本发明涉及一种简便的医用自组装可成像丝素蛋白水凝胶的制备方法及其应用，具体涉及一种以天然来源的丝素蛋白和人工合成的聚维酮碘为基础制备的自组装可成像丝素蛋白水凝胶的方法及其在组织再生修复、肿瘤治疗、预防感染、药物缓释等医疗领域的应用，属于生物材料和生物医学领域。
背景技术：
水凝胶具有良好三维立体网络结构，适合于包载转运药物、细胞因子等，由于水凝胶中含有大量的水分，分子链可随意伸展，能够保持较好的流体性质，所以水凝胶可以更容易植入到肿瘤组织内部并且可以在肿瘤内部弥散均匀地分布，被广泛地应用骨肉瘤等肿瘤治疗领域。近年来，生物医学及组织工程领域研究方向将不同的生物材料复合丝素蛋白，制备出新型的生物材料-丝素蛋白水凝胶。丝素蛋白复合水凝胶因其优异的生物相容性、稳定的解缓速度、优良的力学强度等优点引起研究人员的重视，具有广阔的临床应用前景。
丝素蛋白溶液经物理和化学处理后可形成水凝胶，聚乙二醇(peg)是一种有机化合物。将聚乙二醇与丝素蛋白混合可形成丝素蛋白凝胶。它可作为生物因子和药物的缓释体系，此外，丝素蛋白水凝胶可以通过注射器直接注射到特定部位，这一特性允许丝素水凝胶以一种微创的方式通过注射进入体内，然后将药物或生物因子输送到局部病灶。
聚维酮碘(pvp-i)能有效杀灭细菌、病毒、真菌和原生动物。作为广谱抗菌剂，它通常用于皮肤消毒和清洁伤口。pvp-i可释放游离碘单质，对微生物有较强的杀灭作用。同样，碘单质也是一种有效的杀瘤剂，作为一种抗肿瘤治疗手段，在临床上也越来越受欢迎。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是应用简单的操作方法制备出一种可用于治疗肿瘤的自组装可成像丝素蛋白水凝胶。
本发明制备上述目标水凝胶的技术方法如下：将丝素蛋白冻干粉溶解于去离子水中，充分震荡后，制得一定浓度的丝素蛋白水溶液。将pvp-i溶液与丝素蛋白水溶液吸入一侧注射器，peg400溶液与泛影葡胺溶液吸入另一侧注射器，将两个注射器使用双头鲁尔接头对接，通过多次互推溶液形成共混液，所述的共混液经过约37min后凝固形成一种可成像丝素蛋白复合水凝胶。
本发明的发明点在于是：
(1)安全无毒，无明显过敏反应：本复合生物材料中，应用的丝素蛋白是一种生物相容性良好的材料，而医用聚维酮碘是一种临床常用的消毒药剂，广泛的临床应用证实其安全无毒。
(2)促进丝素蛋白形成水凝胶。单纯丝素蛋白溶液自然状态下不易形成水凝胶，加入peg400溶液，可促进丝素蛋白形成水凝胶。
(3)良好的抗肿瘤效果。本发明由于采用聚维酮碘，将聚维酮碘控制在有效浓度比例时，能够使复合水凝胶具有明显的抗肿瘤效果。将复合水凝胶在x光引导下注射入裸鼠皮下骨肉瘤模型内，一段时间后，可以看到肿瘤体积的增长明显减缓，经小动物成像仪检测生物发光的荧光强度也较对照组和单纯凝胶组明显降低。说明自组装可成像丝素蛋白水凝胶实现了抑制肿瘤增长的作用。为了进一步验证自组装水凝胶对骨肉瘤的治疗效果，我们通过免疫组化染色实验观察肿瘤组织中caspase-3和parp蛋白表达水平来评估水凝胶传递的碘在体内是否诱导细胞凋亡。我们发现复合水凝胶处理组肿瘤组织中parp和caspase-3的蛋白表达明显高于对照组和单纯凝胶治疗组。这些结果表明碘可以在体内诱导骨肉瘤组织发生凋亡。
(4)良好的生物安全性。本发明将生物相容性良好的丝素蛋白和临床常用的聚维酮碘复合制备水凝胶。虽然高浓度的聚维酮碘对机体细胞具有一定的损伤效果，但制备复合水凝胶时，控制聚维酮碘浓度，使复合水凝胶释放的有效碘浓度不会对机体造成损伤。在生物安全实验中，为了验证自组装水凝胶的生物安全性及碘对是否对全身系统产生毒性，对心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胰腺、甲状腺等主要器官进行了he染色，分析各个器官经自组装水凝胶治疗后是否发生病理损伤。he染色结果显示，各个主要器官均未出现显著病理改变。说明包载碘的自组装水凝胶不仅能抑制体内肿瘤生长，起到局部治疗骨肉瘤的作用，而且不会引起全身系统毒副作用，具有良好的生物安全性。
(5)持续释放有效碘，缓慢降解。本发明将聚维酮碘与丝素蛋白混合，形成复合水凝胶，使得其能够向周围环境缓慢释放复合的有效碘，且降解时间延长。
本发明的应用前景：由于该水凝胶原料简单，制备方法方便，可大量生产，并且性能优异，故拥有良好的临床应用的潜力。在x光引导下局部注入肿瘤组织内，可起到明显治疗作用。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例共同用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为本发明中的注射器及连接器的结构示意图。
图2a至2c为所制备自组装可成像丝素蛋白水凝胶。图2a为各组分溶液混合后随着时间的增加，溶液变得更加粘稠和不透明；图2b为自组装水凝胶形成时间；图2c为自组装水凝胶形成时间表。
图3为包载碘的丝素蛋白水凝胶碘释放曲线
图4a至4b为自组装丝素蛋白水凝胶ftir和xrd分析。图4a为自组装水凝胶ftir数据；图4b为自组装水凝胶xrd数据。
图5a至5c为自组装丝素蛋白水凝胶的可注射性及机械性能分析，图5a为将水凝胶推出注射器所需要施加的力；图5b为自组装可成像丝素蛋白水凝胶可以通过注射器轻松推出；图5c为水凝胶机械性能分析。
图6a至6c为水凝胶的微观结构。图6a为peg-silk水凝胶；图6b为peg-silk/md水凝胶；图6c为peg-iodine-silk/md水凝胶。图中比例尺为50μm。
图7a至7d为碘可以抑制体内骨肉瘤的生长。图7a为裸鼠体内肿瘤生物荧光表达水平；图7b为注射水凝胶21天后肿瘤外观；图7c为在x线引导下向肿瘤组织内分别注射生理盐水、peg-silk/md水凝天胶和peg-iodine-silk/md水凝胶；图7d为注射水凝胶21天后肿瘤体积大小。
图8a至8c为免疫组织化学染色和全身毒性评估。图8a为肿瘤及主要器官he染色(*为丝水凝胶；
附图标记：1.注射器；2.连接器。
具体实施方式
以下结合附图对本发明实施方式做进一步阐述。
实施例1
以上所述，仅为本发明的具体实施案例，本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术的技术人员在本发明所述的技术规范内，对本发明的修改或替换，都应在本发明的保护范围之内。
将丝素蛋白冻干粉溶解于去离子水中，充分震荡5-10分钟后，制得质量体积比60％的丝素蛋白水溶液，室温保存。
抽取相应溶液：丝素蛋白水溶液与pvp-i溶液吸入一侧注射器，peg400溶液与泛影葡胺(md)溶液吸入另一侧注射器，其中各成分比例为：peg400为40％(w/v)，丝素蛋白为13.5％(w/v)，md为18％(v/v)，pvp-i为19.5％(v/v)，其余用超纯水补足。将两个注射器使用双头鲁尔接头对接，通过快速多次互推溶液约一分钟左右，形成1ml的共混液，采用od值测成胶时间，结果参考图2a至2c，可见共混液经过约38min后凝固形成水凝胶。将所述水凝胶置于一侧的注射器内，缓慢将水凝胶从注射器中取出。在无菌条件下，将水凝胶置于pbs中进行有效碘的缓释量的测定。
水凝胶体外有效碘的释放采用紫外可见分光光度计测量od值来确定，以反映水凝胶中碘的释放情况。首先使用碘单质、无水乙醇和超纯水制备不同浓度的碘溶液，浓度范围为从0到100μm。在37℃下测量od值，计算标准曲线。将各组水凝胶样品(1cm3)(n＝3)浸泡在40ml的超纯水中。分别在0、3、6、9、12、24、48、72、96、120和144h，取各组浸泡水凝胶的溶液加入到96孔板中，每孔200μl。测量结束后将各孔中的液体全部移回相应的各组液体中。计算各组样品od值的平均值，再根据标准曲线计算碘浓度,并绘制碘释放曲线。结果显示，在前12小时内有一次快速释放，在接下来的6天，碘的释放变得缓慢而稳定，在第7天释放达到最高水平29.3μm。释放7天后的累积释放量约为初始碘含量的31.3％。具体实验结果如图所示3。
为了分析残留的peg溶剂、泛影葡胺和pvp-i是否影响凝胶构象转变,采用傅立叶变换红外光谱(ftir)对复合凝胶进行检测。可见peg残留对丝素蛋白结构的影响可以忽略不计，pvp-i和md的存在也不影响丝素蛋白的结构。具体结果参照图4a至4b。
采用x射线衍射(xrd)对水凝胶的结晶度进行测定，可发现xrd分析结果进一步证实了ftir结果，pvp-i和泛影葡胺存在对丝素蛋白结晶度的影响可以忽略不记。具体结果参照图4a至4b。
水凝胶的注射性能是通过测量1ml注射器通过25g针头喷出200μl体积水凝胶时所需要的力来测定，结果显示：自组装可注射水凝胶可以很容易地用注射器推出。peg400、60％丝素蛋白溶液、pvp-i溶液和泛影葡胺溶液(md)混合30-40分钟后，检测到peg-silk水凝胶、peg-silk/md水凝胶和peg-iodine-silk/md水凝胶三种水凝胶所需注射力开始明显增大。注射力在测量结束时(60-70min)达到50n，但仍然可以缓慢增加。采用水凝胶无限制承受压缩应力直至实验样品发生形变来评估其机械性能。结果表明：peg-silk水凝胶、peg-silk/md水凝胶和peg-iodine-silk/md水凝胶三种水凝胶的抗压强度、弹性模量和断裂应变率相似，因为三组水凝胶中丝素和peg的浓度相同。凝胶的这些特性使它更容易被注射，因此也更容易在体外向病灶局部注射。具体实验结果如图5a至5c。
用扫描电镜(sem)观察含13.5％丝素蛋白的水凝胶冻干后的多孔形貌。可见凝胶整体形态为微孔状，微孔形态细长，具有较高的孔隙率和较好的联通性。微孔孔壁菲薄而且孔径从50μm到100μm不等。peg的存在可能改变了冻干过程中丝凝胶的冷冻速率，从而形成了凝胶的孔结构。由于各组水凝胶中丝素蛋白和peg400的浓度相同，所以三组水凝胶的孔径相似。具体实验结果参考图6a至6c。
为了确定碘对体内骨肉瘤的影响，将转染了荧光素酶的mg-63细胞注射入裸鼠腋窝皮下。当肿瘤形成时，在x线引导下，实验组注射两种水凝胶(peg-silk/md水凝胶和peg-iodine-silk/md水凝胶)，对照组注射生理盐水。水凝胶含有泛影葡胺(md)，因此，通过x线可以判断复合丝素蛋白水凝胶的注射量、分布和分散情况。结果显示，注射peg-iodine-silk/md水凝胶组小鼠的肿瘤生长速度明显慢于其他两组小鼠。体内生物发光成像实验中，注射peg-iodine-silk/md水凝胶组小鼠的生物荧光水平明显低于peg-iodine-silk/md水凝胶组和生理盐水组。结果表明，碘对小鼠肿瘤生长有明显的抑制作用。具体实验结果参考图7a至7d。
parp和caspase-3表达水平与肿瘤细胞凋亡有关。通过免疫组织化学染色进一步检测parp和caspase-3在不同处理组肿瘤组织中的表达水平。结果表明，在裸小鼠中，碘处理增加了骨肉瘤中parp和caspase3的表达，促进了凋亡的发生。各组注射后第21天处死小鼠，取各组重要器官，包括心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胰腺和甲状腺。各器官组织进行he染色观察各器官的病理变化，以检测自组装水凝胶全身毒性。在he染色结果中各器官未见明显形态学改变，因此，peg-iodine-silk/md水凝胶无全身毒性，在体内具有良好的生物相容性和生物安全性。此外，peg-iodine-silk/md水凝胶周围出现大量坏死的肿瘤组织。这些结果与免疫组化染色一致。具体实验结果参考图8a至8c。
1.一种可用于治疗肿瘤的自组装可成像丝素蛋白水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将冻干的丝素蛋白粉装入容器中，加去离子水并震荡5-10分钟，制成一定浓度的丝素蛋白水溶液；准备pvp-i溶液、peg400溶液、泛影葡胺溶液，置于室温保存；
将所述的丝素蛋白水溶液与pvp-i溶液吸入一侧注射器，peg400溶液与泛影葡胺溶液吸入另一侧注射器，注射器内溶液的体积不超过注射器体积的一半，再将两个注射器以双头鲁尔接头相连，之后交替互推至充分混合得到共混液，所述共混液静置，经过约37min凝固形成所述自组装可成像丝素蛋白水凝胶。
2.根据权利要求1所述的自组装可成像丝素蛋白水凝胶的制备方法,其特征在于：丝素蛋白溶液质量体积比为60％。
3.根据权利要求1所述的自组装可成像丝素蛋白水凝胶的制备方法，其特征在于：所述冻干的丝素蛋白粉室温条件下完全溶解的时间为10-30分钟。
4.根据权利要求1所述的自组装可成像丝素蛋白水凝胶的制备方法，其特征在于：所述pvp-i溶液碘单质含量为5g/l。
5.根据权利要求1所述的自组装可成像丝素蛋白水凝胶的制备方法，其特征在于：以混合液总体积为1ml为例，混合液中各成分比例为：peg400为40％(w/v)，丝素蛋白为13.5％(w/v)，md为18％(v/v)，pvp-i为19.5％(v/v)，其余用超纯水补足。
6.根据权利要求1至5任一项所述的自组装可成像丝素蛋白水凝胶的制备方法，其特征在于：各种溶液按一定比例分别吸入两个注射器中，快速互推注射器10-20次或40秒以上。
7.根据权利要求1至6所述的自组装可成像丝素蛋白水凝胶的制备方法，其特征在于：将混合液于室温下静置，约38min后自组装，形成复合水凝胶。
8.根据权利要求1至7所述的自组装可成像丝素蛋白水凝胶的制备方法，其特征在于：所述共混液凝固形成丝素蛋白水凝胶的过程中，可将共混液置入一个容器中，还可直接置于一侧的注射器中，去掉另一侧的空注射器和连接器，在x线引导下体内注射或者涂抹填充。
9.一种自组装可成像丝素蛋白水凝胶，其特征在于：其使用权利要求1至8之一的自组装可成像丝素蛋白水凝胶制备方法制得。
10.一种可应用于抗肿瘤治疗、药物缓释医疗领域的自组装可成像丝素蛋白水凝胶，是一种根据权利要求1至9任一项所述的制备方法制得的自组装可成像丝素蛋白水凝胶。
技术总结