-(c-d))/a-b]×100％，式中：a代表对照溶液abs值，b代表对照空白溶液abs值，c代表试样溶液abs值，d代表试样空白溶液abs值。具体测试结果如表5所示：表5由上述测试数据可知，本实施例1～8提供的修复皮肤屏障的组合物透明质酸酶抑制率在62％以上，这充分说明本发明所述修复皮肤屏障的组合物包括海茴香愈伤组织培养物滤液、四氢甲基嘧啶羧酸和水解红藻提取物，各组分相互配合，协同增效，具有很好的透明质酸酶抑制率，所述修复皮肤屏障的组合物还具有抗炎舒缓的功效，对于皮肤的炎症反应和不适症状进行快速有效地安抚，维持皮肤的稳态与基础健康。试验例5美白效果测试选择对数生长期的同一代b16黑色素细胞，常规胰酶消化处理后吹打成单细胞悬液细胞计数定量接种于96孔板，24小时后，弃去上清液，分别加入含有10％样品的rpmi1640培养液，在37℃，体积分数5％的co2饱和湿性条件下培养，对照孔加rpmi1640培养液(含水％)，培育三天，中间更换一次培育液；弃去上清液，常规胰酶消化处理后，计数细胞密度，离心得到细胞沉淀，；用pbs冲洗两次，离心弃去上清液，定量加含10％的dmso的1mol/l的naoh液，80℃水浴50min，然后在酶标仪450nm处测定吸光值；黑色素生成抑制率(％)＝(各试验材料的吸光度/对照组的吸光度)×100％。具体测试结果如表6所示：表6由上述测试数据可知，本实施例1～8提供的修复皮肤屏障的组合物黑色素生成抑制率在34％以上，这充分说明本发明所述修复皮肤屏障的组合物包括海茴香愈伤组织培养物滤液、四氢甲基嘧啶羧酸和水解红藻提取物，各组分相互配合，协同增效，具有很好的黑色素生成抑制率，具有美白提亮的功效。试验例6抗衰祛皱功效测试促进弹性蛋白生成实验：将人成纤维细胞按照2×104个/孔的密度接种在96孔板上，加入新鲜培养基在37℃培养箱中培养24h，待细胞贴壁后，更换新的培养基，并分别加入实施例1～8和对比例1～3提供的修复皮肤屏障的组合物(控制样品终浓度为50mg/ml)，以20mmol/l的pbs溶液作为空白对照，然后在37℃培养箱中培养2天。培养结束后，利用细胞裂解液将细胞洗脱下来，并超声破碎。采用biocolor弹性蛋白检测试剂盒对弹性蛋白的含量进行检测：用弹性蛋白沉淀剂处理样本，使弹性蛋白沉淀下来，离心分离，去除上清液，向沉淀中加入染料和反应液，反应形成弹性蛋白-染料复合物，离心分离并用pbs溶液洗涤三次，去除未结合的染料，添加染料释放剂，使弹性蛋白-染料复合物中的染料释放出来，采用分光光度计测定样品在513nm处的吸光度。根据吸光度-染料浓度标准曲线计算弹性蛋白的表达量(实施例和对比例中弹性蛋白表达量是相对于空白组的相对表达量，空白组的表达量计为1)，测试结果见表7。表7样品弹性蛋白表达量实施例17.5实施例27.3实施例37.3实施例46.7实施例56.8实施例66.3实施例76.5实施例86.2对比例13.0对比例23.4对比例32.2由表7的测试结果可以看出，试用实施例1～8提供的修复皮肤屏障的组合物弹性蛋白表达量在6.2以上，而试用对比例1～3提供的修复皮肤屏障的组合物弹性蛋白表达量则要低得多。这充分说明本发明所述修复皮肤屏障的组合物包括海茴香愈伤组织培养物滤液、四氢甲基嘧啶羧酸和水解红藻提取物，各组分相互配合，协同增效，促进了细胞生长，正在修复皮肤屏障，增加皮肤弹性，具有很好的抗衰祛皱功效。试验例7晒后细胞再生效果检测分别测试上述实施例1～8和对比例1～3提供的修复皮肤屏障的组合物的晒后细胞再生效果进行了细胞迁移检测(cellmigrationassay)实验。具体测试方法为：将从atcc购买的皮肤角质细胞hacat在培养皿(dish)培养使其成为95％以上后，用紫外线照射而形成伤口(wound)。对产生上述伤口(wound)的培养皿，用2％fbs(胎牛血清(fetalbovineserum),welgene)进行处理后，用移动距离测定根据时间经过的恢复程度而定量化(空白对照为未施用任何上述组合物，仅靠细胞自身恢复)。移动距离利用显微镜测量培养基，通过toupview程序维持100倍比率，测定相同部位而进行比较，移动距离(恢复距离/nm)越长证细胞愈合明恢复程度越好，细胞再生效果越佳，具体测试结果如表8所示。表8由上述测试数据可知，本实施例1～8提供的修复皮肤屏障的组合物修复经紫外线晒伤后的角质细胞，其恢复距离在610nm以上，而对比例1-3相对于细胞自身的恢复能力来说上升微弱。这充分说明本发明所述修复皮肤屏障的组合物包括海茴香愈伤组织培养物滤液、四氢甲基嘧啶羧酸和水解红藻提取物，各组分相互配合，协同增效，具有很好的修复细胞再生能力。申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的修复皮肤屏障的组合物及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属
技术领域：
的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。当前第1页1 2 3
技术特征：1.一种修复皮肤屏障的组合物，其特征在于，所述组合物包括海茴香愈伤组织培养物滤液、四氢甲基嘧啶羧酸和水解红藻提取物。
2.根据权利要求1所述的修复皮肤屏障的组合物，其特征在于，所述海茴香愈伤组织培养物滤液、四氢甲基嘧啶羧酸和水解红藻提取物的质量比为(3～9):(2～5):(1～3)。
3.根据权利要求1或2所述的修复皮肤屏障的组合物，其特征在于，所述海茴香愈伤组织培养物滤液由以下方法制备得到：
(1)愈伤组织诱导培养：将海茴香外植体接种到诱导培养基中进行愈伤组织诱导培养，得到愈伤组织；
(2)愈伤组织颗粒悬浮培养：将步骤(1)得到的愈伤组织接种到液体培养基中震荡培养，得到增殖愈伤组织；
(3)愈伤组织扩大培养：将步骤(2)得到的增殖愈伤组织接种至无菌细胞袋中进行扩大培养，得到所述海茴香愈伤组织培养物；
(4)分离：将步骤(3)得到的海茴香愈伤组织培养物过滤、干燥，得到所述茴香愈伤组织培养物滤液。
4.根据权利要求3所述的修复皮肤屏障的组合物，其特征在于，步骤(1)所述诱导培养基为琼脂培养基；
优选地，步骤(1)所述诱导培养的温度为15～30℃，所述诱导培养的时间为12～16天；
优选地，步骤(2)所述液体培养基为ms培养基；
优选地，步骤(2)所述震荡培养的温度为15～30℃，所述震荡培养的时间为12～16天；
优选地，步骤(2)所述震荡培养在振荡培养箱中进行，所述振荡培养箱的转速为50～200r/min；
优选地，步骤(3)所述扩大培养的温度为15～30℃，所述扩大培养的时间为20～25天；
优选地，步骤(4)所述过滤通过纱布进行过滤；
优选地，所述纱布的孔径为80～100目；
优选地，步骤(4)所述干燥的温度为20～30℃。
5.根据权利要求1-4中的任一项所述的修复皮肤屏障的组合物，其特征在于，所述四氢甲基嘧啶羧酸由以下方法制备得到：
(a)沙漠嗜盐细菌的培养：将沙漠嗜盐细菌接种于液体培养基中培养，得到沙漠嗜盐细菌菌体；
(b)渗透压冲击：将步骤(a)得到的沙漠嗜盐细菌菌体重悬于高渗透压溶液中浸泡、过滤，得到沉淀沙漠嗜盐细菌菌体；
(c)电渗析：将步骤(b)得到的沙漠嗜盐细菌菌体通过电渗析处理，得到四氢甲基嘧啶羧酸。
6.根据权利要求5所述的修复皮肤屏障的组合物，其特征在于，步骤(a)所述液体培养基为scdlp液体培养基；
优选地，步骤(a)所述培养在振荡培养箱中进行，所述振荡培养箱的转速为800～1000r/min；
优选地，步骤(a)所述培养的温度为15～30℃，所述培养的时间为45～55h；
优选地，步骤(b)所述高渗透压溶液按质量百分比计包括：10～20％的蔗糖、0.05～0.2％的edta，余量为水；
优选地，步骤(b)所述浸泡的时间为0.5～2h。
7.根据权利要求1-6中的任一项所述的修复皮肤屏障的组合物，其特征在于，所述水解红藻提取物由以下方法制备得到：
(a)提取：向红藻粉中加入溶剂提取，静置取沉淀，得红藻多糖粗料；
(b)水解：将步骤(a)得到的红藻多糖粗料加水溶解后加入水解剂，混合搅拌，得到水解红藻提取液；
(c)超滤：将步骤(b)得到的水解红藻提取液通过超滤膜处理浓缩脱盐，得到水解红藻提取物。
8.根据权利要求7所述的修复皮肤屏障的组合物，其特征在于，步骤(a)之前还包括预处理的步骤；
优选地，所述预处理的步骤为：将红藻清洗、粉碎过筛，得到红藻粉；
优选地，所述过筛的目数为100-200目；
优选地，所述红藻的原料为杜尔维利藻、紫菜、石花菜、海人草、串珠藻、珊瑚藻中的任意一种或至少两种的组合，优选为杜尔维利藻；
优选地，步骤(a)所述提取的具体步骤为：向红藻粉中加入水进行一次提取得到一次提取液，将一次提取液过滤后浓缩，再加入乙醇水溶液进行二次提取，静置取沉淀，得红藻多糖粗料；
优选地，所述水和红藻粉的质量比为(20～30):1；
优选地，所述一次提取的温度为60-80℃，所述一次提取的时间为8-12h；
优选地，所述乙醇水溶液的体积比浓度为70～90％；
优选地，所述二次提取的温度为50-70℃，所述二次提取的时间为5-8h；
优选地，步骤(b)所述水解剂为20～40wt％的过氧化氢水溶液；
优选地，步骤(b)所述混合搅拌的时间为1～2h，所述混合搅拌的温度为30～60℃；
优选地，步骤(c)所述超滤的时间20-40min，所述超滤的温度30-40℃。
9.根据权利要求1～8中的任一项所述的修复皮肤屏障的组合物的制备方法，其特征在于，所述修复皮肤屏障的组合物的制备方法包括：将海茴香愈伤组织培养物滤液、四氢甲基嘧啶羧酸和水解红藻提取物混合，得到所述修复皮肤屏障的组合物；
优选地，所述混合的温度为20～40℃；
优选地，所述混合的时间为10～30min。
10.根据权利要求1～8中的任一项所述的修复皮肤屏障的组合物在护肤品中的应用。
技术总结本发明提供一种修复皮肤屏障的组合物及其制备方法和应用。所述组合物包括海茴香愈伤组织培养物滤液、四氢甲基嘧啶羧酸和水解红藻提取物。所述修复皮肤屏障的组合物能够强化肌肤屏障，提升肌肤抗敏潜能，改善皮肤微生态，具有保湿、亮白肤色、修复再生、抗衰祛皱、抗氧化防护、抗敏舒缓、提升皮肤免疫力的功效。
技术研发人员：范玉菡;温伟红;莫霖霭;徐洁琼
受保护的技术使用者：广州一一生物技术有限公司
技术研发日：2020.04.02
技术公布日：2020.06.05
